專利名稱：野生茄子耐鹽基因StP5CS及其抗除草劑植物表達載體的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及野生茄子耐鹽基因StP5CS及其抗除草劑植物 表達載體。
背景技術：
隨著全球水資源危機和土壤鹽漬化問題的加劇，鹽脅迫已經成為影響作物生長， 導致作物減產的重要因素。我國耕地中有將近1/10是鹽漬化土壤，主要分布在西北、華北 等糧食主產區，鹽漬化能造成植物細胞內水分和離子平衡的破壞，引起氧化脅迫，破壞蛋白 質的功能，導致植物在形態、生理、生化和分子方面的嚴重變化，影響作物的生長和產量。轉 基因技術是解決鹽漬化問題的有效途徑之一，將耐鹽相關基因克隆并轉化作物，使其在作 物中過量表達，將會大幅提高作物的耐鹽能力。Δ ‘ -口比 口各琳一5-幾酸合成醇(Δ ‘ -pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)是高等植物體內脯氨酸合成途徑的一個關鍵酶，該酶具有谷氨酸激 酶(Y -glutamylkinase, y -GK)禾口 Y _ 谷氨酉先磷酸還原酶(Y -glutamyl phosphate reductase, Y -GPR)雙重活性，催化脯氨酸生物合成的前兩步谷氨酸磷酸化及谷氨 酸-Y-半酸還原(參考文獻Hu CAA, Delauney A J, Verma DPS. A bifunctional enzy me (Δ ‘ -pyrroline-5-carboxylate synthetase)catalyzes the first two steps in prolinebiosynthesis in plants. Proc Natl Acad Sci. 1992，89 :9354_9358)。耐鹽基 因P5CS轉化植物提高植物的耐鹽性已有諸多報道Zhu等(1998)將來源于烏頭葉豇豆的 P5CS連接在脅迫誘導啟動子后轉化水稻，脯氨酸在脅迫下超量合成積累，其第二代轉基因 植株在滲透脅迫下表現出的生物量增加明顯高于非轉基因組(參考文獻Zhu BC, Su J， Chang MCiVerma DPSiFan YL,ffU R. Overexpression of a Δ ‘ -pyrroline-5-carboxylate synthetase gene and analysis of tolerance to water-andsalt-stress in transgenic rice. Plant Science. 1998，139 :41_48) ；Aida 等(2005)將擬南芥的 P5CS 由農桿菌介導 轉化馬鈴薯，在IOOmM NaCl培養條件下，轉基因馬鈴薯的脯氨酸積累量高于對照組，轉基 因馬鈴薯對于高鹽脅迫表現出了較高的耐受性(參考文獻Aida H S，Radhia G B，Amira B，Lei L J, Arnould S, Samir J. Overexpression of Δ ' -pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline productionand confers salt tolerance in transgenic potato plants. Plant Science· 2005，169 :746_752)。bar基因最早由吸水鏈霉菌(Str印tomyce hygroscopicus)中分離得 到，其編碼產物膦絲菌素N-乙酰轉移酶能使除草劑Basta、liberty中的有效成分 PPT (phosphinothricin)降解成乙酰化衍生物而失活(參考文獻Thompson CJ, MovvaNR, Tizard R，Crameri R，Davies JE, Lauwereys M，Botterman J. Characterization ofthe herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. EMBO J. 1987，6 2519-2523)。目前，bar基因被廣泛應用于抗除草劑轉基因作物的生產，如大豆(參考文 獻Zhang Z，Xing A，Staswick P，Clemente T.The use of glufosinate as aselectiveagent in Agrobacterium mediated transformation of soybean. Plant CellTissue Organ Culture,1999,56 37-46)> /K M (Toki S, Susumu, Chyuhei M. Expression of a maize ubiquitin gene promoter-bar chimeric gene in transgenic riceplants. Plant Physiol. 2002,100 (3) :1503_1507)、小麥(梁輝，唐順學，張馳.提高小麥基因槍法轉化頻 率的研究.遺傳學報.1999，26 (6) 643-648)等
發明內容
本發明的目的是為解決提高農作物耐鹽性的問題，提供一個新的野生茄子耐鹽基 因 StP5CS。本發明的另一目的是提供該耐鹽基因StP5CS抗除草劑植物表達載體及其構建方 法。所構建的植物表達載體可直接用于農桿菌介導的作物遺傳轉化，創制耐鹽和抗除草劑 新種質，可用于農作物品種改良。本發明的技術問題可通過如下技術方案解決野生茄子耐鹽基因StP5CS (Δ ‘-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因StP5CS)，該基因的 序列為 SEQ ID N0. 1。野生茄子耐鹽基因StP5CS抗除草劑植物表達載體，由本發明所述的野生茄子耐 鹽基因StP5CS與植物表達載體構成。其中，所述的植物表達載體優選通過分別用EcoR Ι/HindIII雙酶切植物表達載體 PCAMBIA3301和全序列合成的T800DNA片段，回收10986bp的pCAMBIA3301大片段和849bp 的T800DNA小片段，連接所述兩個片段得到的中間載體pCAMBIA3301-T800。野生茄子耐鹽基因和抗除草劑基因植物表達載體，其構建方法如下1)野生茄子耐鹽基因StP5CS的克隆以提取的野生茄子幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉錄為cDNA，設計引物擴增 StP5CS基因，以反轉錄的cDNA為模板，進行聚合酶鏈式反應PCR，產物連接到pMD19_T載 體，轉化T0P10感受態細胞，進行序列測定；2)中間載體 pCAMBIA3301-T800 的改造全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、Nos終止子的T800片段SEQ ID N0. 2，其中，啟動子的上游和終止子的下游分別引入了 EcoRI和HindIII酶切位點；EcoRI 和HindIII雙酶切pCAMBIA3301 (含bar基因)和所述的T800片段，回收10986bp的 PCAMBIA3301大片段(含bar基因)和849bp的T800DNA小片段，連接所述兩個片段得到中 間載體pCAMBIA3301-T800 (含bar基因)，產物轉化T0P10感受態細胞，提取質粒，進行酶切 驗證；3)植物表達載體 pCAMBIA3301-T800-StP5CS 的構建設計引物以步驟1)所得野生茄子cDNA為模板，用高保真酶進行PCR反應，在 StP5CS基因的上游和下游分別引入BamH I和Sal I酶切位點，用BamH I和Sal I雙酶 切 PCR 產物和 pCAMBIA3301-T800 質粒，回收質粒 pCAMBIA3301_T800 大片段(11835bp) 和StP5CS小片段(2250bp)，連接所述兩片段，連接產物轉化T0P10感受態細胞，提取 質粒，進行酶切驗證，得到所述的野生茄子耐鹽基因StP5CS抗除草劑植物表達載體 pCAMBIA3301-T800-StP5CS。
有益效果1.本發明提供的野生茄子耐鹽基因StP5CS是一個新的耐鹽基因，該基因可提高農作物耐鹽性。2.本發明將野生茄子Δ'-吡咯啉-5-羧酸合成酶耐鹽基因StP5CS克隆至含 有抗除草劑基因(bar基因)的中間載體pCAMBIA3301-T800中，StP5CS基因在CaMV35S 啟動子的啟動下超量表達，大量合成脯氨酸生物合成關鍵酶，植物體內積累脯氨酸，提 高植物耐鹽性。同時，bar基因的表達產物膦絲菌素N-乙酰轉移酶，能使植物抵抗以 L-Phosphinothricin(膦絲菌素，PPT)為活性成分的除草劑。3.本發明構建的野生茄子耐鹽基因StP5CS抗除草劑植物表達載體為首次報道， 可使轉基因農作物具有抗除草劑和提高耐鹽性雙重功效，可直接用于農桿菌介導農作物遺 傳轉化，創制耐鹽和抗除草劑新種質，對于優良作物新品種的培育及在生產中的廣泛應用，
具有重要意義。
圖lStP5CS瓊脂糖凝膠電泳分析1 =DNAMarker(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0.1Kb)2 :StP5CS ；圖2中間載體pCAMBIA3301-T800質粒雙酶切檢測瓊脂糖凝膠電泳分析1 =DNAMarker(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0.1Kb)2 :pCAMBIA3301-T800/Hind III/EcoR I ；3 :pCAMBIA3301-T800圖3植物表達載體pCAMBIA3301-T800-StP5CS質粒雙酶切檢測瓊脂糖凝膠電泳分 析1 =DNAMarker(15Kb/10Kb/7. 5Kb/5Kb/2. 5Kb/lKb/0. 25Kb)2,3 :pCAMBIA3301-T800-StP5CS/BamH I/Sal I ；圖 4 植物表達載體 pCAMBIA3301-T800-StP5CS 圖譜
具體實施例方式實施例1. StP5CS的克隆選用野生茄子(Solanum torvum Swartz) iTorvum Vigor，(為日本砧木品種，購 自日本Takii種苗株式會社)作為材料，幼苗期(4-5片真葉)用IOOmmol -L^NaCl連續脅 迫處理5天，取幼嫩葉片，參照TaKaRa公司總RNA提取試劑盒說明書方法，提取葉片總RNA， 按照東洋紡(上海)生物技術有限公司cDNA合成試劑盒ReverTraAce-a- 說明取2 μ g總 RNA反轉錄成cDNA，用RNase消化cDNA產物，參照番茄耐鹽基因P5CS序列信息(NCBI登錄 號TO0267)，經01igo6. 0軟件分析設計引物擴增StP5CS ；上游引物ZHPs:SEQ ID NO. 3，下游引物ZHPa SEQ ID N0. 4，以提取的葉片cDNA 為模板，進行PCR反應50μ L反應體系10XRCR Buffer 5. 0 μ L，ZHPs、ZHPa引物各 L0yL(20ymol ddNTP mix 4· 0 μ L(2. 5mmol 噸-1)，Taq DNAPolymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板1 μ L，ddH20 37. 8 μ L ；反應程序95°C預變性4min，然后94°C解鏈30sec,52. 7°C退火30sec，72°C延伸2min 30sec，反應30個循環，72°C延伸IOmin ；PCR產物用凝膠回收試劑盒 (AXYGEN)回收純化后瓊脂糖凝膠電泳分析(圖譜見圖1)，用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接到 PMD19-T載體(TaKaRa)，轉化TOPlO感受態細胞(南京天為生物技術有限公司)，進行序列 測定，序列為SEQ ID NO. 1。
實施例2植物雙價表達載體pCAMBIA3301-T800_StP5CS的構建1)中間載體 pCAMBIAMOl-TOOO 的改造全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、Nos終止子的T800片段(見SEQ ID NO. 2)，在兩端分別引入EcoRI (Promega)和HindIII (Promega)酶切位點(北京鼎國昌 盛生物科技有限公司)；EcoRI (Promega)和HindIII (Promega)雙酶切pCAMBIA3301 (澳大 利亞國際農業分子生物學應用中心)和T800片段，酶切產物按1 4的比例用T4DNA連接 酶(TaKaRa)連接，產物轉化TOPlO感受態細胞(南京天為生物技術有限公司)，提取質粒， 酶切驗證(圖譜見圖2)①全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、Nos終止子的T800片段(見 SEQ ID NO. 2)，在兩端分別引入 EcoRI (Promega)和 HindIII (Promega)酶切位點(北 京鼎國昌盛生物科技有限公司)；取質粒載體PCAMBIA3301和T800片段各15 μ L，分別 用 EcoRI (Promega)和 HindIII (Promega)雙酶切，50 μ L 酶切體系10XBuffer E 5 μ L, BSAO. 5yL，質粒 pCAMBIA3301 或 Τ800 15 μ L, EcoR I 1· 25 μ L，Hind III 1. 25 μ L, ddH20 27 μ L ；37°C酶切反應3h，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN) 回收質粒PCAMBIA3301大片段和T800小片段。②回收質粒pCAMBIA3301大片段(10986bp)和T800小片段(849bp)，按照1 4 的比例用 T4DNA 酶(TaKaRa)連接，連接反應體系(25 μ L) =IOXT4IigaseBuffer 2. 5 μ L， PCAMBIA3301 大片段 2μ L，T800 小片段 8 μ L，T4DNA 連接酶 1 μ L，ddH20 11. 5μ L ；16°C 過夜 反應，取10 μ L連接產物轉化TOPlO感受態細胞，涂板37°C過夜培養；挑取單克隆擴大培養 后，提取質粒，進行酶切驗證；PCAMBIA3301-T800中間載體改造完成；2.)植物表達載體 pCAMBIA3301-T800-StP5CS 的構建設計引物進行PCR反應，在目的基因StP5CS的上游和下游分別引入酶切位點BamH I 和 SmlI，BamH I (Promega)和 Sal I (Promega)雙酶切 pCAMBIA3301_T800 中間載體和 PCR 產物，回收PCAMBIA3301-T800大片段和StP5CS小片段，按1 4的比例用T4DNA連接酶 (TaKaRa)連接，產物轉化TOPlO感受態細胞(南京天為生物技術有限公司)，提取質粒，進 行雙酶切驗證(圖譜見圖3)①以野生茄子葉片cDNA作為模板，用高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase, TaKaRa)進行 PCR 反應，50 μ L 反應體系10 X RCR Buffer 5. O μ L, ZHPMBs2 (SEQ ID NO. 5)、 ZHPMSa2 (SEQ ID NO. 6)弓|物各 1. O μ L(20 μ mol · L-1)，dNTP mix 4. O μ L(2. 5mmol · L-1)， PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0. 4 μ L，cDNA 模板 1 μ L, ddH20 37. 6 μ L ；反應程序:95V 預變性4min，然后98°C解鏈IOsec，68°C延伸2min 30sec,反應30個循環，72°C延伸IOmin。 PCR產物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收，進行序列測定；②取改造好的質粒載體pCAMBIA3301-T80015 μ L和第①步所得到的StP5CS用 BamH I (Promega)禾口 Sal I (Promega)雙酶切，雙酶切體系(50 μ L) 10 X Buffer E 5 μ L, BSA 0. 5 μ L，質粒 pCAMBIA3301-T800 或 StP5CS 15 μ L, BamHI 1. 25 μ L, Sail 1. 25 μ L,ddH20 28. 25 μ L ；37°C反應3h ；雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收質粒pCAMBIA3301-T800大片段和StP5CS小片段；③回收的質粒pCAMBIA3301-T800大片段和StP5CS小片段，按照1 4的比例， 用 T4DNA 連接酶(TaKaRa)連接，連接反應體系(25 μ L) =IOXT4IigaseBuffer 2. 5 μ L， PCAMBIA3301-T800 大片段 2 μ L, StP5CS 小片段 8 μ L, T4DNA 連接酶 1 μ L, ddH20 11. 5 μ L ； 16°C過夜連接反應，取10 μ L連接產物轉化T0P10感受態細胞。37°C過夜培養，挑取單克隆 擴大培養，提取質粒，進行酶切驗證。植物表達載體pCAMBIA3301-T800-StP5CS(圖譜見圖 4)的構建成功。綜上所述，本發明構建了含有耐鹽基因和抗除草劑基因的植物表達載體 pCAMBIA3301-T800-StP5CS，其中StP5CS首次報道。所構建的載體可導入大豆及其他作物 中，提高作物的耐鹽性。
權利要求
野生茄子耐鹽基因StP5CS，其特征在于該基因的序列為SEQ ID NO.1。
2.野生茄子耐鹽基因StP5CS抗除草劑植物表達載體，其特征在于由權利要求1所述的 野生茄子耐鹽基因StP5CS與植物表達載體構成。
3.根據權利要求2所述的野生茄子耐鹽基因StP5CS抗除草劑植物表達載體，其特征在 于所述的植物表達載體是通過分別用EcoR I/Hind III雙酶切植物表達載體pCAMBIA3301 和全序列合成的T800 DNA片段，回收10986bp的pCAMBIA3301大片段和849bp的T800 DNA 小片段，連接所述兩個片段得到的中間載體PCAMBIA3301-T800。
4.權利要求3所述的野生茄子耐鹽基因StP5CS抗除草劑植物表達載體的構建方法，其 特征在于包括如下步驟1)野生茄子耐鹽基因StP5CS的克隆以提取的野生茄子幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉錄為cDNA，設計引物擴增StP5CS 基因，以反轉錄的cDNA為模板，進行聚合酶鏈式反應PCR，產物連接到pMD19-T載體，轉化 TOPlO感受態細胞，進行序列測定；2)中間載體pCAMBIA3301-T800的改造全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、Nos終止子的T800片段SEQ ID NO. 2， 其中，啟動子的上游和終止子的下游分別引入了 EcoRI和HindIII酶切位點；EcoRI和 HindIII雙酶切pCAMBIA3301和所述的T800片段，回收10986bp的pCAMBIA3301大片段和 849bp的T800DNA小片段，連接所述兩個片段得到中間載體pCAMBIA3301_T800，產物轉化 TOPlO感受態細胞，提取質粒，進行酶切驗證；3)植物表達載體pCAMBIA3301-T800-StP5CS的構建設計引物以步驟1)所得野生茄子cDNA為模板，用高保真酶進行PCR反應，在 StP5CS基因的上游和下游分別引入BamH I和Sal I酶切位點，用BamHI和Sal I雙酶 切 PCR 產物和 pCAMBIA3301-T800 質粒，回收 11835bp 的質粒 pCAMBIA3301-T800 大片 段和2250bp的StP5CS小片段，連接所述兩片段，連接產物轉化TOPlO感受態細胞，提 取質粒，進行酶切驗證，得到所述的野生茄子耐鹽基因StP5CS抗除草劑植物表達載體 pCAMBIA3301-T800-StP5CS。
全文摘要
本發明屬于分子生物學領域，公開了野生茄子耐鹽基因StP5CS及其抗除草劑植物表達載體。本發明所提供的野生茄子耐鹽基因StP5CS序列為SEQ ID NO.1。其抗除草劑植物表達載體由所述的野生茄子耐鹽基因StP5CS插入到中間載體pCAMBIA3301-T800的BamH I和Sal I位點得到的。本發明StP5CS基因將該植物表達載體用于農作物遺傳轉化，StP5CS基因在CaMV35S啟動子的啟動下超量表達，大量合成脯氨酸生物合成關鍵酶，植物體內積累脯氨酸，提高植物耐鹽性。同時，bar基因的表達產物膦絲菌素N-乙酰轉移酶，能使植物抵抗以L-Phosphinothricin(膦絲菌素，PPT)為活性成分的除草劑。
文檔編號C12N15/66GK101962649SQ201010522878
公開日2011年2月2日 申請日期2010年10月28日 優先權日2010年10月28日
發明者張功臣, 朱月林, 楊立飛, 蓋鈞鎰 申請人:南京農業大學