專利名稱：一種鑒別建鯉的分子標記方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒別建鯉的分子標記方法。
背景技術：
目前在鯉生產中種質混雜現象比較嚴重，如何從混雜的種質中鑒別、分離種質成 為一個迫不及待的問題。建鯉是我國養殖鯉中比較廣泛的魚類，但是其種質混雜現象比較 嚴重，包括苗種場、養殖場等諸多環節。若要從現有情況中進行品種的鑒定和分離，將有助 于解決種質混雜現象、混雜品種多、混雜品種退化等問題，因此，從較為簡單的2品種混雜 著手，尋找種質鑒別、分離的方法稱為解決種質混雜問題的一條有效途徑。
發明內容
本發明的目的是提供一種鑒別建鯉的分子標記方法，有助于解決鯉種質混雜現 象、混雜品種多、混雜品種退化等問題，可從混雜的鯉種質中鑒別、分離種質；操作簡單，易 于掌握，準確性高。本發明的目的是通過以下技術方案來實現 一種鑒別建鯉的分子標記方法，包括以下步驟
1)選擇建鯉自交Fl代、黃河鯉父本和建鯉母本的雜交Fl代混合群體為研究對象，隨機 選擇48尾，分別采樣血液，采用DNA提取法分別提取DNA樣本；
2)采用IGF2a基因內含子2進行PCR擴增，模板為通過步驟1)所提取的混合群體的 DNA樣本；
在進行PCR擴增時，PCR反應體系為25uL，包括IOXbuffer 15uL, Mg2+ (25m mol/ L) IuL, dNTPs (各 2mmol/L) luL，上下游引物(10mmol/L)各 IuL 模板 DNA IuL, TaqDNA 聚 合酶(Promega) 1U，dd H2O擴增反應均在PCR儀上完成； PCR反應條件如下
(1)94°C預變性 3 min ；
(2)94°C變性 20s ；
(3)退火溫度56度20s；
(4)72°C延伸 30s ；
(5)步驟(2)-(4)重復33次；
(6)72 °C延伸 IOmin ；
(7)將經過步驟(6)反應后的PCR產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結合 go Idview顯色進行檢測；
3)通過步驟2)擴增出的PCR產物經電泳檢測為693bp后，進行測序，獲得所擴增的核 苷酸序列；
4)通過步驟3)獲得核苷酸序列以后，根據給定對照的野生型堿基C和突變型堿基CA 的結果進行序列比對，并判斷比對結果(a)獲得的核苷酸序列為野生型堿基C，則獲得的核苷酸為來自建鯉的概率為67.6%
(b)獲得的核苷酸序列為突變型堿基CA，則獲得的核苷酸為來自正交個體的概率為
100% ο本發明的有益效果為
1、本發明提供一種能從建鯉、黃河鯉和建鯉正交Fl代混合群體中分離種質的方法；從 測序結果中，與對照組比較，如果是野生型，為建鯉的概率為67. 6%，如果是突變型是黃河鯉 和建鯉正交后代的概率為100%。2、本發明可提供一種進行河流種質混雜治理的參考路徑；按照鯉的自然壽命計算 為8 10年，那就是說如果一條河流養殖以建鯉養殖為主，而后放入黃河鯉父本作為獲取 較大雜種優勢的途徑，那么要區分出建鯉，只需要檢測野生型即可；要區分雜種一代，那么 檢測出的突變型全部為雜種鯉。3、本發明提供繁育改良的避免種質混雜的一種方法；實際生產中，通過雜交改良 獲取雜種優勢時，只需要提供改良品種的父本或母本即可，這樣避免了被引入品種造成的 種質混雜現象，對于引入品種需在苗種場保種即可。
具體實施例方式本發明所述的一種鑒別建鯉的分子標記方法，包括以下步驟
1)選擇建鯉自交Fl代、黃河鯉父本和建鯉母本的雜交Fl代混合群體為研究對象，隨機 選擇48尾，分別采樣血液，采用DNA提取法分別提取DNA樣本；
2)采用IGF2a基因內含子2進行PCR擴增，模板為通過步驟1)所提取的混合群體的 DNA樣本；
在進行 PCR 擴增時，PCR 反應體系為 25uL，包括 IOXbuffer 15uL, Mg2+ (25m mol/L) IuL, dNTPs (各 2mmol/L) luL，上下游引物(10 mmol/L)各 IuL 模板 DNA IuL，TaqDNA 聚合 酶(Promega) 1U，dd H2O擴增反應均在PCR儀上完成； PCR反應條件如下
(1)94°C預變性 3 min ；
(2)94°C變性 20s ；
(3)退火溫度56度20s；
(4)72°C延伸 30s ；
(5)步驟(2)-(4)重復33次；
(6)720C 延伸 IOmin ；
(7)將經過步驟(6)反應后的PCR產物用8%(質量)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結合 go Idview顯色進行檢測；
3)通過步驟2)擴增出的PCR產物經電泳檢測為693bp后，進行測序，獲得所擴增的核 苷酸序列；
4)通過步驟3)獲得核苷酸序列以后，根據給定對照的野生型堿基C和突變型堿基CA 的結果進行序列比對，并判斷比對結果
(a)獲得的核苷酸序列為野生型堿基C，則獲得的核苷酸為來自建鯉的概率為67.6% ；
(b)獲得的核苷酸序列為突變型堿基CA，則獲得的核苷酸為來自正交個體的概率為100% ο實例
獲取建鯉、黃河鯉和建鯉的正交Fl 代群體的血液，通過TAKARA公司的DNA提取試劑盒 進行DNA提取，并用凝膠檢測提取DNA的質量；用提供的對照和采集的樣本進行PCR擴增， 對比擴增條帶。將擴增好的條帶送往上海英俊公司測序后，獲取的序列，通過測序圖，分析 突變型和野生型。通過與對照比較，分析確定所要分離的種質資源。基于建鯉、黃河鯉和建鯉正交Fl代混合群體的種質分離 1、建鯉的種質分離
從池塘中，隨機選取建鯉、黃河鯉和建鯉的正交Fl代混合群體(48尾)，進行PIT標記 掃描，確定魚的個體標記，提取血液DNA并進行檢測，最終獲得測序結果的有44尾魚，檢測 到野生型34尾。這個結果與PIT標記對應后，尋找原始記錄資料進行魚品種對比，發現檢 測出建鯉的概率為67. 6%。2、正交Fl代的種質分離
同樣的，最終獲得測序結果的有44尾魚中檢測到突變型10尾。這個結果與PIT標記 對應后，尋找原始記錄資料進行魚品種對比，發現檢測出正交Fl代的概率為100%。本發明提供一種能從建鯉、黃河鯉和建鯉正交Fl代混合群體中分離種質的方法； 從測序結果中，與對照組比較，如果是野生型，為建鯉的概率為67. 6%，如果是突變型是黃河 鯉和建鯉正交后代的概率為100%。可提供一種進行河流種質混雜治理的參考路徑；按照鯉的自然壽命計算為8 10 年，那就是說如果一條河流養殖以建鯉養殖為主，而后放入黃河鯉父本作為獲取較大雜種 優勢的途徑，那么要區分出建鯉，只需要檢測野生型即可；要區分雜種一代，那么檢測出的 突變型全部為雜種鯉；實際生產中，通過雜交改良獲取雜種優勢時，只需要提供改良品種的 父本或母本即可，這樣避免了被引入品種造成的種質混雜現象，對于引入品種需在苗種場 保種即可。
權利要求
一種鑒別建鯉的分子標記方法，其特征在于，包括以下步驟1)選擇建鯉自交F1代、黃河鯉父本和建鯉母本的雜交F1代混合群體為研究對象，隨機選擇48尾，分別采樣血液，采用DNA提取法分別提取DNA樣本；2)采用IGF2a基因內含子2進行PCR擴增，模板為通過步驟1)所提取的混合群體的DNA樣本；3)通過步驟2)擴增出的PCR產物經電泳檢測為693bp后，進行測序，獲得所擴增的核苷酸序列；4)通過步驟3)獲得核苷酸序列以后，根據給定對照的野生型堿基C和突變型堿基CA的結果進行序列比對，并判斷比對結果(a)獲得的核苷酸序列為野生型堿基C，則獲得的核苷酸為來自建鯉的概率為67.6%；(b)獲得的核苷酸序列為突變型堿基CA，則獲得的核苷酸為來自正交個體的概率為100%。
2.根據權利要求1所述的鑒別建鯉的分子標記方法，其特征在于，在步驟2)中在進行 PCR 擴增時，PCR 反應體系為 25uL，包括 IOXbuffer 15uL, Mg2+ (25m mol/L) IuL, dNTPs (各 2mmol/L)luL，上下游引物(10 mmol/L)各 IuL 模板 DNA luL，TaqDNA 聚合酶(Promega) 1U，dd H2O擴增反應均在PCR儀上完成。
3.根據權利要求1所述的鑒別建鯉的分子標記方法，其特征在于，在步驟2)中，PCR反 應條件如下(1)94°C預變性 3 min ；(2)94°C變性 20s ；(3)退火溫度56度20s；(4)72°C延伸 30s ；(5)步驟(2)-(4)重復33次；(6)72 °C延伸 IOmin ；(7)將經過步驟(6)反應后的PCR產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結合 go Idview顯色進行檢測。
全文摘要
本發明涉及一種鑒別建鯉的分子標記方法，包括以下步驟選擇建鯉自交F1代、黃河鯉父本和建鯉母本的雜交F1代混合群體為研究對象，隨機選擇48尾，分別采樣血液，采用DNA提取法分別提取DNA樣本；采用IGF2a基因內含子2進行PCR擴增，模板為所提取的混合群體的DNA樣本；擴增出的PCR產物經電泳檢測為693bp后，進行測序，獲得所擴增的核苷酸序列；獲得核苷酸序列以后，根據給定對照的野生型堿基C和突變型堿基CA的結果進行序列比對，并判斷比對結果。本發明的有益效果為能從建鯉、黃河鯉和建鯉正交F1代混合群體中分離種質；可提供一種進行河流種質混雜治理的參考路徑；提供繁育改良的避免種質混雜的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101974649SQ20101056247
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月29日 優先權日2010年11月29日
發明者曲疆奇, 蘇勝彥, 董在杰 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心