專利名稱：一種胃液中miRNA的檢測方法
技術領域：
本發明涉及miRNA的檢測方法，具體涉及一種胃液中miRNA的檢測方法。
背景技術：
生物體中的RNA可以分為兩大類編碼RNA和非編碼RNA。非編碼RNA又可分為 長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA ；后者較為重要的包括微小RNA (microRNA, miRNA),它 的長度為1914個核苷酸。在生物體的正常發育中miRNA起著舉足輕重的作用，它們通過 對目標mRNA的切割或翻譯的抑制而發揮重要的基因表達負性調節作用，具有影響細胞的 生長、分化和凋亡等重要功能。在不同組織細胞的生理異常變異中，某些miRNA具有明顯的 異常表達。對于miRNA的分析需要小RNA提取和檢測，小RNA提取如中國專利申請號為 200810120866. 0，名稱為“一種從鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法”，就公開了包括組織 研磨，離心去不溶物，氯仿抽提氯仿與feol 0. 25 :1，振蕩15秒，靜置5分鐘后離心，異丙 醇沉淀-15 _20°C下沉淀12小時，離心，用75%乙醇洗滌沉淀，離心后用DEPC-雙蒸水溶 解，得到小RNA提取液。小RNA檢測包括早期的Northern印跡法，但費時費力，需在大量的 總RNA標本；聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)是一種準確、定量檢測 方法，但由于miRNA等小RNA由于長度很短，以至于不能通過經典PCR法直接擴增，需要在 小RNA尾端連接多個腺嘌呤來延長長度或使用較長探針或幾個連接在一起的探針組，才可 檢測，如中國專利申請號為200910084474. 8，名稱為“用于小RNA檢測的探針組以及用此探 針組檢測小RNA的方法”的發明專利申請，就公開了用至少具有一個莖環結構的探針，多個 這樣探針連接起來組成探針組進行小RNA檢測。胃液成分相當復雜，含有大量的壁細胞分泌的鹽酸，pH值約為0. 9-1. 5，具有強酸 性。胃液還含有胃蛋白酶、核酸酶、粘液、內因子等有機物，其中含有的核酸酶較為穩定，有 可能分解RNA，這些因素均影響到RNA的提取和檢測。另外胃液中存在大量的粘多糖和粘蛋 白等物質，在運用常規方法提取RNA的過程中，由于多糖的理化性質和RNA非常相似，多糖 和RNA可以同時沉淀下來，產生富集多糖的透明膠狀沉淀，不利于后續的cDNA合成和PCR 檢測。胃液中miRNA的含量很低，因此對胃液中miRNA的提取和檢測難度很大，目前還沒 有具體提取和胃液中miRNA的檢測方法。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種胃液中miRNA的檢測方法，該檢測方法能 去除胃液中多糖和蛋白質等雜質干擾，對胃液中miRNA的有效提取，并對提取的miRNA進行 熒光定量RT-PCR檢測。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種胃液中miRNA的檢測方法， 包括下述步驟a、胃液抽取和中和用胃管抽取空腹胃液5ml，放入離心管中，置于冰上，然后加入質 量百分濃度為20%的氫氧化鈉溶液0. 5ml，置搖床中常溫振搖20分鐘，可以使胃液中粘液 液化，用質量百分濃度為20%的氫氧化鈉溶液調整pH值至7. 0士0. 5，再加入質量百分濃度 為1%的胰蛋白酶溶液20μ1，漩渦混勻，置37°C水浴箱中消化15分鐘，可以讓胃液中的蛋 白質水解并使胃液均質化，4°C下，IOOOrpm離心20分鐘；
b、RNA釋放取步驟a的上清液200μ 1置于消毒離心管中，加入50 μ 1滅菌的焦碳酸 乙二酯(Diethylpyrocarbonate，DEPC)處理過的雙蒸水，混勻，再加入Trizol溶液1ml，反 復吹打20次，室溫下靜置10分鐘，可以讓RNA充分釋放到溶液中，4°C下，12000rpm離心15 分鐘，丟棄沉淀，保留上清液，以除去殘余的多糖和粘蛋白；
c、氯仿提取將步驟b的上清液移入另一消毒離心管中，加入0.2ml氯仿，漩渦振蕩15 秒，室溫下靜置5分鐘，4°C下，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相移入DEPC處理過的滅 菌離心管中；
d、異丙醇沉淀在步驟c的DEPC處理過的滅菌離心管中加入與所述上層水相等體積 的異丙醇，混勻，室溫下靜置20分鐘，4°C下，12000rpm離心15分鐘，棄上清得沉淀；
e、乙醇洗滌在步驟d的沉淀中，加入質量百分濃度為75%的乙醇1ml，顛倒混勻20次 洗滌，4°C下，12000rpm離心3分鐘，棄上清，再用同濃度和同量的乙醇同樣重復洗滌一次， 4°C下，12000rpm離心3分鐘，棄上清，室溫下干燥10分鐘，加15 μ 1雙蒸水溶解，得到RNA 提取液，_80°C保存備用；
f> RNA逆轉錄用mKcript逆轉錄(reverse transcription, RT)試劑盒(購于德國 Qiagen公司)對步驟e的RNA提取液進行逆轉錄反應，得到cDNA溶液，置_20°C保存備用， 具體操作依該試劑盒說明書進行在0. 5ml離心管中加入10 μ 1 RNA提取液、5 μ 1 DEPC雙 蒸水、1 μ 1逆轉錄混合試劑和4μ 1 RT緩沖液；然后在37°C保溫1小時，再在95°C保溫5 分鐘，加入80 μ 1 DEPC雙蒸水，就得到cDNA溶液；
g、PCR檢測用mikript SYBR Green PCR檢測試劑盒(購于德國Qiagen公司)對步驟 f的cDNA溶液進行PCR擴增反應，擴增的上游引物為miRNA特異性擴增上游引物或小RNA U6特異性擴增上游引物(購于德國Qiagen公司)，擴增的下游引物為小RNA通用下游引物 (購于德國Qiagen公司)，再用熒光定量PCR儀(購于美國Mratagene公司)檢測，具體操作 依檢測試劑盒和熒光定量PCR儀說明書進行在薄壁透明熒光定量PCR反應管中分別加入 1 μ 1 miRNA特異性擴增上游引物或小RNA U6特異性擴增上游引物和1 μ 1 PCR檢測的小 RNA通用下游引物，6μ 1 cDNA溶液，10μ1 SYBR Green PCR反應緩沖液，2μ1 DEPC雙蒸水； PCR反應條件95°C預變性15分鐘；然后94°C變性15秒，60°C退火30秒，70°C延伸30秒， 共40個循環；解鏈曲線分析95 0C 1分鐘，55°C 30秒；然后緩慢升溫至95°C，升溫速率為 0. 2°C /秒。最后得到擴增曲線圖和解鏈曲線圖，從擴增曲線的Ct值可以得到各miRNA的 表達水平，從解鏈曲線中可以了解到其曲線為較窄的單一峰，可以看出每種miRNA均被特 異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。所述miRNA特異性擴增上游引物為has-miR-17擴增上游引物(購于上海吉瑪制藥 技術有限公司)，具體序列為5，CAAAGTGCTT ACAGTGCAGG TAG 3，。所述miRNA特異性擴增上游引物為has-miR-21擴增上游引物(購于上海吉瑪制藥 技術有限公司)，具體序列為5，CGGTAGCTTA TCAGACTGAT GTTGA 3，。
所述miRNA特異性擴增上游引物為has-miR-31擴增上游引物(購于上海吉瑪制藥 技術有限公司)，具體序列為5’ GCAAGATGCT GGCATAGCT 3’。所述miRNA特異性擴增上游引物為haS-miR-106a擴增上游引物(購于上海吉瑪制 藥技術有限公司)，具體序列為5’ GAAAAGTGCT TACAGTGCAG GTAG 3’。miRNA特異性擴增上游引物也可以為has-miR-421擴增上游引物(購于上海吉瑪 制藥技術有限公司)等，具體序列為5’ AACAGACATT AATTGGGCGC 3’。與現有技術相比，本發明的優點在于一種胃液中miRNA的檢測方法，通過胃液抽 取和中和、RNA釋放、氯仿提取、異丙醇沉淀、乙醇洗滌、RNA逆轉錄和PCR檢測步驟，使用氫 氧化鈉溶液，對胃液中的粘稠成分進行液化使粘蛋白和多糖懸于溶液中，并中和胃液；加入 胰蛋白酶進行消化，可以使粘蛋白等蛋白質水解，同時使胃液中的細胞成分變得松散，便于 離心分離；加入Trizol溶液反復吹打，RNA充分釋放并與多糖和粘蛋白等雜質分離，通過離 心使多糖等雜質沉于管底達到去除目的；這些操作有效地解決了胃液中酸度、多糖和粘蛋 白等對RNA提取的干擾，而采用mikript SYBR Green PCR檢測試劑盒進行PCR檢測也解 決了胃液中miRNA含量較少的檢測問題；因此本發明可以去除胃液中多糖和蛋白質等雜質 干擾，對胃液中miRNA的有效提取，并對提取的miRNA進行熒光定量PCR檢測。
圖1為實施例1的兩個胃液標本中的has-miR-17擴增曲線圖； 圖2為實施例1的兩個胃液標本中的has-miR-17解鏈曲線圖3為實施例2的兩個胃液標本中的has-miR-21擴增曲線圖； 圖4為實施例2的兩個胃液標本中的has-miR-21解鏈曲線圖； 圖5為實施例3的兩個胃液標本中的小RNA U6擴增曲線圖； 圖6為實施例3的兩個胃液標本中的小RNA U6解鏈曲線圖。
具體實施例方式實施例1
一種胃液中miRNA的檢測方法，依次包括以下主要步驟
a、胃液抽取和中和用胃管抽取二個空腹胃液標本(不同部位)各5ml，放入離心管中， 置于冰上，然后加入質量百分濃度為20%的氫氧化鈉溶液0. 5ml，置搖床中常溫振搖20分 鐘，可以使胃液中粘液液化，用質量百分濃度為20%的氫氧化鈉溶液調整pH值至7.0士0.5， 再加入質量百分濃度為1%的胰蛋白酶(市售)溶液20 μ 1，漩渦混勻，置37°C水浴箱中消化 15分鐘，使胃液中的蛋白質水解并使胃液均質化，4°C下，IOOOrpm離心20分鐘；
b、RNA釋放取步驟a的上清液200μ 1置于消毒離心管中，加入50 μ 1滅菌的DEPC(市 售)處理過的雙蒸水，混勻，再加入Trizol溶液(市售)1ml，反復吹打20次，室溫下靜置10 分鐘，使RNA充分釋放到溶液中，4°C下，12000rpm離心15分鐘，丟棄沉淀，保留上清液，以除 去殘余的多糖和粘蛋白；
c、氯仿提取將步驟b的上清液移入另一消毒離心管中，加入0.2ml氯仿，漩渦振蕩15 秒，室溫下靜置5分鐘；4°C下，12000rpm離心15分鐘；吸取上層水相移入DEPC處理過的滅 菌離心管中；d、異丙醇沉淀在上述DEPC處理過的滅菌離心管中加入與上層水相等體積的異丙醇， 混勻，室溫下靜置20分鐘；4°C下，12000rpm離心15分鐘，棄上清得沉淀；
e、乙醇洗滌在步驟d的沉淀中，加入質量百分濃度為75%的乙醇1ml，顛倒混勻20次 洗滌；4°C下，12000rpm離心3分鐘；棄上清，再用質量百分濃度為75%的乙醇Iml同樣重復 洗滌一次，4°C下，12000rpm離心3分鐘，棄上清；室溫下干燥10分鐘，加15 μ 1雙蒸水溶解， 得到RNA提取液，_80°C保存備用；
f> RNA逆轉錄用mikript逆轉錄試劑盒對步驟e的RNA提取液進行逆轉錄反應，具 體操作依該試劑盒說明書進行在0. 5ml離心管中加入10 μ 1 RNA提取液、5 μ 1 DEPC雙蒸 水、Iyl逆轉錄混合試劑和4μ1 RT緩沖液；然后在37°C保溫1小時，再在95°C保溫5分 鐘，加入80 μ 1 DEPC雙蒸水，得到cDNA溶液，置_20°C保存備用；
g、PCR檢測用mikript SYBR Green PCR檢測試劑盒對步驟f的cDNA溶液進行PCR 擴增反應，擴增引物為has-miR-17擴增上游引物和PCR檢測的小RNA通用下游引物，再用 熒光定量PCR儀檢測，具體操作依檢測試劑盒和熒光定量PCR儀說明書進行在薄壁透明熒 光定量PCR反應管中分別加入1 μ 1 miR-17擴增上游引物和1 μ 1 PCR檢測的小RNA通用下 游引物，6 μ 1 cDNA溶液，10 μ 1 SYBR Green PCR反應緩沖液，2 μ 1 DEPC雙蒸水；PCR反應 條件95°C預變性15分鐘；然后94°C變性15秒，60°C退火30秒，70°C延伸30秒，共40個 循環；解鏈曲線分析95 0C 1分鐘，55°C 30秒；然后緩慢升溫至95°C，升溫速率為0.2°C/ 秒。最后得到如附圖1所示的miR-17擴增曲線和如附圖2所示的miR-17解鏈曲線，從擴 增曲線可以得到所檢測的二個胃液標本的Ct值分別為32. 12和34. 78，從解鏈曲線中可以 了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個胃液標本的miR-17均被特異性擴增，沒有引 物二聚體和雜帶的干擾；PCR檢測時無需在小RNA尾端連接多個腺嘌呤。實施例2
與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟g中，擴增的上游引物由has-miR-21 特異性擴增上游引物代替has-miR-17，檢測得到胃液中miR-21表達水平的擴增曲線(附 圖3)和解鏈曲線(附圖4)，從擴增曲線可以得到所檢測的二個胃液標本的Ct值分別為 29. 04和32. 03 ；從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個胃液標本 的miR-21均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。實施例3
與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟g中，擴增的上游引物由小RNA U6特 異性擴增上游引物代替piR-651，檢測得到胃液中小RNA U6表達水平的擴增曲線(附圖5) 和解鏈曲線(附圖6)，從擴增曲線可以得到所檢測的二個胃液標本的Ct值分別為29. 60和 32. 04;從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個胃液標本的小RNA U6均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。實施例4
與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟g中，擴增的上游引物由has-miR-31 特異性擴增上游引物代替has-miR-17，檢測得到胃液中miR-31表達水平的擴增曲線和解 鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個胃液標本的Ct值分別為31. 98和34. 55 ；從解 鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個胃液標本的miR-31均被特異 性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。
實施例5
與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟g中，擴增的上游引物由 has-miR-106a特異性擴增上游引物代替has_miR-17，檢測得到胃液中miR_106a表達水平 的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個胃液標本的Ct值分別為29. 80 和30. 56;從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個胃液標本的 miR-106a均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。實施例6
與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟g中，擴增的上游引物由has-miR-421 特異性擴增上游引物代替has-miR-17，檢測得到胃液中miR-421表達水平的擴增曲線和解 鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個胃液標本的Ct值分別為29. 01和35. 57 ；從解 鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個胃液標本的miR-421均被特異 性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。實施例7
利用同一部位抽取的胃液標本中miRNA和小RNA U6的Ct值，就可根據公式DCt = Ctmim - Ctu6計算出該miRNA的DCt值，根據DCt值的大小就可判斷該miRNA的相對表達水 平；DCt值小者，其對應miRNA的表達水平高；而DCt值大者，其對應miRNA的表達水平低。本發明建立了檢測胃液中微小RNA水平的方法，為研究胃組織的功能及其變化提 供了依據。
權利要求
1.一種胃液中miRNA的檢測方法，其特征在于包括下述步驟a、胃液抽取和中和用胃管抽取空腹胃液5ml，放入離心管中，置于冰上，然后加入質 量百分濃度為20%的氫氧化鈉溶液0. 5ml，置搖床中常溫振搖20分鐘，用質量百分濃度為 20%的氫氧化鈉溶液調整pH值至7. 0士0. 5，再加入質量百分濃度為1%的胰蛋白酶溶液 20μ 1，漩渦混勻，置37°C水浴箱中消化15分鐘，4°C下，IOOOrpm離心20分鐘；b、RNA釋放取步驟a的上清液200μ 1置于消毒離心管中，加入50 μ 1滅菌的焦碳酸 乙二酯處理過的雙蒸水，混勻，再加入Trizol溶液1ml，反復吹打20次，室溫下靜置10分 鐘，4°C下，12000rpm離心15分鐘；c、氯仿提取將步驟b的上清液移入另一消毒離心管中，加入0.2ml氯仿，漩渦振蕩15 秒，室溫下靜置5分鐘，4°C下，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相移入焦碳酸乙二酯處理 過的滅菌離心管中；d、異丙醇沉淀在步驟c的滅菌離心管中加入與所述上層水相等體積的異丙醇，混勻， 室溫下靜置20分鐘，4°C下，12000rpm離心15分鐘，棄上清得沉淀；e、乙醇洗滌在步驟d的沉淀中，加入質量百分濃度為75%的乙醇1ml，顛倒混勻20次 洗滌，4°C下，12000rpm離心3分鐘，棄上清，再用同濃度和同量的乙醇同樣重復洗滌一次， 4°C下，12000rpm離心3分鐘，棄上清，室溫下干燥10分鐘，加15 μ 1雙蒸水溶解，得到RNA 提取液，_80°C保存備用；f> RNA逆轉錄用mikript逆轉錄試劑盒對步驟e的RNA提取液進行逆轉錄反應，得 到cDNA溶液，置-20°C保存備用，具體操作依該試劑盒說明書進行；g、PCR檢測用mikript SYBR Green PCR檢測試劑盒對步驟f的cDNA溶液進行PCR 擴增反應，擴增的上游引物為miRNA特異性擴增上游引物或小RNA TO特異性擴增上游引 物，擴增的下游引物為小RNA通用下游引物，再用熒光定量PCR儀檢測，具體操作依檢測試 劑盒和熒光定量PCR儀說明書進行。
2.如權利要求1所述的一種胃液中miRNA的檢測方法，其特征在于所述miRNA特異性 擴增上游引物為has-miR-17擴增上游引物。
3.如權利要求1所述的一種胃液中miRNA的檢測方法，其特征在于所述miRNA特異性 擴增上游引物為has-miR-21擴增上游引物。
4.如權利要求1所述的一種胃液中miRNA的檢測方法，其特征在于所述miRNA特異性 擴增上游引物為has-miR-31擴增上游引物。
5.如權利要求1所述的一種胃液中miRNA的檢測方法，其特征在于所述miRNA特異性 擴增上游引物為haS-miR-106a擴增上游引物。
全文摘要
本發明公開了一種胃液中miRNA的檢測方法，包括胃液抽取和中和、RNA釋放、氯仿提取、異丙醇沉淀、乙醇洗滌、RNA逆轉錄、PCR檢測等步驟，該檢測方法使用氫氧化鈉溶液，對胃液中的粘稠成分進行液化使粘蛋白和多糖懸于溶液中，并中和胃液；加入胰蛋白酶進行消化，可以使粘蛋白等蛋白質水解，同時使胃液中的細胞成分變得松散，便于離心分離；加入Trizol溶液反復吹打，RNA充分釋放并與多糖和粘蛋白等雜質分離，解決了胃液中酸度、多糖和粘蛋白等對RNA提取的干擾問題，因此本發明可以去除胃液中多糖和蛋白質等雜質干擾，對胃液中miRNA的有效提取，并對提取的miRNA進行熒光定量PCR檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102127601SQ201010606089
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月27日 優先權日2010年12月27日
發明者宋皓軍, 崔龍, 肖丙秀, 郭俊明 申請人:寧波大學