專利名稱：一種病毒樣顆粒手足口病疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種病毒樣顆粒手足口病疫苗及其制備方法。
背景技術：
手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFffl))是亞太地區近年出現的一種兒童傳染病，又名發疹性水泡性口腔炎，以手、腳和口腔粘膜疤疹或破潰成潰瘍為主要臨床特征，其病原體是幾種腸道病毒。1957年，本病最先被報告流行在1957年的新西蘭，第二年分離出柯薩奇病毒， 1959年提出HFMD的命名。此后有多個國家和地區都報告HFMD的發生和流行，如美國、英國、澳大利亞、日本、新加坡、匈牙利、保加利亞等。在中國大陸，1981年上海首先報道手足口病的發生，其后，個別城市也曾發現并報告該病的局部流行；1983年和1986年天津出現了兩次大規模的爆發流行，主要的病原體為柯薩奇A組16型病毒。2007年以來，手足口病在中國大陸大爆發，引起200多萬兒童感染， 500多人死亡。自2009年起至今，新一輪爆發一直在中國大陸蔓延。手足口病的病原體包括數種腸道病毒屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬成員，常見的病毒型別是柯薩奇A組16型(Coxsakie A16，CoxA16)和腸道病毒71型(enterovirus71， EV71)。此外，柯薩奇A組2、4、5、7、9、10型以及B組1_5型等型別病毒所致的HFMD也時有報道。這些病毒可交替或同時出現，所以在一次流行中可發現有兩種或兩種以上病原同時存在的現象。感染EV71和C0X.A16所引起的臨床癥狀難于區別。感染EV71常常并發嚴重的神經炎癥，包括病毒性腦膜炎，腦炎，以及類似小兒麻痹的癱瘓，引起的肺水腫、肺出血經常導致嬰幼兒的快速死亡。Cox A16是引起心肌炎、心包炎、心肌病及其它嚴重疾病的重要病原。手足口病從感染到出現癥狀通常為3-6天。病人常在口中出現瘡，手掌、腳底出現皮膚紅疹。有些病例，主要是小于3歲的嬰幼兒，會出現嚴重的并發癥，短期發燒后突然惡化，并快速死亡。在流行中觀察到，C0XA16和EV71引起的流行不同，CoxA16引起的流行可發生在四季，流行季節長，春末夏初出現高峰，而EV71流行時則集中在夏季，CoxAie多在嬰幼兒中流行，而EV71還會流行于較大兒童或成人，且所致臨床經過較重，常有中樞神經系統并發癥， 如腦膜炎、腦炎等，而CoxAie所致癥狀典型，且并發癥少，預后良好。EV71病毒顆粒呈球形，無包膜和突起，衣殼為正20面體對稱，直徑大約在Mnm 30nm,由60個相同的亞單位構成，每個亞單位均包含VPl VP4四種結構蛋白拼裝成五聚體樣結構，其中VP4包埋在病毒粒子外殼的內側與病毒核心緊密連接，VPl VP3暴露在病毒顆粒表面，因而抗原決定簇基本上位于VPl VP3上。目前尚無有效的疫苗或藥物可防治手足口病。病毒樣顆粒(VLP)是由病毒衣殼蛋白組成的不含病毒核酸的病毒粒子空殼。由于VLP表面的病毒抗原和多肽表位與真正的病毒幾乎沒有區別，因此能引起強的免疫反應，且不具有潛在的副作用，是目前認為最有潛力的疫苗研究方向。乙肝病毒VLP疫苗 (Recombivax HB，Merck)和乳頭瘤病毒 VLP 疫苗(Gardisi 1，Merck)已經上市。YPD液體培養基為常規培養基。其具體組成可為酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，其余為水；各百分含量均為質量百分含量。若制固體培養基，加入2%瓊脂粉。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種用于制備病毒樣顆粒的重組酵母菌。本發明所提供的用于制備病毒樣顆粒的重組酵母菌，按照包括如下步驟的方法制備得到將構建病毒樣顆粒所需的蛋白的編碼基因導入出發酵母菌，得到重組酵母菌。上述重組酵母菌中，所述編碼基因是通過重組表達載體導入所述出發酵母菌中的；所述重組表達載體按照如下方法得到將所述編碼基因插入酵母表達載體的多克隆位點，得到所述重組表達載體。上述任一所述重組酵母菌中，所述酵母表達載體為pGAPh-A。上述任一所述重組酵母菌中，所述出發酵母菌為SMDl 168。上述任一所述重組酵母菌中，所述病毒樣顆粒為引起手足口病的病毒的病毒樣顆粒。上述任一所述重組酵母菌中，所述引起手足口病的病毒為EV71 ；所述構建EV71病毒的病毒樣顆粒所需的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO :1和SEQ ID NO 3所示；所述重組表達載體為如下1)和2)所示1)所述重組表達載體按照如下方法得到將所述SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因插入所述酵母表達載體的多克隆位點，得到的重組表達載體；2)所述重組表達載體按照如下方法得到將所述SEQ ID NO :3所示蛋白的編碼基因插入所述酵母表達載體的多克隆位點，得到的重組表達載體；上述任一所述重組酵母菌中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；所述SEQ ID NO 3所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。本發明的另一個目的是提供一種制備病毒樣顆粒的方法。本發明所提供的制備病毒樣顆粒的方法，包括如下步驟培養上述任一所述重組酵母菌，所述構建病毒樣顆粒所需的蛋白的編碼基因在所述重組酵母菌中表達，得到所述構建病毒樣顆粒所需的蛋白，所述構建病毒樣顆粒所需的蛋白進行自組裝，得到病毒樣顆粒。上述制備方法中，所述培養的溫度為27°C -33°C，具體為27°C、30°C或33°C。上述任一所述制備方法中，所述培養的pH值為4. 5-5. 5，具體為4. 5或5. 0或 5. 5 ；上述任一所述制備方法中，所述溶氧為50% -70%，具體為50%或60%或70% ；上述任一所述制備方法中，所述培養中使用的培養基按照如下方法配制將 YPD液體培養基和博萊霉素混合，得到所述培養基；YPD液體培養基和博萊霉素的配比為 Iml (100μ g_500y g)，具體為 Iml 100 μ g 或 Iml 200 μ g 或 Iml 500 μ g。由上述任一所述方法制備得到的病毒樣顆粒也屬于本發明的保護范圍。
本發明的另一個目的是提供一種手足口病疫苗。本發明所提供的手足口病疫苗，其活性成分為上述任一所述病毒樣顆粒。上述疫苗中包括佐劑。上述疫苗中，所述病毒樣顆粒和佐劑的配比為0. OOlg 0. 5g-0. 005g 0. 25g，具體為 0. OOlg 0.5g、0.003g 0.15g 或 0.005g 0. 25g ；上述疫苗中，所述佐劑為AL(OH)3佐劑。上述任一所述病毒樣顆粒在制備手足口病疫苗中的應用也屬于本發明的保護范圍。上述應用中包括佐劑。上述應用中，所述病毒樣顆粒和佐劑的配比為0. OOlg 0. 5g-0. 005g 0. 25g，具體為 0. OOlg 0.5g、0.003g 0.15g 或 0.005g 0. 25g ；上述應用中，所述佐劑為AL (OH) 3佐劑。本發明的制備病毒樣顆粒的方法，能夠制備出具有免疫功能的病毒樣顆粒，將其作為疫苗可獲得高效價的血清，且本發明方法所需條件簡單、操作容易、成本低。因此本發明方法在疫苗的制備領域具有廣闊的應用前景。
圖1為重組病毒基因在原核生物載體鑒定示意圖。圖2為重組病毒基因在真核生物載體的構建示意圖。圖3為重組病毒融合于真核表達系統的鑒定示意圖。圖4為為工程菌表達的VLP電鏡照片鑒定表達結果。圖 5 為 westenbolting 鑒定圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。病毒EV71的毒株⑶FS-3/⑶/CHN/2008在文獻“張欣鄧小玲管大偉鄭煥英，2008年廣東省腸道病毒71型分離株全基因組核苷酸序列分析.中華微生物學和免疫學雜志.2009 年4期”中公開過，公眾可從顧睞博(北京)科技有限公司獲得。人惡性胚胎橫紋肌瘤細胞RD細胞株，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，)，產品目錄號為TCHu45。重組禽類成髓纖維病毒逆轉錄酶(AMV)第一鏈cDNA反轉錄試劑盒購自大連寶生物。內切酶 PmlI、SacII、EcoRI、XbaI、BspHI 均購自 NEB 公司。pGAPZa-A 質粒購自 Invitrogen 公司。
SMDl 168感受態細胞購自hvitrogen公司。實施例1、制備病毒樣顆粒VLP的方法以腸道病毒71型(EV71)病毒的VLP為例，說明本發明方法的具體構思及步驟。一、制備重組酵母菌
構建流程如圖2.UPl基因，3⑶基因克隆及重組載體的構建以病毒EV71的RNA為模板，反轉錄得到cDNA。以cDNA為模板，用如下引物對分別進行PCR擴增，分別得到Pl基因和3⑶基因。P 1-上游引物(Pml I) 5，-TATCTACACGTGATGGGTTCGCAGGTG-3，；P 1-下游引物(&icll)5，-TATCGTCCGCGGTAAAGAGTAGTGA-3，；3CD-上游引物(EcoRI) 5，-AGCAGAATTCATGGCCCGAGTCTT-3，；3CD-下游引物(XbaI) 5，-GCCGTCTAGATAAAATAACTCGAGCCAAT-3，Pl基因重組載體構建將Pl基因PCR擴增產物用RiilI和SacII進行酶切，回收目的Pl基因產物；用PmlI和McII酶切PGAPh-A質粒，回收載體大片段；將目的Pl基因產物和載體大片段連接，得到重組載體Pl-pGAPZa-A。3⑶基因重組載體構建將3⑶基因PCR擴增產物用EcoRI和)(baI進行酶切，回收目的3⑶基因產物；用EcoRI和^CbaI酶切pGAPh-A質粒，回收載體大片段；將目的3⑶ 基因產物和載體大片段連接，得到重組載體3⑶-pGAPh-A。自連對照載體用SacII和RiilI酶切pGAPZ α Α,回收載體大片段，將回收的載體大片段進行連接，連接產物即為自連對照載體。將上述三種重組載體分別轉化Dffia感受態細胞，用抗生素kocin+LB (25 μ g/ml) 平板篩選陽性克隆；挑取陽性克隆，用Ze0Cin+LB(25yg/ml)培養，得到的菌液分別進行 PCR篩選鑒定和測序驗證。PCR鑒定所用的引物對為Pl-上游引物/Pl-下游引物和3⑶-上游引物/3⑶-下游引物。PCR鑒定結果如圖1所示(A為Pl-pGAPh-A，B為3CD-pGAPh-A)。測序結果在pGAPZa-A的PmlI和SacII酶切位點間插入了 SEQ ID NO 2所示Pl 基因序列，表明構建的重組載體Pl-pGAPh-A正確。在pGAPh-A的EcoRI和)(bal酶切位點間插入了 SEQ ID NO 4所示3⑶基因序列，表明構建的重組載體3⑶-pGAPh-A正確。SEQ ID NO 2所示Pl基因序列編碼的蛋白如SEQ ID NO :1所示.SEQ ID NO 4所示Pl基因序列編碼的蛋白如SEQ ID NO 3所示.2、重組酵母菌的構建用BspHI分別單酶切Pl-pGAPh-A和3CD-pGAPh_A，使其分別線性化。將線性化的重組載體一起通過電穿孔轉化SMD1168感受態細胞，得到重組酵母菌。將重組酵母菌接種于kOCin+YPD(100y g/ml)固體培養基中進行抗性篩選，得到抗性重組酵母菌。提取抗性重組酵母菌的基因組DNA，以2μ1 DNA為模板，PCR檢測是否含有Pl基因和3⑶基因。PCR鑒定所用的引物對為Pl-上游引物/Pl-下游引物和3⑶-上游引物/3CD-下游引物。Pl 基因 PCR 陰性對照pGAPh-A。Pl 基因 PCR 陽性對照Pl-pGAP^i-A。3CDPCR 陰性對照 pGAPh-A。3CD PCR 陽性對照 3CD-pGAPh-A。PCR鑒定結果如圖3所示(1-6號為重組菌中Pl基因檢測；7 =Pl基因PCR陰性對照；8 =Pl基因PCR陽性對照；9-14號為重組菌中3CD基因檢測；15 :3CD PCR陰性對照；16 3CD PCR陽性對照；17 :DGL5000)。PCR擴增得到的Pl基因的理論長度為2586bp ；PCR擴增得到的3⑶基因的理論長度為1935bp。既得到Pl基因又得到3⑶基因的重組菌為陽性重組酵母菌。3、表達挑取陽性重組酵母菌接種于IOml ZeocindOO μ g/ml)+YPD培養液中，在IOOml三角瓶50轉/分鐘條件下培養Mh。Zeocin (100 μ g/ml) +YPD培養液配制將YPD培養液和博萊霉素(Zeocin)混合， YPD培養液和博萊霉素(Zeocin)的配比為Iml 100 μ g。合并菌液50ml，5000rpm離心lOmin，取上清，28000rpm離心4h，棄上清，收集沉淀， 即得到病毒樣顆粒(VLP)。4 鑒定(1)電鏡沉淀用PBS溶解，取樣電鏡觀察。電鏡觀察結果如圖4所示。結果可觀察到病毒樣顆粒(VLP)。(2)Wfestern blot 鑒定蛋白表達常規方法電泳；電泳后轉膜至0. 45umPVDF膜；加入5%脫脂奶粉4°C封閉過夜；吸取7μ 1兔抗EV71多克隆抗體(Abbiotec，USA)。，用21ml 5%脫脂奶粉1 3000 倍稀釋，浸沒PVDF膜；室溫反應1. 5h ；洗膜后，吸取7 μ 1辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的鼠抗兔IgG(天根生物技術有限公司)用21ml5%脫脂奶粉1 3000稀釋，浸沒PVDF膜；室溫， 反應2h ；洗膜后，將魯米諾和過氧化氫混合物加到PVDF膜是那個，分布均勻，反應aiiin ； 將X光片壓在膜上，曝光lmin;定影后清水沖洗。結果如圖5所示。圖5中，1:預染蛋白 Marker，2 :EV71VLP。表明得到的蛋白就是EV71的殼蛋白。綜合以上鑒定結果，表明，得到的顆粒具有與病毒EV71相同的免疫學特性。二、重組酵母菌表達得到VLP方法I 1、高表達條件將重組酵母菌接種于培養基中，在溫度為30 0C、發酵體系的pH值為5. 0、溶氧60 %的條件下，發酵時間60-62小時；培養基配制將YPD液體培養基和博萊霉素(Zeocin)混合，YPD液體培養基和博萊霉素(Zeocin)的配比為Iml 200 μ g。2、顆粒的純化培養重組酵母菌，獲得菌液(培養容器內的所有物質記作菌液)；將菌液5000g離心，收集上清液；用截留分子量200KD超濾膜將上清液進行超濾，取濾液，濃縮倍數100倍。 然后蔗糖密度梯度離心使用不連續蔗糖密度梯度(15^,30%,65%蔗糖密度梯度)，10 萬g超速離心5小時后，收集15-35%蔗糖界面上的乳白色條帶，超速離心去除蔗糖并濃縮回收病毒顆粒。離子交換層析采用DEAE sepharose FF介質，平衡液為pH6. 5-7. 5、含有 0. 05-0. 15M氯化鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5M氯化鈉、pH6. 5-7. 5的PBS0雜蛋白去除可達99%以上，純化后的VLP病毒原液，即為VLP抗原。
方法II 方法與基本相同，不同的是溫度為27°C，發酵體系的pH值為4. 5，溶氧為50% ；培養基中YPD液體培養基和博萊霉素(Zeocin)的配比為Iml IOOyg.方法III 方法與基本相同，不同的是溫度為33°C，發酵體系的PH值為5. 5，溶氧為70% ；培養基中YPD液體培養基和博萊霉素(Zeocin)的配比為Iml 500 μ g.如上三種方法均得到VLP。實施例2、實施例1得到的VLP在作為疫苗中的應用一、制備疫苗疫苗I 將病毒樣顆粒(VLP)與AL (OH)3K劑混合并溶于PBS緩沖液中，得到疫苗； 其中VLP顆粒蛋白與AL(OH)3K劑的質量比為0. OOlg 0. 5g。疫苗II 將病毒樣顆粒(VLP)與AL(OH)3K劑混合并溶于PBS緩沖液中，得到疫苗；其中VLP顆粒蛋白與AL(OH)3K劑的質量比為0.003g 0. 15g。疫苗III 將病毒樣顆粒(VLP)與AL(OH)3佐劑混合并溶于PBS緩沖液中，得到疫苗；其中VLP顆粒蛋白與AL(OH)3K劑的質量比為0.005g 0. 25g。二、疫苗純度檢測根據《中國藥典(第3版)》及《中國生物制品規程》，測定疫苗成品的外觀，無菌試驗，DNA含量，蛋白質含量，pH值等。做了兩批疫苗，疫苗I結果如表1。疫苗II、疫苗III結果與疫苗I結果無顯著差已升。表1、疫苗結果
權利要求
1.一種用于制備病毒樣顆粒的重組酵母菌，按照包括如下步驟的方法制備得到將構建病毒樣顆粒所需的蛋白的編碼基因導入出發酵母菌，得到重組酵母菌。
2.根據權利要求1所述的重組酵母菌，其特征在于所述編碼基因是通過重組表達載體導入所述出發酵母菌中的；所述重組表達載體按照如下方法得到將所述編碼基因插入酵母表達載體的多克隆位點，得到所述重組表達載體。
3.根據權利要求1或2所述的重組酵母菌，其特征在于所述酵母表達載體為 pGAPZa-A ；所述出發酵母菌為SMDl 168。
4.根據權利要求1-3中任一所述的重組酵母菌，其特征在于所述病毒樣顆粒為引起手足口病的病毒的病毒樣顆粒。
5.根據權利要求1-4中任一所述的重組酵母菌，其特征在于所述引起手足口病的病毒為EV71 ；所述構建EV71病毒的病毒樣顆粒所需的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO 1和 SEQ ID NO 3所示；所述重組表達載體為如下1)和2)所示1)所述重組表達載體按照如下方法得到將所述SEQID NO :1所示蛋白的編碼基因插入所述酵母表達載體的多克隆位點，得到的重組表達載體；2)所述重組表達載體按照如下方法得到將所述SEQID NO :3所示蛋白的編碼基因插入所述酵母表達載體的多克隆位點，得到的重組表達載體；和/或，所述SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 所述SEQ ID NO 3所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQID NO 4所示。
6.一種制備病毒樣顆粒的方法，包括如下步驟培養權利要求1-5中任一所述重組酵母菌，所述構建病毒樣顆粒所需的蛋白的編碼基因在所述重組酵母菌中表達，得到所述構建病毒樣顆粒所需的蛋白，所述構建病毒樣顆粒所需的蛋白進行自組裝，得到病毒樣顆粒。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述培養的溫度為27°C_33°C，具體為 27°C、30°C或33°C ；所述培養的pH值為4. 5-5. 5，具體為4. 5或5. 0或5. 5 ；所述溶氧為 50% -70%，具體為 50%或 60%或 70% ；所述培養中使用的培養基按照如下方法配制將YPD液體培養基和博萊霉素混合， 得到所述培養基；YPD液體培養基和博萊霉素的配比為Iml (100yg-500yg)，具體為 Iml IOOyg 或 Iml 200 μ g 或 Iml 500 μ g。
8.由權利要求6或7所述方法得到的病毒樣顆粒。
9.一種手足口病疫苗，其活性成分為權利要求8中所述病毒樣顆粒；或權利要求8中所述病毒樣顆粒在制備手足口病疫苗中的應用。
10.根據權利要求9所述的疫苗或應用，其特征在于所述疫苗中包括佐劑；所述病毒樣顆粒和佐劑的配比為0. OOlg 0. 5g-0. 005g 0.25g，具體為0. OOlg 0. 5g、 0. 003g 0.15g 或 0.005g 0. 25g ；和/或，所述佐劑為AL (OH) 3佐劑。
全文摘要
本發明公開了一種病毒樣顆粒手足口病疫苗及其制備方法。本發明的制備病毒樣顆粒的方法，包括如下步驟培養重組酵母菌，所述構建病毒樣顆粒所需的蛋白的編碼基因在所述重組酵母菌中表達，得到所述構建病毒樣顆粒所需的蛋白，所述構建病毒樣顆粒所需的蛋白進行自組裝，得到病毒樣顆粒。本發明的制備病毒樣顆粒的方法，能夠制備出具有免疫功能的病毒樣顆粒，將其作為疫苗可獲得高效價的血清，且本發明方法所需條件簡單、操作容易、成本低。因此本發明方法在疫苗的制備領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/85GK102533572SQ20101059137
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者張定梅, 楊東虎, 陸家海, 陸杰, 馬占軍 申請人:顧睞博(北京)科技有限公司