一種培育抗水稻黑條矮縮病毒侵染植物的方法

專利名稱：一種培育抗水稻黑條矮縮病毒侵染植物的方法
技術領域：
本發明涉及一種培育抗水稻黑條矮縮病毒侵染植物的方法。
背景技術：
水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)通過介體昆蟲灰飛虱的傳播，可以侵染小麥、水稻、玉米等禾本科植物，其中以對水稻和玉米的侵染為重。從以往的作物病史資料看，水稻黑條矮縮病毒并不是造成主要作物經濟損失的主要病害。但是，由于最近幾年氣候和耕作制度的變化，水稻黑條矮縮病毒引起的水稻和玉米病害明顯加重，在一些水稻產區發病率竟能達到90%。生產上的經驗是秈稻品種表現出一定的抗性， 且隨品種不同差異較大，而粳稻普遍易感，整體而言，抗性品種匱乏。目前研究表明，RBSDV侵染植物后，會表達出3種與病毒結構組分無關的非結構蛋白(non-structural protein,Pns) 0特別是非結構蛋白Pns7_l會在病毒侵染到一定階段時參與形成一種明顯的管狀結構。關于這種管狀結構的作用、形成機制目前都是未知，但是可以肯定的是這個結構對病毒非常重要。因此以Pns7-1等非結構蛋白為突破口，是研究致病機理和積累抗性材料的理想選擇。隨著植物轉基因技術的發展，越來越多的文獻報道了通過獲得病毒蛋白的轉基因植物進而研究其致病功能和機制的成功案例，其中最為著名的就是對病毒基因沉默抑制子白勺石開胃(R. Anandalakshmi, J. G et al. 1998,Proc. Natl. Acad. Sci. USA95 :13079 ；Brigneti G.，et al. 1998，EMBL J. 17 :6739)；同時，自1991年Napoli等在轉基因矮牽牛中發現基因的共抑制以來(Napoli，C. et al. 1990，Plant Cell)，已發現基因沉默在植物、動物、微生物等的生物體中普遍存在，其中雙鏈RNA最為一種重要的誘導信號，引起靶標RNA的特異降解，以此為指導，利用表達病毒蛋白基因反向重復序列從而獲得抗病材料的文獻也逐 WiR^ (ffaterhouse P. et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :15939 ；Smith, N. A et al. 2000, Nature 407 :319)，其中又以構建靶標序列的發夾結構(在一段內含子兩端分別連接一段序列和它的方向重復序列，轉錄時會形成雙鏈RNA莖環)最為成熟。

發明內容
本發明的目的是提供一種培育抗水稻黑條矮縮病毒侵染植物的方法。本發明提供了一個雙鏈DNA片段，是式⑴所示的基因片段SEQ 正向-X-SEQ 反向；(I)其中，所述SEQ^^^n序列表的序列2所示，所述SEQfi^1與所述SEQmK向互補；X是所述SEQ1^1與所述SEQg之間的間隔序列，X與所述SEQ1^1F互補且X與SEQ 不互補。所述X可為內含子。常規內含子均可采用。所述內含子具體可為pSK-int載體的 EcoR I位點和HindIII位點之間的內含子(pi載體的EcoR I位點和HindIII位點之間的小片段)。含有所述雙鏈DNA片段的重組載體、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。所述重組載體可為發夾中間載體。構建發夾中間載體時，可采用PSK載體作為骨架載體。所述發夾中間載體具體可為在pSK-int載體的Mc I酶切位點和EcoR I酶切位點之間插入所述SEQm，HindIII酶切位點和Ml I酶切位點之間插入所述SEQfi^1得到的重組質粒(即在pSK-int載體的Me I和EcoR I位點之間插入了序列表2所示雙鏈DNA， HindIII和Ml I位點之間插入了序列表2所示雙鏈DNA的反向互補序列得到的重組質粒)。所述重組載體還可為植物表達載體。構建植物表達載體時，可采用 pCambia-SUper1300(35S啟動子加增強子)作為骨架載體。所述植物表達載體具體可為將所述雙鏈DNA片段插入pCambia super 1300載體的多克隆位點得到的重組質粒。所述植物表達載體優選為將所述雙鏈DNA片段插入pCambia super 1300載體的Ml I酶切位點和Mc I酶切位點之間得到的重組質粒。所述植物表達載體最優選為將所述發夾中間載體的Ml I酶切位點和Me I酶切位點之間的小片段插入pCambia super 1300載體的Mil 酶切位點和Mc I酶切位點之間得到的重組質粒。本發明還保護一種培育抗水稻黑條矮縮病毒侵染植物的方法，是將所述雙鏈DNA 片段導入目的植物中得到轉基因植物；所述轉基因植物抗黑條矮縮病毒侵染的能力高于所述目的植物。所述雙鏈DNA片段可通過所述重組載體導入所述目的植物；所述目的植物為任何可以被水稻黑條矮縮病毒侵染的植物。所述目的植物優選水稻，如水稻品種中花17。本發明還保護序列表的序列2所示的DNA片段(非結構蛋白Pns7-1的編碼基因中的靶標序列)。擴增序列表的序列2所示DNA或其任一片段的引物也屬于本發明的保護范圍。序列表的序列2所示的DNA片段可用于培育抗水稻黑條矮縮病毒侵染植物。本發明中以非結構蛋白Pns7-1的編碼基因為對象，找出合適的靶標，構建了產生雙鏈RNA的發夾結構載體，并進一步構建了可以產生雙鏈RNA的發夾結構的植物表達載體， 培育得到了抗水稻黑條矮縮病毒侵染能力顯著增加的轉基因水稻。本發明可以在較短時間內獲得抗性材料，同時由于采用基因沉默策略，靶標更為專一，抗病效果好且無生態風險。 本發明將會為水稻黑條矮縮病毒防治提供有效手段，在重大病害防治方面有廣闊前景。


圖1為實施例1中雙鏈RNA的電泳圖。
圖2為實施例1中PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3為重組質粒pSK-hairpin的結構示意圖。
圖4為重組質粒pCambia super 1300-Pns7_lhp的結構示意圖。
圖5為制備轉基因植株的過程中的照片。
圖6為制備轉基因植株過程中的PCR鑒定電泳圖。
圖7為制備轉基因植株過程中的Southern鑒定圖。
圖8為水稻黑條矮縮病毒侵染后的植物表型圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。引物均由北京三博生物技術公司合成。pSK-int 載體參考文獻Guo，H. S.，Fei，J. F.，Xie，Q and Chua, N. H(2003) Achemical-regulated inducible RNAi system in plants.The Plant Journal.34, 383-392。ρCambia super 1300 (pCambia 1300-based super promotervector)載體 參考文獻:Yu, Χ. C. , Zhu, S. Y. , Gao, G. F. , Wang, Χ. J. , Zhao, R. , Zou, K. Χ. , Wang, Χ. F. , Zhang, Χ. Y. , Wu, F. Q. , Peng, C. C and Zhang, D. P (2007) Expression of a grape calcium-dependent protein kinase ACPKl in Arabidopsis thai iana promotes plants growth and confers abscisic acid-hypersensitivity in germination, postgenrmination growth, and stomatal movement. Plant Molecular Biology. 64, 531-538。7jC稻黑條矮縮病毒(RBSDV) :Isogai，Μ.，Uyeda, I and Lee, B(1998)Detection and assignment of proteins encoded by rice black-streaked dwarf Figivirus S7, S8，S9and S10. Journal of General Virology 79,1487-1494。農桿菌EHA105 北京天恩澤生物科技有限公司。水稻中花17 中國農業科學院作物所。基本培養基的成分由水和溶質組成；每升培養基中含有如下溶質KNO3 2830mg, (NH4)2SO4 463mg, KH2PO4 400mg，MgSO4 · 7H20 185mg，CaCl2 · 2H20 166mg, FeSO4 · 7H2027. 85mg, Na2-EDTA 37. 25mg, MnSO4 · 4H20 IOmg, H3BO4 3mg, ZnSO4 · 7H20 2mg, Na2MoO4 · 2H200. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, KIO. 75mg,鹽酸硫胺素 (VBl) 10mg，鹽酸吡哆醇(VB6)lmg，煙酸(VB5)lmg，肌醇lOOmg，CEH (水解酪蛋白)300mg，谷氨酰胺500mg，脯氨酸500mg，蔗糖30g。MS基本培養基成分由水和溶質組成；每升培養基中含有如下溶質=KNO3 1900mg, (NH4)2SO4 1650mg, KH2PO4 170mg, MgSO4 · 7H20 370mg, CaCl2 · 2H20 440mg, FeSO4 · 7H2027. 85mg, Na2-EDTA 37. 25mg, MnSO4 · 4H20 15. 6mg, H3B046. 2mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl 2 · 6H20 0. 025mg, KI 0. 83mg,鹽酸硫胺素(VBl) 0. lmg，鹽酸吡哆醇(VB6)0. 5mg，煙酸(VB5)0. 5mg，肌醇lOOmg，蔗糖3g，葡萄糖7克。農桿菌懸浮培養液由水和溶質組成；每升培養基中含有如下溶質=KNO3 2830mg, (NH4)2SO4 463mg, KH2PO4 400mg，MgSO4 · 7H20 185mg，CaCl2 · 2H20 166mg, FeSO4 · 7H2027. 85mg, Na2-EDTA 37. 25mg, MnSO4 · 4H20 IOmg, H3B043mg, ZnSO4 · 7H20 2mg, Na2MoO4 · 2H200. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, KI 0. 75mg,鹽酸硫胺素 (VBl) 10mg，鹽酸吡哆醇(VB6) lmg，煙酸(VB5) ImgJj^ 200mg，CEH(水解酪蛋白)300mg，蔗糖 30g。農桿菌懸浮培養基(pH5. 2-5. 3)將農桿菌懸浮培養液121°C滅菌20分鐘，使用前力口 AS 至 100 μ M。愈傷誘導固體培養基(pH = 5. 8)由基本培養基和溶質組成；溶質及其濃度如下 2，4-D 2mg/L,植物凝膠 2. 6g/L。固體YEP培養基(pH7.2):由水和溶質組成；每升培養基中含有如下溶質 Tryptone (細菌蛋白胨)10g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g。共培養培養基(pH5. 2-5. 3，)在基本培養基中加入2，4_D Qmg/L)、植物凝膠 (2. 6g/L)，在倒平板前加AS至100 μ Μ。預篩選培養基(pH5. 8)在基本培養基中加入2，4-D (2mg/L)、植物凝膠(2. 6g/L)， 在倒平板前加頭孢霉素(cef)至500mg/L。篩選培養基(pH5. 8)在基本培養基中加入2，4-D (2mg/L)、植物凝膠(2. 6g/L)，在倒平板前加cef至500mg/L、Hyg至30mg/L。再生培養基(pH5. 8)在基本培養基中加入NAA (0. 5mg/L), BAP (3mg/L)、植物凝膠 (2. 6g/L)，121°C滅菌20分鐘，倒平板前加潮霉素(Hyg)至30mg/L。生根培養基(pH5. 8)在1/2MS基本培養基中加入植物凝膠(2. 6g/L)，在倒入粗試管前添加潮霉素(Hyg)至30mg/L。實施例1、靶標序列(S7-1-Hp)的發現一、雙鏈RNA的提取取0. 3g感染水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarfvirus)的水稻(華粳6號)葉片，加液氮研磨成粉末，放入2mL離心管；加700 μ L 2 X STE緩沖液，100 μ LSDS 溶液(10% ),900 μ L水飽和酚，渦旋振蕩30分鐘；渦旋后的樣品IOOOOg離心15分鐘，取上清，加乙醇至終濃度16. 5%，再加入3%的CFll纖維素粉，振蕩30分鐘；4°C、12000g離心 3-5分，棄上清，在沉淀中加入含16. 5%乙醇的1 XSTE緩沖液0. 5ml，振蕩5分鐘，然后4°C、 12000g離心3-5分鐘，棄上清，沉淀以此法重復洗3次；在漂洗徹底的沉淀中加入0. 25mL 1 X STE緩沖液，渦旋振蕩1分鐘后，4°C、12000g離心3_5分鐘，取上清保存，重復兩次后合并兩次的上清；加入1/10體積NaAC (pH = 5. 2),2. 5X無水乙醇，_20°C沉淀2個小時以上， 之后4°C、12000g離心15分鐘，沉淀用70%乙醇洗兩次，干燥；DEPC水溶解(雙鏈RNA的電泳圖見圖1)。二、反轉錄合成cDNA第一條鏈反轉錄弓丨物5，-TTAAGCAGAAGGAGATGAAAAGAC-3，。在1. 5mL離心管中加入6μ L DEPC Η20,4μ L 5 X反轉錄緩沖液，2 μ L dNTP，反轉錄引物1 μ L，雙鏈RNA 5 μ L，混勻后95°C變性3分鐘，冰浴3分鐘，短暫離心后，加入RNA抑制劑1 μ L，M-MLV反轉錄酶1 μ L，42°C反應1小時。三、PCR擴增所用引物如下S7F 5' -ATGGATAGACCTGCTCGAGAACATTTAAAATTC-3，；S7R 5，-TTAAGCAGAAGGAGATGAAAAGAC-3，。PCR擴增按照25ul體系，引物各加0. 5 μ L, dNTP (各IOmM)加0. 5 μ L，反轉錄模板加1 μ L，北京泛基諾公司的Golden Taq高保真DNA聚合酶加0. 3 μ L，雙蒸水補足25 μ L。 反應程序95°C預變性5分鐘；然后95°C變性30秒，69°C退火30秒，72°C延伸1分20秒，循環30次。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(見圖幻，切膠回收PCR產物(使用艾德萊凝膠回收試劑盒)。四、將回收的PCR產物構建到pMD-18-T載體上進行測序，與已知病毒序列比對確認，PCR產物的核苷酸序列如序列表的序列1所示(非結構蛋白Pns7-1的編碼基因)。五、靶標序列(S7-1-Hp)的發現對Pns-7-l的序列進行分析，選擇Pns-7_1的前500個核苷酸做為靶標最為理想。 將序列表的序列2所示的雙鏈DNA命名為S7-1-Hp (序列2所示DNA即序列表的序列1自 5，末端第1至500位核苷酸所示DNA)。實施例2、培育抗水稻黑條矮縮病毒侵染植物一、重組質粒pSK-hairpin (發夾中間載體)的構建1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA(S7-l_Hp)。2、以序列2所示的雙鏈DNA為模板，用Hp left F(701)和Hp left R(702)組成的弓I物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物甲。Hp left F(701) :5， ~GTCGACATGGATAGACCTGCTCGAGAAC~3‘；Hp left R(702) :5，-gccgAAGCTTTTCTCAACGTCATTTTTGATTAC~3，。Hp left F(701)中下劃線標注Ml I識別序列。Hp left R(702)中，下劃線標注 HindIII識別序列。3、以序列2所示的雙鏈DNA為模板，用Hp right F(703)和Hp right R(704)組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物乙。Hp right F(703) :5， -GAGCTCATGGATAGACCTGCTCGAGAAC-3‘；Hp right R(704) :5，-crcGAATTCTTCTCAACGTCATTTTTGATTAC~3，。Hp right F(703)中下劃線標注&ic I識別序列。Hp right R(704)中，下劃線標注EcoR I識別序列。4、用限制性內切酶Ml I和HindIII雙酶切PCR擴增產物甲，得到酶切產物甲。5、用限制性內切酶Ml I和HindIII雙酶切pSK-int載體，回收載體骨架(約 3000bp)。6、將步驟4的酶切產物甲和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒甲。7、用限制性內切酶Me I和EcoR I雙酶切PCR擴增產物乙，得到酶切產物乙。8、用限制性內切酶Me I和EcoR I雙酶切重組質粒甲，回收載體骨架(約 3500bp)。9、將步驟7的酶切產物乙和步驟8的載體骨架連接，得到重組質粒 pSK-hairpin (發夾中間載體)。重組質粒pSK-hairpin的結構示意圖見圖3。測序結果表明，重組質粒pSK-hairpin中，在pSK-int載體的Me I和EcoR I位點之間插入了序列表2 所示雙鏈DNA，HindIII和Ml I位點之間插入了序列表2所示雙鏈DNA的反向互補序列。二、pCambia super 1300-Pns7_lhp 的構建1、用限制性內切酶Ml I和Me I雙酶切pCambia super 1300載體，回收載體骨架(約 IOOOObp)。2、用限制性內切酶Ml I和Me I雙酶切重組質粒pSK-hairpin(發夾中間載體)， 回收Pns7-1發夾結構片段(約1200bp)。
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3、用T4連接酶連接步驟1的載體骨架和步驟2的Pns7-1發夾結構片段， 得到重組質粒pCambia super 1300-Pns7_lhp (植物表達載體)。重組質粒pCambia superl300-Pns7-lhp的結構示意圖見圖4。三、轉基因植物的獲得轉化篩選過程見圖5。1、制備重組農桿菌將重組質粒pCambia super 1300-Pns7_lhp (植物表達載體)以凍融法轉化農桿菌EHA105感受態細胞，得到重組農桿菌。2、水稻愈傷組織的準備水稻中花17(野生型植株)的成熟種子用70%乙醇進行表面消毒1分鐘后，用 50% (體積百分含量)的次氯酸鈉消毒20分鐘，無菌水沖洗4-5次，于濾紙上吸干；種子的胚朝上置于愈傷誘導固體培養基上，261、1他/ 1光周期下培養，誘導愈傷組織；10-15天后，剝下成熟胚盾片處長出的愈傷組織，轉入新的愈傷誘導固體培養基在相同的條件下繼代培養；3-4cm大小的愈傷組織用于侵染轉化(見圖5A)。3、轉基因植物的獲得(1)重組農桿菌菌懸液的制備將重組農桿菌菌液均勻涂在固體YEP培養基(含50mg/L卡那霉素和30mg/L利福平)上，28°C黑暗培養2-3天，用無菌藥匙從平板上刮菌于農桿菌懸浮培養基中，調整菌液濃度至0D600為0. 2-0. 5，即為重組農桿菌菌懸液。(2)農桿菌侵染將步驟2的愈傷組織放入重組農桿菌菌懸液中浸沒15分鐘(不時輕輕搖動)，傾除菌液，用無菌濾紙吸干水稻愈傷組織表面多余的菌液，置于共培養培養基上二8°C，黑暗共培養2-3天(見圖5B)。(3)預篩選步驟( 處理后的愈傷組織用無菌水洗三次，再用含有500mg/L頭孢霉素(cef) 的水清洗15分鐘，再用水沖洗一次，將愈傷組織吹干水分，轉到的預篩選培養基上，26°C暗培養7天(見圖5C)。(4)篩選步驟( 處理后的愈傷組織轉入篩選培養基黑暗培養4周(見圖5D)。(5)愈傷再生步驟(4)處理后，挑選色澤金黃、質地緊湊的抗性愈傷組織轉入再生培養基，將來源相同的抗性愈傷組織移至再生培養基的同一區域，作為同一株系，26°C光照培養，直到分化出芽并長為34cm的小苗(見圖5E)。(6)生根培養將小苗移至生根培養基試管中，^rc、iai/iai光周期下生根培養2-3周，苗長出粗壯的根系(見圖5F)。(7)將植株移栽至大田，收獲種子，即為Tl代種子，Tl代種子長成的植株即為Tl 代植株。4、轉基因植株的分子鑒定
(1)提取Tl代植株葉片的基因組DNA(天根公司植物基因組提取試劑盒，DP305)。(2)以基因組DNA為模板，用Hp left F(701)和Hp left R(702)組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR擴增體系(25 μ L)兩條引物各0. 5 μ L，dNTP (各IOmM) 0. 5 μ L，基因組 DNAl μ L，北京泛基諾公司的Taq聚合酶0. 3 μ L，雙蒸水補足25 μ L。PCR反應程序95°C預變性5分鐘；然后95°C變性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸 45秒，循環35次。Tl代植株的PCR擴增產物的電泳圖見圖6 (具有500bp左右條帶的為陽性植株)。(3)步驟⑵鑒定為陽性的植株，將PCR擴增產物進行Southern檢測(探針序列為序列表的序列2所示)，結果見圖7 (B、C、D、F、G為轉基因植株；A為野生型植株；E為空載體對照植株)。Southern檢測為陽性的植株即為轉基因植株(Tl代)。收獲Tl代轉基因植株自交得到的種子(T2代種子)。5、轉空載體植株的制備將pCambia super 1300 載體代替重組質粒 pCambia super 1300-Pns7_lhp，其它同步驟1至4，得到轉空載體植株(Tl代)。收獲Tl代轉空載體植株自交得到的種子(T2代種子)。四、轉基因植株抗水稻黑條矮縮病毒侵染能力的鑒定將轉基因植株的T2代種子(60粒)，轉空載體植株的T2代種子(60粒)和水稻中花17的種子(60粒)分別進行抗水稻黑條矮縮病毒侵染能力的鑒定，即分別進行如下處理1、將種子在潮霉素濃度為100mg/L的1/2MS固體培養平板上催芽，挑選生根正常的轉入配置有營養土的小花盆中，每盆5顆苗。2、待到水稻苗長出第三片心葉時，接種帶毒飛虱(攜帶水稻黑條矮縮病毒 (RBSDV)的飛虱)，每盆接種20頭，共接10盆。3、接種一天后，徹底清除飛虱，20天后觀察發病情況，并拍照。結果見圖8A和圖8B (圖8A為水稻中花17，圖8B為轉基因水稻)。水稻中花17 和轉空載體植株的發病率均在90%以上，并可以觀察到典型的矮縮癥狀。轉基因水稻的發病率只有40%左右，且癥狀明顯輕。
權利要求
1.一個雙鏈DNA片段，是式(I)所示的基因片段SEQ正向反向；(I)其中，所述SEQf^^n序列表的序列2所示，所述SEQg與所述SEQmK向互補；X是所述SEQ1^1與所述SEQfi^1之間的間隔序列，X與所述SEQ1^1和所述SEQfi^1均不互補。
2.根據權利要求1所述的DNA片段，其特征在于所述X是內含子，所述內含子優選為 pSK-int載體的EcoR I位點和HindIII位點之間的內含子。
3.含有權利要求1或2所述雙鏈DNA片段的重組載體、轉基因細胞系或重組菌。
4.如權利要求3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將所述雙鏈DNA片段插入pCambia super 1300載體的多克隆位點得到的重組質粒；所述重組載體優選為將所述雙鏈DNA片段插入pCambia super 1300載體的Ml I酶切位點和&ic I酶切位點之間得到的重組質粒。
5.如權利要求3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pSK-int載體的Mc I酶切位點和EcoR I酶切位點之間插入所述SEQ1^1，在HindIII酶切位點和Ml I酶切位點之間插入所述得到的重組質粒。
6.如權利要求3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權利要求5所述重組載體的Ml I酶切位點和Me I酶切位點之間的小片段插入pCambia superl300載體的 Sal I酶切位點和Me I酶切位點之間得到的重組質粒。
7.一種培育抗水稻黑條矮縮病毒侵染植物的方法，是將權利要求1或2所述的DNA片段導入目的植物中，得到轉基因植物；所述轉基因植物抗黑條矮縮病毒侵染的能力高于所述目的植物。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于權利要求1或2所述的DNA片段通過權利要求4或6所述重組載體導入所述目的植物；所述目的植物為能被水稻黑條矮縮病毒侵染的植物；所述目的植物優選為水稻。
9.序列表的序列2所示的DNA片段。
10.權利要求9所述DNA片段在培育抗水稻黑條矮縮病毒侵染植物中的應用。全文摘要
本發明公開了一種培育抗水稻黑條矮縮病毒侵染植物的方法。本發明提供了一個雙鏈DNA片段，是式(I)所示的基因片段；所述SEQ正向如序列表的序列2所示，所述SEQ反向與所述SEQ正向反向互補；X是所述SEQ正向與所述SEQ反向之間的間隔序列，X與所述SEQ正向不互補且X與SEQ反向不互補。所述雙鏈DNA片段導入目的植物中可得到抗黑條矮縮病毒侵染的能力高于所述目的植物的轉基因植物。本發明可以在較短時間內獲得抗性材料，同時由于采用基因沉默策略，靶標更為專一，抗病效果好且無生態風險。本發明將會為水稻黑條矮縮病毒防治提供有效手段，在重大病害防治方面有廣闊前景。SEQ正向-X-SEQ反向(I)。
文檔編號C12N15/63GK102168101SQ201010609798
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者李永強, 范在豐, 賈蒙驁, 雷蕾 申請人:中國農業大學