快速無菌微測試的制作方法

專利名稱：快速無菌微測試的制作方法
快速無菌微測試相關申請本申請要求2009年5月4日提交的美國臨時申請第61/175，271號的權益。上述專利的全部內容通過引用納入本文。
背景技術：
美國的聯邦法規和其它國家的類似法規需要無菌試驗以確保藥物產品基本沒有微生物如細菌和真菌。三種常用方法-直接轉移無菌試驗、膜過濾無菌試驗、產品沖洗無菌試驗用于完成這些無菌測試。傳統無菌試驗用兩種液體培養基O0-25°C培養的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)和30-35°C培養的液體巰基醋酸鹽培養基(FTM))和沖洗液體進行， 需要14天的培養時間(參見例如USP<71> “無菌試驗”(Sterility Tests)，《藥典論壇》 (Pharmacopeial Forum). USP 30-NF 25，第 1 次修訂，美國藥典委員會(The United States Pharmacopeial Convention, Inc.)) ,EP 2. 1. 6 “無菌” (Sterility)(歐洲藥典 2· 1. 6 “無菌”EP第6版Q007))和其它相關藥典。液體巰基醋酸鹽培養基(FTM)包含兩相-液體培養基的下層相是厭氧相，上層相包含用于供氧培養的氧氣。通常，為使用膜過濾方法測試藥物產品的無菌性，液體、乳化或溶解的藥物或醫藥產品(例如活性成分、胃腸外制劑、滴眼劑、鼻噴霧等)經0.45微米孔徑膜過濾，膜轉移到適當測試培養基(FTM和TSB)并培養14天。如果微生物在培養基中生長，則藥物產品并非無菌且取樣進行微生物鑒定。培養需要大量時間，對培養基中生長的生物進行微生物鑒定也需要大量時間，這是劣勢且限制藥物產品對需要病人的可用性。例如，在醫療危機時期， 目前需要14天培養期的無菌試驗會延誤能減少或結束危機的藥物或疫苗的可用性。因此， 需要快速無菌試驗方法。發明概述本發明涉及檢測藥物組合物中活微生物的方法，包括步驟a)提供可過濾的藥物組合物；b)過濾藥物組合物以提供至少三個其上沉積藥物組合物濾渣的過濾膜；c)將至少三個過濾膜置于固體培養基上以產生至少三個濾渣培養物；d)i)在20-25°C有氧條件下培養至少一個濾渣培養物；ii)在30-35°C有氧條件下培養至少一個濾渣培養物和iii)在 30-35°C厭氧條件下培養至少一個濾渣培養物；條件是濾渣培養物的培養期均不大于約13 天和e)檢測膜上的活微生物細胞、微菌落或菌落，其中膜上存在活微生物細胞、微菌落或菌落指示藥物組合物中存在活微生物。所述方法還可包括在過濾藥物組合物后過濾洗液的步驟。在一些實施方式中，膜是聚偏二氟乙烯膜、玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜、聚對苯二甲酸乙二酯膜、混合纖維素酯(醋酸纖維素和硝酸纖維素)、磷酸纖維素膜、DEAE膜、尼龍網膜或聚四氟乙烯膜。所述膜優選具有約0.45 μ m的孔徑。固體培養基可選自FTM-A(含1. 075%瓊脂(終濃度)的液體巰基醋酸鹽培養基)、 BHI (腦心浸液瓊脂)、蒂福科(Difco)釀酒厭氧瓊脂、R2A瓊脂、施樂(khaedler)血瓊脂、 開索(Caso)-瓊脂ICR(胰蛋白酶大豆瓊脂)、有5%血的哥倫比亞瓊脂和⑶C厭氧血瓊脂。在一些實施方式中，所述方法可包括培養濾渣培養物約2-7天的步驟。
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在一些實施方式中，活微生物細胞、微菌落或菌落用發光測定檢測，如檢測膜上活微生物細胞、微菌落或菌落生成的三磷酸腺苷(ATP)的生物發光測定。發光測定可包括螢光素酶測定。在一些實施方式中，發光測定檢測探針與微生物內源核酸之間形成的核酸雜交產物。發光測定可包括過氧化物酶反應。在一些實施方式中，可用電荷耦合器件相機和圖像分析軟件檢測發光。在一些實施方式中，可定量測定或計數測定活微生物細胞、活微生物微菌落或活微生物菌落的數量。在一些實施方式中，藥物組合物是液體組合物。所述液體組合物可以是胃腸外組合物、口服組合物、鼻用組合物、眼用組合物或疫苗。本發明也涉及檢測藥物組合物中活微生物的方法，包括步驟a)提供可過濾的藥物組合物；b)過濾藥物組合物以提供至少三個其上沉積藥物組合物濾渣的過濾膜；c)將至少三個過濾膜置于固體培養基上以產生至少三個濾渣培養物；d)i)在20-25°C有氧條件下培養至少一個濾渣培養物；ii)在30-35°C有氧條件下培養至少一個濾渣培養物和iii)在 30-35°C厭氧條件下培養至少一個濾渣培養物；條件是濾渣培養物的培養期均不大于約13 天和e)檢測膜上的三磷酸腺苷(ATP)，其中膜上存在ATP指示藥物組合物中存在活微生物。附圖簡要說明

圖1顯示10分鐘時間框內UV處理奧斯陸莫拉菌(M. osloensis)的結果。顯示培養4天后存在的菌落形成單位(CFU)數量。該圖顯示4分鐘后(3輪)CFU減少量大于或等于 50%。圖2顯示10分鐘時間框內熱處理大腸桿菌(E.coli)的結果。顯示培養3天后的菌落形成單位(CFU)數量。該圖顯示3分鐘后(3輪)CFU減少量大于或等于50%。圖3顯示10分鐘時間框內胃腸外藥物產品處理的結果。顯示培養5天后的菌落形成單位(CFU)數量。該圖顯示2分鐘后(3輪)CFU減少量大于或等于50%。圖4A是70°C熱處理3分鐘的藤黃微球菌(M. Iuteus)細胞的顯微照片。圖4B是接種于胰蛋白酶大豆瓊脂的未處理藤黃微球菌細胞在30-35°C培養3天后的顯微照片。圖5顯示未處理大腸桿菌培養物、熱處理大腸桿菌、UV處理大腸桿菌和扶他林處理大腸桿菌的光密度數據。圖6顯示未處理大腸桿菌培養物、熱處理大腸桿菌、UV處理大腸桿菌和扶他林處理大腸桿菌的光密度數據。圖7顯示未處理大腸桿菌生長曲線與熱處理大腸桿菌的比較。大腸桿菌培養物在 3小時過程中的斜率為0. 2313，隨后它回升到未處理培養物的正常斜率。圖8顯示未處理金黃色葡萄球菌(S. aureus)生長曲線與熱處理金黃色葡萄球菌的比較。應激金黃色葡萄球菌培養物在4小時過程中的斜率為0. 1070，隨后它回升到未處理培養物的正常斜率G小時后，0. 4034)。圖9顯示未處理白色念珠菌(C. albicans)生長曲線與熱處理白色念珠菌的比較。 應激白色念珠菌培養物在超過8小時過程中的斜率為0. 0419。圖10顯示未處理短小芽孢桿菌(B. pumilus)生長曲線與饑餓短小芽孢桿菌的比較。所述細胞在2-8°C經歷營養耗盡7天。應激短小芽孢桿菌培養物在5小時過程中的斜率為-0. 0056，隨后它回升到未處理培養物的正常斜率。
圖11是顯示施樂血瓊脂背景試驗結果的顯微照片。密理弗(MILLIFLEX)快速膜 MXHVffP 124在密理弗(MILLIFLEX)盒中的施樂血瓊脂上30_35°C孵育5天。圖IlA顯示密理弗(MILLIFLEX)快速圖像，所述膜在此情況中用IOOml液體A沖洗。圖IlB顯示用IOOml 液體D沖洗的膜。發明詳述本發明涉及比需要14天培養期的常規試驗更快速的無菌試驗方法。所述方法特別適合可過濾液體組合物，如液體藥物組合物(例如溶液、懸浮液、乳液、胃腸外組合物、口服組合物、鼻用組合物、眼用組合物、疫苗)的快速無菌測試。通常，該方法包括經過濾膜過濾藥物組合物，隨后將過濾膜轉移到固體培養基并在適當生長條件下培養足夠長的時間以使膜上的活微生物增殖或生成足量的生物分子如三磷酸腺苷，從而檢測微生物(例如6小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天)。一方面，本發明是檢測藥物組合物中活微生物的方法。所述方法包括經過濾膜過濾藥物組合物(例如液體藥物組合物)，以提供超過一個(例如至少三個)其上沉積藥物組合物濾渣和藥物組合物中可能存在的任何活微生物的過濾膜。如需要，可隨后過濾洗液，例如用于將生長抑制劑、代謝抑制劑或檢測抑制劑從膜上洗去，從而促進濾渣中微生物的檢測。含濾渣的過濾膜安置到固體培養基上以生成至少三個濾渣培養物。然后，濾渣在三種不同條件下培養20-25°C的有氧條件；30-35°C的有氧條件和30_35°C的厭氧條件，培養期足以使過濾膜上的活微生物增殖或生成足量的生物分子如三磷酸腺苷，以便檢測微生物。通常，濾渣培養物的培養期不超過約13天，優選培養期大大少于13天。然后，使用任何合適方法評估濾渣培養物的膜上活微生物細胞、微菌落或菌落的存在。過濾膜上存在活微生物細胞、微菌落或菌落指示藥物組合物中存在活微生物。在本發明的一個方面，提供了檢測藥物組合物中活微生物的方法，包括以下步驟 提供可過濾的藥物組合物；過濾藥物組合物以提供至少三個其上沉積濾渣的過濾膜；將至少三個過濾膜置于固體培養基上以產生至少三個濾渣培養物；在20-25°C有氧條件下培養第一個濾渣培養物，在30-35°C有氧條件下培養第二個濾渣培養物和在30-35°C厭氧條件下培養第三個濾渣培養物，培養期均不大于約13天；檢測膜上的三磷酸腺苷(ATP)。過濾膜上存在ATP指示藥物組合物中存在活微生物。可用本發明檢測廣泛范圍的微生物(例如酵母和霉菌、革蘭氏陽性孢子菌、革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陽性桿菌(好氧和厭氧微生物))。所述方法可用于檢測ATCC(美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection))菌株， 也用于檢測可能污染生產設施的環境微生物。例如，本文所述的方法可用于檢測巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)ATCC16404(以前稱為黑曲霉(Aspergillus niger))、 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) ATCC 6633、白色念珠菌(Candida albicns)ATCC 10231、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)ATCC 11437、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 9027、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 6538、大腸桿菌(Escherichia col i) ATCC 8739、洛菲不動桿菌(Acinetobacter Iwoffi)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、病研所芽孢桿菌(Bacillus idriensis)、地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)、非發酵棒桿菌(Corynebacterium afermentans)；庫克菌屬(Kocuriaspez.)、嗜根庫克菌(Kocuria rhizophilia)(以前稱為藤黃微球菌(Micrococcus luteus))(Moraxella osloensis)(Penicillium spez.) ^
酸桿菌(Propionibacterium acnes)、頭狀葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)禾口沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)。通常，藥物組合物(例如液體藥物組合物)使用高壓無菌或滅菌技術經無菌過濾膜過濾，如使用真空或正壓力。可使用任何合適的過濾膜和過濾裝置。合適過濾膜的例子包括例如聚偏二氟乙烯膜、玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜、聚對苯二甲酸乙二酯膜、混合纖維素酯(醋酸纖維素和硝酸纖維素)、磷酸纖維素膜、DEAE膜、尼龍網膜或聚四氟乙烯膜。膜優選由PVDF(聚偏二氟乙烯)制成。適用于要求保護的本發明的過濾膜的孔徑小到足以保留藥物組合物中可能存在的微生物，如孔徑為約0. 1微米(μ m)-約20微米，約0. 1微米-約 15微米，0. 1微米-約12微米，0. 1微米-約10微米，0. 1微米-約8微米，0. 1微米-約6 微米，0. 1微米-約5微米，0. 4微米-12微米，0. 4微米-10微米，0. 4微米-8微米，0. 4微米-6微米，約0. 22微米或約0. 45微米。所述過濾膜優選具有約0. 45 μ m的孔徑。通常制備至少三個含濾渣的過濾膜。這通過經三個單獨過濾膜過濾三個單獨藥物組合物樣品來完成。這也可通過制備一個含藥物組合物濾渣的過濾膜并使用無菌或滅菌技術將過濾物切成或分成三部分(例如尺寸大致相等的三個部分)。然后，將含藥物組合物的過濾膜置于適當固體培養基上以產生濾渣培養物。可選擇適當固體培養基和培養條件來支持待檢測的所需微生物的生長和/或代謝。這可通過例如篩選培養基完成，如本文所述和示例。本方法使用的固體培養基優選支持廣泛范圍的微生物在有氧和厭氧培養條件下生長。如果需要，可使用超過一種的固體培養基。例如，可使用的第一種培養基在酵母、霉菌和好氧菌生長上等同于或優于液體胰蛋白酶大豆肉湯；可選擇的第二種培養基在厭氧微生物生長上等同于或優于液體巰基醋酸鹽培養基的厭氧相，可選擇的第三種培養基在好氧微生物生長上等同于或優于液體巰基醋酸鹽培養基的有氧相。在有氧和厭氧條件下優選使用單一固體培養基。本發明可使用的合適固體培養基包括例如FTM-A(含1. 075%瓊脂(終濃度)的液體巰基醋酸鹽培養基)、BHI (腦心浸液瓊脂)>Difco釀酒厭氧瓊脂、R2A瓊脂、施樂血瓊脂、開索-瓊脂ICR(胰蛋白酶大豆瓊脂)、有5%血的哥倫比亞瓊脂和CDC厭氧血瓊脂。施樂血瓊脂是本發明使用的特別優選的固體培養基。優選的固體培養基適于支持“應激”和“非應激”微生物的生長和/或代謝，如本文所述。這很需要，因為微生物在化學方法如藥物組合物生產過程中可能遭受應激，例如低滲透或高滲透壓應激、輻射(如UV光、伽馬射線、微波)、超聲波、熱、低溫或化學應激(由例如氯或藥物產品引發)。濾渣培養物在適當生長條件下孵育(即培養)足夠長的時間以使膜上的活微生物增殖產生微菌落或菌落，或產生足量的生物分子如三磷酸腺苷以檢測微生物。通常，一個濾渣培養物在30-35°C有氧條件下培養，第二個濾渣培養物在30-35°C厭氧條件下培養，第三個濾渣培養物在20-25 °C有氧條件下培養。在一些實施方式中，濾渣培養物的培養時間足以使活微生物生成可檢測量的ATP， 如至少約200阿托摩爾ATP，至少約200飛摩爾ATP，至少約200皮摩爾ATP，或至少約200 納摩爾ATP。培養期可以是約2-7天、約2-8天、約2-9天、約2_10天、約2_11天、約2_12天、約2-13天、約6小時、約12小時、約1天、約2天、約3天、約4天、約5天或約6天。各單獨濾渣培養物的培養期可視情況而變，并非所有濾渣培養物都需要培養相同時間量。優選的培養時間根據待檢測的微生物而變化。濾渣培養物孵育后可使用任何適當方法如目測或優選使用合適測定檢測過濾膜上的活微生物細胞、微菌落或菌落。例如，發光測定(例如螢光素酶測定)可用于檢測活微生物細胞、微菌落或菌落。可采用任何合適方法或系統檢測發光，如電荷耦合器件相機、圖像處理器和/或圖像分析軟件。有利地，圖像分析軟件可用于定量測定或計數測定活微生物細胞、活微生物微菌落或活微生物菌落的數量。在一些實施方式中，發光測定例如螢光素酶測定用于檢測過濾膜上活微生物細胞、微菌落或菌落產生的三磷酸腺苷(ATP)。例如，將ATP釋放劑或生物發光劑(如含螢光素酶和熒光素的試劑)用于過濾膜，如果活細胞生成ATP則會發光。通過發光檢測ATP的合適試劑在本領域熟知且有市售 (例如密理弗(MILLIFLEX)快速試劑盒；馬薩諸塞州比爾里卡的密理博公司(Millipore Corporation))。在濾渣培養物孵育后也可檢測過濾膜上存在的活微生物細胞、微菌落或菌落，例如使用發光測定以檢測探針與微生物內源核酸的雜交。發光測定可包括過氧化物酶反應或其它適當反應。適于經過氧化物酶和其它酶活性產生發光的試劑已熟知且有市售。可使用的測定和檢測系統能檢測約10-100個酵母細胞或約1000個細菌細胞。所用測定和檢測系統優選能檢測單一細胞或少至約100個細胞。這可通過例如檢測微生物產生的ATP來完成。例如，當市售ATP生物發光測定與市售電荷耦合器件相機、圖像處理器和圖像分析軟件(密理弗(MILLIFLEX)快速微生物檢測和計數系統；馬薩諸塞州比爾里卡的密理博公司)聯用時，其可用于檢測約200阿托摩爾ATP，相當于約1個酵母或霉菌細胞或約100個細菌細胞。本文所述檢測方法適于評估可過濾組合物，如液體藥物組合物的無菌性。液體組合物包括含水組合物、懸浮液和乳液。液體藥物組合物可以是適合藥物用途的任何液體，包括例如胃腸外組合物、口服組合物、鼻用組合物或眼用組合物。液體組合物可以是疫苗。合適的疫苗包括例如炭疽疫苗(ANT)、卡介苗疫苗(BCG)、疏螺旋體病疫苗外表面蛋白A疫苗(BORospA)、白喉類毒素和破傷風類毒素疫苗(DT)、白喉類毒素和破傷風類毒素和百日咳疫苗(DTP)、用于兒童的白喉類毒素和破傷風類毒素和無細胞百日咳疫苗(DIPa)、用于成人的白喉類毒素和破傷風類毒素和無細胞百日咳疫苗(DrTPar)、白喉類毒素和破傷風類毒素和無細胞百日咳和乙型流感嗜血桿菌偶聯物疫苗(DIPa-HIB)、白喉類毒素和破傷風類毒素和無細胞百日咳和乙型流感嗜血桿菌偶聯物及脊髓灰質炎病毒滅活疫苗(DIPa-HIB-IPV)、甲肝病毒疫苗(HAV)、甲肝病毒和乙肝病毒疫苗(HAV-HBV)、 乙肝病毒疫苗(HBV)、幽門螺桿菌疫苗(HEL)、乙型流感嗜血桿菌疫苗(HIB)、乙型流感嗜血桿菌偶聯物疫苗(HIBcn)、乙型流感嗜血桿菌多糖疫苗(HIBps)、乙型流感嗜血桿菌疫苗(白喉CRRM197蛋白偶聯物，與白喉CRRM197毒素蛋白偶聯的寡糖；HIB-HbOC))、包括禽流感(例如H5N1、H1N3)和豬流感(例如H1N1)的流感病毒疫苗(INF)、流感病毒減毒活疫苗(IFNa)、鼻內流感病毒減毒活疫苗(INFan)、流感病毒滅活疫苗(INFi)、滅活流感病毒裂解疫苗(INFs)、滅活甲型和乙型流感三價病毒裂解疫苗(INFS-AB3)、流感全病毒疫苗(INFw)、脊髓灰質炎病毒滅活疫苗(IPV)、腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟菌)疫苗(MEN)、腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟菌)偶聯物疫苗(MENcn)、A，C血清群腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟菌)偶聯物疫苗(MENcn-AC)、A，C，Y，W-135血清群腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟菌)多糖疫苗 (MENps-ASYff)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒疫苗(MMR)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒和水痘病毒疫苗(MMR-VAR)、三價口服脊髓灰質炎病毒減毒活疫苗(OPV)、肺炎球菌(肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae))疫苗(PNU)、七價肺炎球菌(肺炎鏈球菌)偶聯物疫苗(PNUcn-7)、23價肺炎球菌(肺炎鏈球菌)多糖疫苗(PNUps_23)、脊髓灰質炎病毒疫苗(POL)、狂犬病疫苗(RAB)、人二倍體細胞狂犬病疫苗(RAB-HDCV)、純化雞胚細胞狂犬病疫苗(RAB-PCEC)、呼吸道合胞病毒疫苗(RSV)、天花疫苗(SMA)、天花(疫苗病毒)疫苗 (SMAvac)、白喉類毒素和破傷風類毒素(對于成人抗原量減少)疫苗(Td)、弓形蟲病(剛地弓形蟲(toxoplasm gondii))疫苗(TOX)、傷寒(傷寒沙門菌(Salmonella typhi))疫苗(TPD)、口服傷寒(傷寒沙門菌)減毒活疫苗Ty21a菌株(TPDa)、傷寒(傷寒沙門菌)熱和酚滅活干疫苗、傷寒(傷寒沙門菌)Vi莢膜多糖疫苗(TPD-Vi)、結核病(結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis))疫苗，非BCG(TUB)、水痘(雞痘、水痘帶狀皰疹病毒)疫苗(VAR)。合適的胃腸外組合物包括例如腺苷酸、前列地爾、硫酸阿米卡星、阿奇霉素、博來霉素、頭孢曲松、環丙沙星、順鉬、氮烯唑胺、鹽酸正丁霉素、甲磺酸去鐵胺、醋酸去氨加壓素、地爾硫卓、雙嘧達莫、阿霉素、依那普利拉、表柔比星、依前列醇鈉、氟康唑、磷酸氟達拉濱、磷酸氟達拉濱、氟馬西尼、鹽酸格拉司瓊、鹽酸伊達比星、異環磷酰胺、鹽酸伊立替康、亞葉酸鈣、醋酸亮丙瑞林、左卡尼汀、甲孕酮、美司鈉、甲基強的龍醋酸鹽、甲氧氯普胺、米托蒽醌、鹽酸納布啡、重酒石酸去甲腎上腺素、醋酸奧曲肽、昂丹司瓊、奧沙利鉬、催產素、紫杉醇、帕米膦酸二鈉、泮庫溴銨、溴苯腎上腺素(phenyl印hrine bromide)、鹽酸苯腎上腺素、 鹽酸異丙嗪、異丙酚、羅庫溴銨、磺胺甲嚼唑、舒馬坦琥珀酸鹽、硫酸特布他林、環戊丙酸睪酮、妥布霉素、維庫溴銨、硫酸長春新堿、酒石酸長春瑞濱和無菌鏈佐星粉末。合適的口服組合物包括例如醋氨酚和磷酸可待因片劑、醋氨酚乙酰唑胺片劑、阿昔洛韋膠囊、鹽酸氨洛林、鹽酸胺碘酮、苯磺酸氨氯地平和貝那普利膠囊、苯磺酸氨氯地平片劑、阿莫西林和克拉維酸鉀、阿莫西林、阿那格雷、去氧孕烯和炔雌醇片劑、阿斯匹林、阿替洛爾、左炔諾孕酮和炔雌醇片劑、阿奇霉素、巴氯芬、鹽酸貝那普利、苯佐那酯、甲磺酰苯扎托品、戊酸倍他米松、倍他米松雙丙酸酯、氯貝膽堿、比卡魯胺、富馬酸比索洛爾、鹽酸安非他酮、布地奈德吸入懸浮液、布美他尼、鹽酸苯丙胺、卡麥角林、碳酸鈣600、骨化三醇、檸檬酸鈣片劑、炔諾酮片劑、卡托普利和氫氯噻嗪片劑、卡托普利、卡馬西平、卡維地洛、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢地尼、頭孢丙烯、頭孢氨芐、色他金(certagen)、鹽酸西替利嗪、鹽酸利眠寧、馬來酸氯苯那敏、氯唑沙宗、克利諾(cholinoid)、西洛他唑、鹽酸西咪替丁、西咪替丁、環丙沙星、西酞普蘭、異維甲酸、克拉霉素、富馬酸氯馬斯汀、克林霉素、克羅米酚檸檬酸鹽、鹽酸克羅米酚、氯硝西泮、克霉唑、氯氮平、色甘酸鈉、鹽酸環苯扎林、環孢霉素、鹽酸賽庚啶、達那唑、鹽酸去甲金霉素、醋酸去氨加壓素、鹽酸右哌甲酯、硫酸右旋苯丙胺、地西泮、雙氯芬酸鉀、雙氯青霉素、去羥肌苷、鹽酸地爾硫卓、鹽酸苯海拉明、雙嘧達莫、磷酸丙吡胺、雙丙戊酸鈉、鹽酸多佐胺、甲磺酸多沙唑嗪、馬來酸依那普利、卡馬西平、艾司唑侖、雌二醇、雌酮硫酸酯哌嗪、鹽酸乙胺丁醇、乙琥胺、依托度酸、泛昔洛韋、法莫替丁、硫化亞鐵、 硫酸亞鐵、鹽酸非索非那定、非那雄胺、醋酸氟卡胺、氟康唑、醋酸氟氫可的松、醋酸氟輕松、氟西汀、氟比洛芬、氟他胺、氟伏沙明、福辛普利鈉、呋喃苯胺酸、加巴噴丁、氫溴酸加蘭他敏、吉非貝齊、格列美脲、格列吡嗪、硫酸鹽葡糖胺、格列本脲、氟哌啶醇、鹽酸胼屈嗪、氫氯噻嗪、二酒石酸氫可酮(hydrocondone bitartrate)、硫酸羥氯喹、羥基脲、鹽酸羥嗪、雙羥萘羥嗪、吲哚美辛、異煙胼、酮康唑、酮洛芬、酮咯酸氨基丁三醇、鹽酸拉貝洛爾、拉莫三嗪、 蘭索拉唑、來氟米特、亞葉酸鈣、左乙拉西坦、鹽酸利多卡因、賴諾普利、鹽酸洛哌丁胺、勞拉西泮、氯沙坦鉀洛伐他汀、甲苯達唑、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、美洛昔康、鹽酸呱替啶、 巰嘌呤、氨水楊酸、鹽酸二甲雙胍、甲氨蝶呤、甲基多巴、甲潑尼龍、甲氧氯普胺、酒石酸美托洛爾、甲硝唑、甲硝唑、美西律、鹽酸米洛環素、米氮平、米索前列醇、鹽酸莫普利(moeipril HCl)、莫匹羅星、麥考酚酸酯、萘丁美酮、納多洛爾、鹽酸鈉曲酮、萘普生、鹽酸尼法唑酮、硫酸新霉素、尼克酸、硝苯地平、尼莫地平、尼扎替丁、醋酸炔諾酮、鹽酸去甲替林、制霉菌素、 氧氟沙星、奧美拉唑、鹽酸昂丹司瓊、奧沙普秦、奧沙西泮、鹽酸奧昔布寧、羥考酮、鹽酸羥考酮、泮托拉唑鈉、帕羅西汀、青霉素V鉀、己酮可可堿、費尼基絲(phenylgesic)、吡羅昔康、 鹽酸普拉克索、普伐他汀鈉、鹽酸哌唑嗪、潑尼松龍、馬來酸丙氯拉嗪、鹽酸普羅帕酮、鹽酸丙氧芬、鹽酸普萘洛爾、鹽酸普羅替林、喹那普利、硫酸奎尼丁、雷米普利、鹽酸雷尼替丁、利巴韋林、利培酮、鹽酸羅匹尼羅、番瀉葉多庫脂鈉、森那金(sermagen)、硝酸銀、辛伐他汀、鹽酸索他洛爾、硫糖鋁、枸櫞酸他莫昔芬、鹽酸坦羅辛、鹽酸特拉唑嗪、鹽酸特比萘芬、鹽酸四環素、茶堿、鹽酸氯芐噻哌啶、托美丁鈉、托吡酯、托拉塞米、鹽酸曲馬多、群多普利、鹽酸曲唑酮、維甲酸、熊去氧膽酸、丙戊酸、鹽酸萬拉法新、鹽酸維拉帕米、華法林鈉、扎來普隆和酒石酸唑吡坦。合適的鼻用組合物包括例如鼻噴霧、抗偏頭痛藥物、肽藥物(激素治療)、麻醉藥、止吐劑、鎮靜藥、鹽酸氮卓斯汀、鹽酸羥甲唑啉、鹽酸苯腎上腺素(pheynyl印hrine hydrochloride)、鹽水溶液、糠酸莫米松、布地奈德、異丙托溴銨和色甘酸鈉鼻噴霧。合適的眼用組合物包括例如利多卡因、丙美卡因、丁卡因、酮咯酸氨丁三醇滴眼液、酮咯酸氨丁三醇、萘甲唑林眼藥、溴莫尼定、阿奇霉素、苯磺酸貝他斯汀、貝西沙星、鹽酸左旋倍他洛爾、可速普特、二氟潑尼酯、露達舒、雷珠單抗、貝美前列素、他尼鈉、氧氟沙星、 地塞米松、左氧氟沙星、烏諾前列酮滴眼液、環孢霉素眼用乳液、香堿、曲伏前列素滴眼液、 鹽酸纈更昔洛韋、曲氟尿苷、西多福韋、維替泊芬、更昔洛韋玻璃體內植入劑、福米韋生和富馬酸酮替芬滴眼液。本文所述方法可用任何適當裝置或設備進行，可以手動或自動化。在一個優選方面，本方法用市售的密理弗快速微生物檢測系統進行，該系統包括樣品準備臺、自動噴霧臺、檢測塔、圖像分析儀、CCD相機和帶有軟件的計算機(馬薩諸塞州比爾里卡的密理博公司)。另一方面，本發明是用本文所述方法篩選過活微生物的無菌藥物組合物(例如疫苗、眼用組合物、鼻用組合物、口服組合物、胃腸外組合物)。
實施例產牛ATCCIf株禾Π來iΦ.^, .^mmMm(^iMaK^.^Aa^Mfe,^i勿負荷量禾n^ifi式驗 似虧染)mwmm來自冷凍培養物(ATCC菌株)或直接來自平板(環境分離物)的微生物在胰蛋白酶大豆肉湯或固體培養基(例如沙氏葡萄糖瓊脂(Sabouraud Dextrose agar))中培養適當時間。用MicroSeq系統(美國應用生物系統公司(Applied Biosystems))進行各菌株的基因型鑒定。然后，培養物以800x G離心20-30分鐘并將沉淀重懸于保護培養基(含15% 甘油的0xoid-CM67)。稀釋培養物，監測固體培養基上的CFU(菌落形成單位)并將其加入 2ml能克凍存管(Nunc Cryotube) 小瓶，_80°C保存。表1顯示所用微生物的完整列表。表 1
酵母/霉菌革蘭氏陽性孢子菌革蘭氏陰性菌革蘭氏陽性球菌革蘭氏陽性桿菌黑曲霉 ATCC 16404枯草芽孢桿菌 ATCC 6633大腸桿菌 ATCC 8739金黃色葡萄球菌 ATCC 6538瘡皰丙酸桿菌 HK-WST白色念珠菌 ATCC 10231地衣芽孢桿菌 HK-WST (2006)銅綠假單胞菌 ATCC 9027庫克菌屬 HK-WST非發酵棒桿菌 HK-WST青霉菌屬 HK-WST生孢梭菌ATCC 11437洛菲不動桿菌 HK-WST (2005)表皮葡萄球菌 HK-WST克勞氏芽孢桿菌 HK-WST奧斯陸莫拉菌 HK-WST沃氏葡萄球菌 HK-WST短小芽孢桿菌 HK-WST頭狀葡萄球菌 HK-WST球形芽孢桿菌 HK-WST藤黃微球菌 HK-WST病研所芽孢桿菌 HK-WSTA.應激因子研究通過施加UV光Q40-250 μ ff/cm2)、熱(50-70°C水浴)或在胃腸外藥物系列稀釋中各培養微生物1-10分鐘，以便造成應激，每分鐘取等分樣品。應激肓接施加給100CFU以下范圍的測試微生物液體懸浮液。通過CFU減少量監測應激效果，用平板計數方法和OD測
量法確定。平板計數將應激微生物接種于胰蛋白酶大豆肉湯，通過每分鐘析出等分樣品來監測應激的不同效果(應激施加1-10分鐘，每分鐘取等分樣品)。2-7天后計數測定結果 (取決于菌株，例如在2天后計數測定最新的大腸桿菌和黑曲霉，瘡皰丙酸桿菌計數測定不能早于培養后6天)。測量了引起CFU初始接種量減少量超過50%所需的確切時間。OD測量(λ = 600nm)測試微生物的過夜培養物首先受到應激(使用在彡50%減少量研究中確定的應激參數)，接種胰蛋白酶大豆肉湯或液體巰基醋酸鹽培養基(約3- 106CFU/ml)并在長達8小時的時間框內分析(每小時取等分樣品以測量光密度)。培養在搖床上進行(僅好氧菌株)。比較應激培養物與非應激培養物。50%減少量的應激因子研究結果對于22種菌株中的每一種微生物，測試了 3種應激參數。測量了引起CFU初始接種量減少超過50%所需的各應激因子確切參數(1和10分鐘之間)。所測3種應激參數是 UV光、熱和在用于胃腸外的胃腸外藥品中的微生物培養。例如，熱引起細胞質膜損傷，RNA變性且這導致一些細胞死亡。UV光引起突變和DNA復制停止(M. Mrus，Rocz PanstwZakl Hig. ,48(3) :263-268(1997))。給予胃腸外藥品在微生物細胞中引起化學應激-長期以來已知胃腸外藥品的抗微生物特性。圖1-3給出了奧斯陸莫拉菌、大腸桿菌和洛菲不動桿菌所得數據的例子。對于22種微生物菌株中的每一種，發現了使初始接種量減少> 50%所需的應激參數。在一些情況中觀察到菌落形態發生改變(菌落生長更慢，但稍后恢復正常菌落大小)。例如，藤黃微球菌顯示菌落尺寸減小[圖如和4b]。對于快速無菌試驗的培養基評估，重要的是不僅使用廣泛范圍的微生物，而且使用處于應激狀態的這些微生物。一些應激因子如由胃腸外藥品引起的化學應激和施加UV 光引起的輻射應激，大幅減少接種微生物的量。相反，熱處理導致一些測試微生物的初始生長率降低。據報道，熱損傷細胞恢復時間為3-4小時-這在本研究中得到確認(EWarseck， Appl. Microbiol. ,26 :919-922 (1973))。熱應激不可用于孢子菌，其它應激參數也不可行， 因為孢子菌顯示針對應激的廣泛抗性(P. Setlo, T. Appl. Microbiol. , 101 (3) :514-525綜述Q006))。例如，短小芽孢桿菌用作輻射指示細菌(T. Wong, PDA T Pharm Sci Technol., 58(1) :6-14(2004))。在孢子菌的情況中，使用一種不同的“應激”因子-通過營養耗盡對其施加應激并因而誘導更高孢子含量。隨后的營養培養基評估和統計學分析顯示施樂血瓊脂是用于無菌試驗的最佳固體培養基。用于分析20-25°C與30-35°C有氧培養之間差異的t檢驗顯示在溫度間有顯著差異。由于40種情況中有11種差異顯著，所以需要在快速無菌試驗中驗證2種培養溫度。OD 測量在>50%減少量研究中確定的應激參數用于各測試菌株。一直比較應激接種物與非應激接種物。微生物(約3- 106CFU/ml作為初始接種物)接種于胰蛋白酶大豆肉湯或液體巰基醋酸鹽培養基并在搖床上30-35°C培養(僅好氧菌株)。每小時取等分樣品并測量光密度U = 600nm)。不同處理的接種物(未處理、熱處理、UV光處理、胃腸外藥品處理，來自50%減少量實驗的時間/參數)所得數據顯示在OD測量數據的正態圖中生長曲線稍有差異[圖5]。數據的對數圖[圖6]顯示熱處理對大腸桿菌生長曲線的影響且使數據獨立于接種量。由于這不易精確控制，對數圖的優勢就在于此。當細菌受到UV光或胃腸外藥品處理 (使用50%減少量實驗中確定的參數)應激時，沒有觀察到生長的顯著差異。斜率比較顯示僅熱處理(參數如50%減少量實驗所確定)對微生物生長率有影響且微生物顯示實際應激。在培養基評估期間不使用UV光和胃腸外藥品稀釋(“殺傷因子” 而非“應激因子”)。通過使用直線和比較斜率最詳細顯示了生長率應激。所有微生物菌株在選擇范圍內顯示生長斜率降低。本文所示例子是大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和短小芽孢桿菌。在大腸桿菌的情況中，生長斜率減少約3小時，說明此微生物需要約3小時恢復[圖7]。金黃色葡萄球菌顯示生長斜率在4小時的時間框內減少[圖8]。酵母白色念珠菌顯示甚至更長的持續應激。生長斜率保持減少超過8小時，應激培養物過夜后恢復正常生長斜率[圖9]。對于革蘭氏陽性孢子菌，熱應激不可行。由于其它應激因子UV光和胃腸外藥品稀
12釋不顯示對微生物的應激效果，需要發現用于孢子菌的另外應激。對于芽孢桿菌和梭菌，激發細菌懸液中更高的孢子含量并進行OD測量[圖10]。通過營養耗盡和在2-8°C保存過度生長的微生物培養物6天以上來形成孢子。以所述方式測試所有微生物。僅在3種情況中觀察到困難。霉菌青霉菌和曲霉菌在液體培養基中以菌絲體生長，因此可能無法測定確切的0D。由于數據可用于白色念珠菌和所有測試微生物，只能假定青霉菌和曲霉菌表現方式相同。因此，取測試參數用于培養基評估。在另一種情況中，對于瘡皰丙酸桿菌(此菌株在FTM中生長較好)，通過平板計數確定的減少> 50%的參數不能在OD測量實驗中重現。相較來自> 50%減少量實驗的參數， 僅在延長時間中省略應激時觀察到生長的時間延遲。由于氧應激較高，瘡皰丙酸桿菌可能在OD測量中顯示不同結果。對于OD測量，每小時取等分樣品，產生針對疫皰丙酸桿菌的一定氧應激。所得應激因子研究數據概括于表2。
權利要求
1.一種檢測藥物組合物中活微生物的方法，所述方法包括a)提供可過濾的藥物組合物；b)過濾所述藥物組合物以提供至少三個其上沉積所述藥物組合物過濾渣的過濾膜；c)將所述至少三個過濾膜置于固體培養基上以產生至少三個濾渣培養物；d)i)在20-25°C有氧條件下培養至少一個濾渣培養物；ii)在30-35°C有氧條件下培養至少一個濾渣培養物和iii)在30-35°C厭氧條件下培養至少一個濾渣培養物；條件是所述濾渣培養物的培養期均不大于約13天；和e)檢測膜上的活微生物細胞、微菌落或菌落，其中膜上存在活微生物細胞、微菌落或菌落指示所述藥物組合物中存在活微生物。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述b)還包括在過濾所述藥物組合物后過濾洗液。
3.如權利要求1或2所述方法，其特征在于，所述膜是聚偏二氟乙烯膜、玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜、聚對苯二甲酸乙二酯膜、混合纖維素酯(醋酸纖維素和硝酸纖維素)、磷酸纖維素膜、DEAE膜、尼龍網膜或聚四氟乙烯膜。
4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述膜具有約0.45 μ m的孔徑。
5.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述固體培養基選自FTM-A(含 1. 075%瓊脂(終濃度)的液體巰基醋酸鹽培養基)、BHI (腦心浸液瓊脂)、蒂福科釀酒厭氧瓊脂、R2A瓊脂、施樂血瓊脂、開索-瓊脂ICR(胰蛋白酶大豆瓊脂)、有5%血的哥倫比亞瓊脂和⑶C厭氧血瓊脂。
6.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述d)中濾渣培養物的培養時間足以生成可檢測量的ATP。
7.如權利要求6所述方法，其特征在于，所述濾渣培養物培養約2-7天。
8.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述e)中活微生物細胞、微菌落或菌落用發光測定檢測。
9.如權利要求8所述方法，其特征在于，所述發光測定檢測所述膜上活微生物細胞、微菌落或菌落生成的三磷酸腺苷(ATP)。
10.如權利要求8所述方法，其特征在于，所述發光測定包括螢光素酶測定。
11.如權利要求8所述方法，其特征在于，所述發光測定檢測探針與微生物內源核酸之間形成的核酸雜交產物。
12.如權利要求11所述方法，其特征在于，所述發光測定包括過氧化物酶反應。
13.如權利要求8到12中任一項所述方法，其特征在于，所述發光用電荷耦合器件相機和圖像分析軟件檢測。
14.如權利要求8到13中任一項所述方法，其特征在于，對所述活微生物細胞、活微生物微菌落或活微生物菌落進行計數。
15.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述藥物組合物是液體組合物。
16.如權利要求15所述方法，其特征在于，所述液體組合物是胃腸外組合物、口服組合物、鼻用組合物或眼用組合物。
17.如權利要求15所述方法，其特征在于，所述液體組合物是疫苗。
18.如權利要求17所述方法，其特征在于，所述疫苗選自炭疽疫苗；結核病疫苗；疏螺旋體病疫苗；白喉類毒素和破傷風類毒素疫苗；白喉類毒素和破傷風類毒素和百日咳疫苗；白喉類毒素和破傷風類毒素和無細胞百日咳疫苗；白喉類毒素和破傷風類毒素和無細胞百日咳和乙型流感嗜血桿菌偶聯物疫苗；白喉類毒素和破傷風類毒素和無細胞百日咳和乙型流感嗜血桿菌偶聯物及脊髓灰質炎病毒滅活疫苗；甲肝病毒疫苗；甲肝病毒和乙肝病毒疫苗；乙肝病毒疫苗；幽門螺桿菌疫苗；乙型流感嗜血桿菌疫苗；流感病毒疫苗；脊髓灰質炎病毒疫苗；腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟菌)疫苗；麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒疫苗； 麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒和水痘病毒疫苗；肺炎球菌(肺炎鏈球菌)疫苗；狂犬病疫苗；呼吸道合胞病毒疫苗；天花疫苗；弓形蟲病(剛地弓形蟲)疫苗；傷寒(傷寒沙門菌) 疫苗；結核病(結核分枝桿菌)疫苗；水痘(雞痘、水痘帶狀皰疹病毒)疫苗。
19.如權利要求17所述方法，其特征在于，所述疫苗是禽流感疫苗或豬流感疫苗。
20.一種檢測藥物組合物中活微生物的方法，所述方法包括a)提供可過濾的藥物組合物；b)過濾所述藥物組合物以提供至少三個其上沉積所述藥物組合物濾渣的膜；c)將所述至少三個濾器/膜置于固體培養基上以產生至少三個濾渣培養物；d)i)在20-25°C有氧條件下培養至少一個濾渣培養物；ii)在30-35°C有氧條件下培養至少一個濾渣培養物和iii)在30-35°C厭氧條件下培養至少一個濾渣培養物；條件是所述濾渣培養物的培養期均不大于約13天；和e)檢測所述膜上的三磷酸腺苷(ATP)，其中膜上存在ATP指示所述藥物組合物中存在活微生物。
21.一種無菌藥物組合物，其中所述藥物組合物經過活微生物篩選，并用前述權利要求中任一項所述的方法確認無菌性。
全文摘要
本發明涉及一種檢測藥物組合物中活微生物的方法，包括步驟提供可過濾的藥物組合物；過濾藥物組合物以提供至少三個其上沉積藥物組合物的膜，將三個膜置于固體培養基上以產生至少三個濾渣培養物，在有氧和無氧條件下培養并檢測活微生物細胞、微菌落或菌落，其中膜上存在活細胞、微菌落或菌落指示藥物組合物中存在活微生物。
文檔編號C12Q1/22GK102414324SQ201080020162
公開日2012年4月11日 申請日期2010年5月4日 優先權日2009年5月4日
發明者A·斯泰克, J·C·格雷, M·貝希托爾德 申請人:諾華有限公司