專利名稱：纖維素酶穩定助劑組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種纖維素酶，具體涉及一種纖維素酶穩定助劑組合物。
背景技術：
內切型纖維素酶(Endoglucanase)是纖維素酶系中重要組分，在纖維素水解 中起著重要作用，它和纖維二糖水解酶(Cellobihydrolase)和β-葡萄糖苷酶(β ， 4-Glucosidase) 一起協同作用將纖維素水解成葡萄糖，因此，內切型纖維素酶在木質纖維 生物煉制，食品工業，紡織工業及造紙工業中均有廣泛的應用。從我國草菇(Volvariella volvacea) 中克隆到一種新的中性內切型纖維素酶的基因(egl ) (Genbank No. AF329732)，與一般的真菌纖維素酶不同，該酶在中性pH環境中具有最高活性和較強的熱 穩定性，有望成為理想的紡織及造紙工業用纖維素酶。在酶制劑工業化應用過程中，酶不可避免需要在一定條件進行長時間的運輸和儲 存這樣一個流通環節。作為一種生物催化劑，特別是在常溫條件下，液體酶的活性在長時間 的運輸和儲存過程中極易受到環境因素變化以及微生物污染的影響。細小的環境因素如溫 度，壓力，PH及離子強度的變化可能引起使用酶蛋白的變性失活，同時對微生物來說，酶液 也是一種十分豐富的營養液，在常溫條件下極易導致微生物的生長，引起酶蛋白的生物降 解失活。因此，如何盡可能地保持酶在運輸、儲存過程中的穩定性是任何一種酶制劑能否最 終在相關領域中獲得工業化應用的首要前提。提高酶的穩定性，目前常用的方法有(1)自然篩選或蛋白質工程手段獲的高穩 定性的酶蛋白；(2)化學修飾和固定化處理；(3)添加保護劑。添加保護劑具有方法簡單、成 本低下和易于操作等多方面原因，是目前工業上提高酶穩定性的最重要手段之一。從目前 國內外研究報道看，添加鹽類，糖類，多元醇，以及其它無機有機化合物對提高酶的穩定性 都有非常理想的效果，但是添加劑的選擇取決于酶的自身特性，這些研究還處于起始階段， 距離工業化生產尚有一段距離。
發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種纖維素酶穩定 助劑組合物，以使添加了該添加劑的纖維素酶其具長時間的運輸和存儲后仍具有較好的酶 活力。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
一種纖維素酶穩定助劑組合物，包括以下各組分2 4g/100mL增稠劑、0. 05 0. 15mL/IOOmL表面活性劑、4 6g/100mL糖類和0. 2 0. 4g/100mL防腐劑；其中，糖類為 葡萄糖、蔗糖或乳糖，表面活性劑為AEO系列的表面活性劑，增稠劑為明膠或山梨醇，防腐 劑為山梨酸鉀、苯甲酸鈉或疊氮化鈉。所述的糖類，優選為乳糖。所述的增稠劑，優選為明膠。
所述的表面活性劑，優選為AEO4。所述的防腐劑，優選為疊氮化鈉。所述的纖維素酶穩定助劑組合物，優選包括以下各組分4g/100mL明膠、 0. ImL/IOOmL AEO4,4g/IOOmL 乳糖和 0. 4g/100mL 疊氮化鈉。制備上述的纖維素酶穩定助劑組合物的方法，按各組份的添加濃度取各組分，充 分混合制得纖維素酶穩定助劑組合物。上述的纖維素酶穩定助劑組合物在用于增強重組中性纖維素酶穩定性中的應用。有益效果本發明的纖維素酶穩定助劑組合物，組分簡單，制備方便，在重組中性 纖維素酶穩定性中應用，25°C下儲存60d后，最高可使纖維素酶活保留率由47. 5 %提高到 95 %，且能較好的抑制微生物的生長。
圖1是具體實施方式
中各實施例具體參數和試驗結果表。圖2是纖維素酶液的SDS-PAGE電泳圖。其中，1泳道為原始纖維素酶液，2泳道為 25°C，添加添加劑保存60天后的纖維素酶液。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步的解釋。以下實施例所使用的材料如下
重組中性內切型纖維素酶由工程菌AZ^1Stori1S菌株S115MEGlMut+高密度發酵獲得， 在4°C條件下，5000r/min離心IOmin后，-80 °C條件下保存備用。CMC-Na，美國Sigma公 司；其他所用試劑均為國產分析純試劑。實施例廣9
一種纖維素酶穩定助劑組合物，包括以下各組分明膠、AEO4、乳糖和疊氮化鈉；按各組 份的添加濃度取各組分，充分混合制得纖維素酶穩定助劑組合物。上述的纖維素酶穩定助劑組合物在用于增強重組中性纖維素酶穩定性中的應用。 將添加劑組合物加入重組中性纖維素酶，混合均勻，在40°C下保溫63h加速試驗后，測定殘 余酶活性，進一步在25°C條件下進行長時間儲存驗證，60d后測定殘余酶活性。各實施例具 體參數和試驗結果見圖1。圖1中，R稱為極差，數值大反映該因素的影響較大，助劑添加 量對酶穩定性的影響順序為疊氮化鈉> 明膠>ΑΕ04>乳糖。此表數據為40°C下保溫63h 的數據，最適配方條件下做了驗證(25°C，60d)。酶活保留率=儲存后酶活性/儲存前酶活 性 X100%ο經檢測，60d后，酶活保留率為95%，細菌和真菌的數量分別為1.4X109和3. 7 X IO8,經SDS-PAGE檢測，60d后的目的蛋白條帶與保存前沒有太大區別，如圖2所示，說明 60d后酶蛋白降解很少。實施例10
內切型纖維素酶活是以CMC-Na為底物，用Somogyi - Nelson方法進行測定，具體過 程按Ding et al方法進行，在1. 5mL總反應體系中含有1. 0mLpH7. 5的KH2PO4-K2HPO4緩 沖溶液、0. 4mL2%CMC和0. ImL經適當后稀釋纖維素酶液，50°C水浴反應30min，加入0. 5mLSomogyi試劑煮沸15min，冷卻到室溫，加入0. 5mLNelson試劑，靜置20min，10000r/min 離心IOmin后，520nm下測上清液的吸光值，酶活定義為每分鐘產生1 μ mol葡萄糖的酶量為 1單位(IU)的酶活。(空白為0. ImL的蒸餾水替換0. ImL纖維素酶的反應樣)。SDS-PA GE按Laemmli方法進行，一定量的儲存前后得酶液用樣品緩沖液(0. 06M Tris ；25% (ν/ν)甘油；2% (w/v) SDS ；0. l%(w/v)溴酚藍；1%(ν/ν) β -巰基乙醇)于 100°C 處理IOmin變性，濃縮膠濃度3. 75%，分離膠濃度7. 5%。考馬斯亮藍R250染色。細菌和真菌的數量的測定方法將保存0d、30d、60d的纖維素酶與無菌水按100 倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍的梯度稀釋，取0. 1 mL的稀釋液涂LB板37 ！下培養細 菌，涂PDA板28 °C下培養真菌，隔夜培養后觀察菌落并計數。
權利要求
一種纖維素酶穩定助劑組合物，其特征在于，包括以下各組分2～4g/100mL增稠劑、0.05～0.15mL/100mL表面活性劑、4～6g/100mL糖類和0.2～0.4g/100mL防腐劑；其中，糖類為乳糖，表面活性劑為AEO4，增稠劑為明膠，防腐劑為疊氮化鈉。
2.根據權利要求1所述的纖維素酶穩定助劑組合物，其特征在于，包括以下各組分 4g/100mL 明膠、0. ImL/IOOmL AEO4,4g/IOOmL 乳糖和 0. 4g/100mL 疊氮化鈉。
3.一種制備權利要求1所述的纖維素酶穩定助劑組合物的方法，其特征在于按各組 份的添加濃度取各組分，充分混合制得纖維素酶穩定助劑組合物。
4.權利要求1所述的纖維素酶穩定助劑組合物在用于增強重組中性纖維素酶穩定性 中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種纖維素酶穩定助劑組合物。該纖維素酶穩定助劑組合物包括以下各組分2～4g/100mL增稠劑、0.05～0.15mL/100mL表面活性劑、4～6g/100mL糖類和0.2～0.4g/100mL防腐劑；其中，糖類為乳糖，表面活性劑為AEO4，增稠劑為明膠，防腐劑為疊氮化鈉。本發明的纖維素酶穩定助劑組合物，組分簡單，制備方便，在重組中性纖維素酶穩定性中應用，25℃下儲存60d后，最高可使纖維素酶活保留率由47.5%提高到95%，且能較好的抑制微生物的生長。
文檔編號C12N9/96GK101967470SQ20101053796
公開日2011年2月9日 申請日期2010年11月10日 優先權日2010年11月10日
發明者丁少軍, 劉鐵 申請人:南京林業大學