專利名稱：化學連接依賴性的探針擴增(clpa)的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用化學連接檢測樣品中的核酸的組合物和方法。
背景技術：
本發明涉及用于檢測樣品中存在的一種或多種核酸靶物的組合物、儀器和方法。 特定核酸的檢測是診斷醫學和分子生物學研究的一種重要工具。基因探針測定法目前在下述方面起作用鑒別傳染性生物體諸如細菌和病毒、探測正常基因和突變基因的表達以及鑒別與疾病或損傷有關的基因(諸如癌基因)、在組織移植之前分型組織的相容性、匹配用于法醫學的組織或血液樣品、對緊急響應情形(如核事故或流行性流感暴發)做出響應、測定疾病預后或病因、和探查來自不同物種的基因之間的同源性。理想地，基因探針測定法應當是靈敏的、特異性的和可容易地自動化的(關于綜述，參見 Nickerson，Current Opinion in Biotechnology (1993) 4 :48-51)。通過開發聚合酶鏈式反應(PCR)和允許研究人員在分析之前指數地擴增特定核酸序列的其它擴增技術，已經極大地減輕了對靈敏度(即低檢測限)的要求(關于綜述，參見Abramson等人， Current Opinion in Biotechnology, (1993)4:41-47)。例如，已經證實，對 SNP 基因座進行多重PCR擴增并隨后與寡核苷酸陣列雜交，是同時對數百個SNP進行基因分型的準確的且可靠的方法(參見Wang等人，Science, (1998)280 :1077 ；也參見khafer等人，Nature Biotechnology, (1989) 16 :33-39)。特異性也是許多目前可利用的基因探針測定法的一個問題。探針和靶物之間的分子互補性程度決定了相互作用的特異性。雜交反應中探針、靶物和鹽的組成和濃度的變化以及反應溫度和探針長度都可以改變探針/靶物相互作用的特異性。在有些情況下，區分具有精確互補性的靶物和具有錯配的靶物是可能的，盡管在使用傳統技術的情況下這通常是非常困難的，因為反應條件的小變動會改變雜交。對于錯配檢測具有必要的特異性的更新的技術包括探針消化測定法(其中錯配會建立探針切割位點)和DNA連接測定法(其中單點錯配會阻止連接)。多種酶的和非酶的方法可用于檢測序列變動。基于酶的方法的實例包括 Invader 、寡核苷酸連接測定法(OLA)、單堿基延伸方法、等位基因PCR、和競爭探針分析 (例如通過雜交進行競爭測序)。酶法DNA連接反應是本領域眾所周知的(Landegren， Bioessays (1993) 15(11) :761-5 ；Pritchard 等人，Nucleic Acids Res. (1997)25(17) 3403-7 ；mi等人，Genomics，(1989)4(4) :560-9)，且已經廣泛地用于SNP檢測、酶擴增反應和DNA修復。
已經開發了許多非酶的或模板介導的化學連接方法，它們可以用于檢測序列變動。這些方法包括化學連接方法，該方法使用偶聯劑，諸如N-氰基咪唑、溴化氰、和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)_碳二亞胺氫氯化物。參見Metelev，V. G.，等人，Nucleosides & Nucleotides (1999) 18 :2711 ；Luebke, K. J.，和 Dervan，P. B. J. Am. Chem. Soc. (1989) 111 8733 ；和 Shabarova，Z. A.，等人，Nucleic Acids Research (1991) 19 :4247，它們各自通過引用整體并入本文。Kool (美國專利號7，033，753，它通過引用整體并入本文)描述了化學連接和熒光共振能量轉移(FRET)用于檢測遺傳多態性的應用。在該方法中，讀數是基于熒光強度的溶液相變化。Terbrueggen (美國專利申請60/746，897，它通過引用整體并入本文)描述了化學連接方法、組合物和試劑用于通過微陣列檢測來檢測核酸的應用。其它化學連接方法使5’ -甲苯磺酸酯或5’ -碘代基團與3’ -硫代磷酸酯基團反應，產生用硫替代成橋的磷酸二酯氧原子之一的DNA結構。參見Gryanov， S. Μ.，禾口 Letsinger，R. L.，Nucleic Acids Research(1993) 21:1403 ；Xu, Y.禾口 Kool， Ε.T.Tetrahedron Letters(1997)38 :5595 ；禾口 Xu， Y.禾口 Kool， Ε.Τ. ， Nucleic Acids Research (1999) 27 :875，它們各自通過引用整體并入本文。使用非酶方法進行核酸靶物檢測的一些優點包括對非天然的DNA類似物結構的更低靈敏度，能夠使用RNA靶序列，在不同條件下更低的成本和更大的穩健性。Letsinger 等人(美國專利號5，780，613，通過引用整體并入本文)以前已經描述了鄰近的模板-結合的寡核苷酸的不可逆的、非酶的、共價的自連接(autoligation)，其中一個寡核苷酸具有 5’可取代的基團，另一個寡核苷酸具有3’硫代磷酰基基團。PCT 申請 TO 95/15971、PCT/US96/09769、PCT/US97/09739、PCT US99/01705、 W096/40712和W098/20162 (它們都特別地通過引用整體并入本文)描述了新穎的組合物， 其包含含有電子轉移部分的核酸，包括電極，其可以實現新穎的核酸雜交檢測方法。已經獲得增加的重要性的一種技術包括使用DNA陣列(Marshal 1等人，Nat Biotechnol. (1998) 16(1) :27-31)，特別是對于包括同時測量多種核酸靶物的用途。DNA 陣列最經常用于基因表達監測，其中同時測量1至100，000個核酸靶物(mRNA)的相對濃度。DNA陣列是小裝置，其中核酸錨定探針以在生產時就已知的獨特方式連接在表面上 (Marshall等人，Nat Biotechnol. (1998) 16(1) :27-31)，或可以在以后準確地譯解，諸如在珠子陣列的情況下(Steemers 等人，Nat Biotechnol. (2000) 18(1) :91-4 ；和 Yang 等人， Genome Res. (2001) 11(11) :1888-98.)。在一系列上游處理步驟后，使目標樣品接觸DNA陣列，樣品中的核酸靶物與表面上的錨定寡核苷酸雜交，并測定樣品中靶核酸的同一性，且經常測定樣品中靶核酸的濃度。許多目前使用的核酸檢測方法具有阻礙它們的廣泛適用性的特征和/或限制。例如，在DNA微陣列的情況下，在使樣品接觸微陣列之前，通常必須對樣品進行一系列處理步驟。盡管這些步驟隨陣列的生產商和/或用于讀出陣列的技術(熒光、電化學、化學發光、 磁阻、懸臂梁偏轉、表面等離子體共振)而異，這些處理步驟通常歸入一些總類別核酸分離和純化、酶擴增、可檢測標記摻入、和擴增后凈化。其它常見的步驟是樣品濃縮、擴增的靶物片段化(從而減小核酸靶物的平均大小)、和外切核酸酶消化(以將PCR擴增的靶物轉化成單鏈物質)。對于使DNA陣列接觸樣品之前的許多上游處理步驟的需求，可以顯著增加通過這些方法來檢測核酸靶物的時間和成本。還對得到的數據的質量具有顯著影響。例如，有些擴增操作對靶物降解是非常敏感的，如果輸入的核酸材料沒有較好地保藏，則會表現得較差(R)ss等人，Diagn Mol Pathol. (1994)3(3) :148-55)。可以消除或減少上游處理步驟的數目和/或復雜性的技術，能夠顯著降低成本，并提高從DNA陣列實驗得到的結果的質量。 一種用于減少上游處理步驟的方法包括，使用連接反應來增加信號強度和提高特異性。仍然需要用于有效的且特異性的核酸檢測的方法和組合物。因此，本發明為非酶的化學連接反應提供了方法和組合物，它們會提供非常快速的靶物檢測，并極大地簡化檢測和測量核酸靶物的過程。
發明內容
因此，在一個方面，本發明涉及一種方法，所述方法包括提供連接底物和第一連接探針和第二連接探針，所述連接底物包含至少含有第一靶結構域和第二靶結構域的靶核酸序列。所述連接探針可以包含可變長度和/或序列的填充序列。所述第一連接探針包含與所述第一靶結構域基本上互補的第一探針結構域和5’-連接部分。所述第二連接探針包含與所述第二靶結構域基本上互補的第二探針結構域和3’連接部分。任選地，所述第一靶結構域和所述第二靶結構域被至少一個核苷酸隔開。任選地，所述第一連接探針和所述第二連接探針中的至少一個包含錨序列和/或標記，包括標記探針結合序列。在沒有外源加入的連接酶存在下，連接所述第一連接探針和第二連接探針，以形成連接產物。所述連接的產物可以任選地被捕獲在基質上并進行檢測，所述基質包含與所述錨序列基本上互補的捕獲探針。通過毛細管電泳、微陣列分析、或任意其它合適的方法，可以擴增和檢測連接產物。
圖1. CLPA-CE試驗的一個實施方案的示意圖。圖2. CLPA-MDM試驗的一個實施方案的示意圖。圖3.該示意圖顯示了 2-探針和3-探針CLPA反應的一個實施方案。圖4. DNA合成樹脂的示意圖，所述DNA合成樹脂可以用于生產具有3’ -DABSYL離去基團的DNA。圖5. CLPA-CE試驗的一個實施方案的方法流程的示意圖。圖6.該示意圖顯示了用于CLPA試驗的探針設計，其中摻入了大小不同的填充序列。圖7.通過CLPA-CE分析的樣品的電泳分離曲線。圖8.靶物濃度和峰高在CLPA-CE分析中的線性關系。
具體實施例方式除非另有說明，本發明的實踐可以采用有機化學、聚合物技術、分子生物學(包括重組技術)、細胞生物學、生物化學、和免疫學的常規技術和描述，它們都在本領域的技能范圍內。這樣的常規技術包括聚合物陣列合成、雜交、連接、和使用標記檢測雜交。通過參考下文的實施例，可以獲得適當技術的具體實例。但是，也可以使用其它等效的常規操作。這樣的常規技術和描述可以參見標準的實驗室手冊，諸如Genome Analysis =A Laboratory Manual Series (第 I-IV 卷)，Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cells A Laboratory Manual, PCR Primer :A Laboratory Manual, and Molecular Cloning A Laboratory Manual (都由 Cold Spring Harbor Laboratory Press 出版)，Stryer, L. (1995) Biochemistry (第 4 版)Freeman, New York, Gait,"Oligonucleotide Synthesis A Practical Approach，，1984, IRL Press, London, Nelson and Cox(2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 第 3 版，W. H. Freeman Pub. , New York, N. Y.禾口 Berg 等人 Q002)Biochemistry，第 5 版，W. H. Freeman Pub.，New York, N. Y.，它們都通過引用為了所有目的整體并入本文。此外，在本申請中引用的所有參考文獻都通過引用為了所有目的整體并入本文。概述本發明提供了用于檢測樣品中的一種或多種核酸靶物(包括DNA和RNA靶物)的組合物、儀器和方法。此外，所述樣品無需進行純化。實際上，本發明的一個方面涉及分析不純的樣品，包括身體樣品，例如、但不限于全血。本發明提供了使用2種或更多種寡核苷酸探針的方法，所述探針彼此緊密靠近地可逆地結合靶核酸，并具有互補的反應性連接部分 (應當指出，如本文另外所述，所述反應部分在本文中稱作“連接部分”)。當探針已經以適當取向結合靶物時，它們能夠發生自發的化學連接反應，該反應產生連接的寡核苷酸產物。 在連接以后，產生新的產物，其可以通過酶或化學反應進行擴增。在優選的實施方案中，化學連接反應會連接在它們上具有PCR引物位點的2種探針，例如通用的PCR引物。另外，在本發明的一個實施方案中，一種或兩種連接探針含有填充序列或可變的間隔序列，其設計成對于每個探針集合(即每個靶序列)具有不同長度，由此產生具有靶物-特異性的長度的連接產物。在連接以后，現在可以通過PCR指數地擴增確定長度的寡核苷酸。根據本發明的一個方面，所述探針可以具有可檢測的標記(熒光標記、電化學標記、磁珠、納米顆粒、 生物素)，以輔助鑒別、純化、定量或檢測連接的寡核苷酸產物。所述探針還可以在它們的結構中任選地包括用于以后捕獲在固體支持物(微陣列、微珠、納米顆粒)上的錨定寡核苷酸序列、促進連接的產物的濃縮或操作的分子手柄(磁性顆粒、寡核苷酸編碼序列)、和促進連接的產物的后續第二次擴增(通過酶，如DNA或RNA聚合酶)的啟動子序列。本發明的連接反應快速進行，對目標靶物是特異性的，且可以產生每種靶物的連接產物的多個拷貝， 導致可檢測信號的放大(有時在本文中稱作“產物周轉”)。本發明的連接反應不要求存在外源加入的連接酶，也不要求額外的酶，盡管有些第二反應可能依賴于諸如聚合酶等酶的使用，如下面所述。從許多以前描述的化學部分，可以選擇連接化學試劑。優選的化學試劑是這樣的試劑，其可以容易地整合進常規生產技術，在儲存期間是穩定的，并在整合進適當設計的連接探針集合中時表現出對靶物特異性連接的大偏好。另外，對于包括以后通過酶進行擴增的實施方案，產生可以通過酶來有效地處理的連接產物的連接化學試劑和探針設計(包括非天然的核苷酸類似物)是優選的。靶物的擴增還可以包括連接產物的周轉，其中所述連接產物對模板或靶核酸具有比單個連接探針更低的或相當的親和力。因而，在連接雜交的探針以后，連接產物從靶物釋放出來，釋放出靶物以用作新的連接反應的模板。在一個實施方案中，本發明的連接反應包括轉移反應。在該實施方案中，所述探針
8與靶序列雜交，但是，不是寡核苷酸探針連接到一起形成連接產物，而是發生核酸-指導的分子實體(包括報告分子諸如熒光團、猝滅劑等)從一個寡核苷酸探針轉移至其它寡核苷酸探針。該轉移反應類似于連接反應，但是不是連接2個或更多個探針，而是一個探針連接至轉移分子，另一個探針是化學反應的“離去基團”。我們使用術語“轉移”反應來區分得到的終產物的不同性質。重要的是，類似于連接反應，通過轉移探針在核酸靶物上的近端結合，會促進轉移反應，使得只有在探針已經彼此足夠緊密靠近(例如，在鄰近位點，以發生轉移反應)地與靶核酸雜交的情況下，才可檢測到顯著的信號。樣品因此，在一個方面，本發明提供了用于檢測靶序列在樣品中是否存在的組合物和方法。本領域技術人員會理解，樣品溶液可以包含任意數目的物質，包括、但不限于，體液 (包括、但不限于基本上任意生物體的血液、尿、血清、淋巴、唾液、肛門和陰道分泌物、汗和精液，其中哺乳動物樣品是優選的，人樣品是特別優選的)；環境樣品(包括、但不限于，空氣、農業、水和土壤樣品)；植物材料；生物戰劑樣品；研究樣品(例如，樣品可以是擴增反應(例如基因組DNA的一般擴增)的產物)；純化的樣品，諸如純化的基因組DNA、RNA、蛋白等；粗樣品(細菌、病毒、基因組DNA等)；本領域技術人員會理解，可以已經對樣品進行了基本上任意的實驗操作。有些實施方案使用siRNA和microRNA作為靶序列(Siang等人，J Cell Physiol. (2007)210(2) :279-89 ；Osada 等人，Carcinogenesis. (2007)28(1) :2-12 ； 和Mattes等人，Am JRespir Cell Mol Biol. (2007)36(1) :8_12，它們各自通過引用整體并入本文)。本發明的有些實施方案使用來自儲存的(例如冷凍的和/或存檔的)或新鮮的組織的核酸樣品。石蠟包埋的樣品特別適用于許多實施方案，因為對于諸如診斷和預后，這些樣品可以是非常有用的，這是由于存在與樣品有關的額外數據。本文所述的固定的和石蠟包埋的組織樣品表示可儲存的或可存檔的組織樣品。大多數來自患者的病理學樣品常規地被固定和石蠟包埋，以允許進行組織學分析和隨后的可存檔的儲存。這樣的樣品經常不可用于傳統的核酸檢測方法，因為這樣的研究要求核酸樣品的高完整性，才能準確地測量核酸表達。經常，石蠟-包埋的樣品中的基因表達研究限于定性監測，其中使用免疫組織化學染色來監測蛋白表達水平。本發明的方法和組合物可以用于檢測來自石蠟-包埋的樣品的核酸，因為在石蠟中固定和包埋的過程經常導致樣品的核酸的降解。本發明能夠擴增和檢測甚至降解的樣品，諸如在石蠟-包埋的樣品中發現的那些。存在許多用于純化來自固定的石蠟-包埋的樣品的核酸的技術，如在WO 2007/133703中所述，其整個內容通過引用并入本文。在一個優選的實施方案中，靶分析物是核酸。“核酸”或“寡核苷酸”或語法等同描述在本文中是指至少2個共價地連接到一起的核苷酸。本發明的核酸通常含有磷酸二酯鍵(例如在靶序列的情況下)，盡管在下述的某些情況下，包括核酸類似物，它們可能具有替代主鏈(特別對于與連接探針一起使用)，所述主鏈包含，例如，磷酰胺(Beaucage 等人，Tetrahedron (1993) 49 (10) :1925 和其中的參考文獻；Letsinger, J. Org. Chem. (1970)35 3800 ；Sprinzl 等人，Eur. J. Biochem. (1977)81 :579 ；Letsinger 等人，Nucl. Acids Res. (1986) 14 :3487 ；Sawai 等人，Chem. Lett. (1984) 805 ；Letsinger 等人，J. Am.Chem. Soc. (1988) 110 :4470 ；和 Pauwels 等人，Chemica Scripta (1986) 26 :141)、硫代磷酸酯(Mag 等人，Nucl. Acids Res. (1991) 19 :1437 ；和美國專利號 5，644，048)、二硫代磷酸酯(Briu 等人，J. Am. Chem. Soc. (1989) 111 :2321),0-甲基亞磷酰胺連接(參見 Eckstein, Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approach, Oxford University Press)、 和肽核酸主鏈和連接(參見 Egholm, J. Am. Chem. Soc. (1992) 114 :1895 ；Meier 等人， Chem. Int. Ed. Engl. (1992)31 :1008 ；Nielsen, Nature, (1993)365 :566 ； Car Is son 等人， Nature (1996) 380 :207，它們都通過引用整體并入本文)。其它類似物核酸包括具有二環結構的那些，包括鎖定的核酸(Koshkin等人，J. Am. Chem. Soc. (1998) 120:13252 3)；正主鏈(Denpcy 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1995)92 :6097 ；非離子型主鏈(美國專利號 5，386，023,5, 637，684,5, 602，240,5, 216，141 和 4，469，863 ；Kiedrowshi 等人，Angew. Chem. Intl. Ed. English (1991) 30 :423 ；Letsinger 等人，J. Am. Chem. Soc. (1988) 110 :4470 ； Letsinger 等人，Nucleoside & Nucleotide (1994) 13 1597 ；第 2 和 3 章，ASC Symposium Series 580, Y. S. Sanghui 禾口 P. Dan Cook 編；Mesmaeker 等人，Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. (1994)4 :395 Jeffs 等人，J. Biomolecular NMR(1994) 34 :17 ;Xu 等人， Tetrahedron Lett. (1996)37:74 和非核糖主鏈，包括在下述文獻中所述的那些美國專利號 5，235，033 和 5，034，506，和第 6 和 7 章，ASC Symposium Series 580，Y. S. Sanghui 和P. Dan Cook編。在核酸的定義內也包括含有一個或多個碳環糖的核酸(參見Jenkins 等人，Chem. Soc. Rev. (1995)第 169-176 頁)。幾種核酸類似物描述在Rawls, C & E News Jim. 2，1997第35頁。所有這些參考文獻特別地通過引用并入本文。可以進行核糖-磷酸酯主鏈的這些修飾，以便利標記或其它部分的添加，以增加或減小這樣的分子在生理環境中的穩定性和半衰期等。本領域技術人員會理解，所有這些核酸類似物可以用于本發明中。另外，可以制備天然存在的核酸和類似物的混合物；例如，在連接部分位點處，可以使用類似物結構。或者， 可以制備不同的核酸類似物的混合物，和天然存在的核酸和類似物的混合物。核酸類似物可以包括，例如，肽核酸(PNA，WO 92/20702，通過引用整體并入本文) 和鎖定的核酸(LNA，Koshkin AA 等人 ^Tetrahedron (1998) M :3607-3630.，Koshkin AA 等人 J. Am. Chem. Soc. (1998) 120 :13252-13253. ,Wahlestedt C 等人 PNAS (2000) 97 :5633-5638, 它們各自通過引用整體并入本文)。在有些應用中，這類的類似物主鏈可以表現出提高的雜交動力學、提高的熱穩定性和提高的對錯配序列的靈敏度。所述核酸可以是單鏈的或雙鏈的(如指出的)，或含有雙鏈序列或單鏈序列的一部分。所述核酸可以是DNA(基因組DNA和cDNA)、RNA或雜合體，其中所述核酸含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任意組合和堿基的任意組合，包括天然存在的核苷堿基(尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤)和非天然存在的核苷堿基(肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、5-甲基胞嘧啶、假異胞嘧啶、2-硫代尿嘧啶和2-硫代胸腺嘧啶、 2-氨基嘌呤、N9- (2-氨基-6-氯嘌呤)、N9- (2,6- 二氨基嘌呤)、次黃嘌呤、N9- (7-脫氮-鳥嘌呤)、N9- (7-脫氮-8-氮雜-鳥嘌呤)和N8- (7-脫氮-8-氮雜-腺嘌呤)。5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫代-5-丙炔基-尿嘧啶)等。本文使用的術語“核苷堿基”包括“核苷”和“核苷酸”和核酸類似物的單體。因而，例如，肽核酸的單個單位(各自含有堿基)在本文中稱作核苷堿基。
在一個方面，本發明的連接探針是這樣的任意聚合物質其能夠以序列特異性的方式與核酸靶物相互作用，并具有允許所述探針與具有互補化學部分的另一聚合物質發生自發化學連接反應的化學部分。在一個實施方案中，所述寡核苷酸探針可以是DNA、RNA、 PNA、LNA、前述物質的修飾形式和/或它們的任意雜合體(例如DNA/RNA雜合體、DNA/LNA 雜合體、DNA/PNA雜合體)。在一個優選的實施方案中，所述寡核苷酸探針是DNA或RNA寡核苷酸。在檢測或雜交之前，通常使在靶序列區域不以單鏈狀態存在的核酸樣品(例如靶序列)在這樣的區域成為單鏈。通常，使用熱變性，可以使核酸樣品在靶序列區域成為單鏈。對于通過擴增得到的多核苷酸，適用于產生單鏈擴增產物的方法是優選的。適用于產生單鏈擴增產物多核苷酸的擴增方法的非限制性實例包括、但不限于T7 RNA聚合酶失控轉錄、RCA、不對稱的 PCR(Bachmann 等人，Nucleic Acid Res. (1990) 18 1309)和不同步 PCR(W0 01/94638)。通常已知的使雙鏈多核苷酸區域成為單鏈的方法，諸如使用PNA打開劑(美國專利號6，265, 166)，也可以用于在多核苷酸上產生單鏈靶序列。在一個方面，本發明提供了檢測靶序列的方法。“靶序列”或“靶核酸”或語法等同描述在本文中是指核酸單鏈上的核酸序列。靶序列可以是基因的一部分、調節序列、基因組 DNA、cDNA、RNA (包括mRNA、MicroRNA和rRNA)或其它。如本文所述,靶序列可以是來自樣品的靶序列或第二靶物，諸如擴增反應產物等。它可以是任意長度，應當理解，序列越長，特異性越大。本領域技術人員會理解，互補靶序列可以是許多形式。例如，它可以被包含在更大的核酸序列(即全部或一部分基因或mRNA、質粒或基因組DNA的限制片段以及其它)內。在有些實施方案中，所述靶序列包含不同類型的靶結構域。例如，樣品靶序列的第一靶結構域可以與第一連接探針雜交，靶序列中的第二靶結構域可以與第二連接探針雜交。其它靶結構域可以與基質(諸如陣列)上的捕獲探針或標記探針等雜交。如下面更完整地描述的，靶結構域可以是相鄰的或隔開的(如指出的)。在某些情況下，當檢測是基于連接且應用需要放大信號時，連接探針可以利用連接物，且可以被靶序列的一個或更多個核苷堿基隔開，以賦予連接的產物雜交不穩定性。在其它應用中，例如在單核苷酸多態性(SNP)檢測中，或在轉移反應中，所述連接探針可以與靶序列的鄰近核苷堿基雜交。除非指出，術語“第一”和“第二”無意賦予關于靶序列的5' -3'取向的序列取向。例如，假定互補靶序列的5' -3'取向，第一靶結構域可以位于第二結構域的5'側或第二結構域的3'。為了容易參照，且非限制性地，這些結構域有時稱作“上游”和“下游”， 常規約定是，靶序列以5’至3’取向放置。將探針設計成，使得當所述探針在空間上緊密靠近地結合靶多核苷酸的一部分時，在探針之間發生化學連接反應。一般而言，所述探針包含化學反應部分(在本文中通常稱作“連接部分”)，并以特定取向結合靶多核苷酸，使得化學反應部分在空間上緊密靠近， 從而導致自發的連接反應。探針組分在一個實施方案中，本發明提供了連接探針集合，通常是第一連接探針和第二連接探針的集合，盡管如本文所述，有些實施方案使用超過兩種。另外，如本文指出的，在有些情況下，進行轉移反應而不是連接；“連接探針”包括“轉移探針”。每個連接探針包含核酸部分，有時在本文中稱作“探針結構域”，其與靶結構域之一基本上互補。本發明的探針設計成與靶序列互補，使得發生靶序列和本發明的探針的雜交。如本文所述，該互補性不需要是精確的；可能存在任意數目的堿基對錯配，它們會干擾靶序列和本發明的探針之間的雜交。但是，如果突變的數目過大使得在甚至最低嚴謹性的雜交條件下也不能發生雜交，所述序列不是互補序列。因而，“基本上互補的”在本文中是指，所述探針與靶序列充分互補，以在正常反應條件下雜交。“同一的”序列是這樣的序列在較短的核苷堿基序列的長度范圍內，存在精確的互補性。在本發明的一個方面，將探針的長度設計成隨著靶序列的長度、需要的特異性、反應(例如連接或轉移)和雜交和洗滌條件而變化。通常，在該方面，連接探針是約5至約150 個核苷堿基，其中約15至約100個是優選的，約25至約75個是特別優選的。一般而言，這些長度同樣適用于連接和轉移探針。在本發明的另一個實施方案(在本文中稱作“CLPA-CE”，在下面更完整地描述) 中，將探針長度設計成隨每種目標靶物而變化，從而產生可以基于長度差異而鑒別和分析的連接產物。多種雜交條件可以用于本發明中，包括高、中和低嚴謹性條件；參見例如 Maniatis 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版，1989,禾口 Ausubel,等人，Short Protocols in Molecular Biology，通過引用并入本文。如本領域已知的，當使用非離子型主鏈(例如PNA)時，雜交條件也可以變化。連接部分除了連接結構域以外，本發明的連接探針具有連接部分。因此，在一個方面，本發明涉及化學連接方法，所述方法包括在使得第一連接探針和第二連接探針的連接部分能夠自發地反應的條件下，至少使第一連接探針和第二連接探針結合靶核酸，以形成“連接底物”，從而在沒有外源性的連接酶存在下(也就是說，沒有向反應物中加入外源性的連接酶)，將探針連接到一起。在轉移反應的情況下，這可以稱作“連接底物”或“轉移底物”。 “連接底物”在本文中是指包含至少一個靶核酸序列和兩個或更多個連接探針的化學連接底物。類似地，在“連接底物”的定義內包括“轉移底物”，其包含至少一個靶核酸序列和兩個或更多個轉移探針。在本發明的有些實施方案中，例如當需要額外的特異性時，可以使用超過兩個連接探針。在該實施方案中，“中間的”連接探針也可以是鄰近的，或被靶序列的一個或多個核苷堿基隔開。在一個優選的實施方案中，所述連接反應不要求存在連接酶，并在沒有任何添加(例如外源的)連接酶存在下在結合的探針之間自發地發生。本發明的寡核苷酸探針被設計成是對多核苷酸靶物特異性的。這些探針會在空間上彼此緊密靠近地結合靶物，并以使化學反應部分在空間上緊密靠近的方式取向。在一個方面，2個或更多個探針被設計成結合靶多核苷酸上的鄰近位點。在一個優選的實施方案中，2個探針結合靶物，使得在一個寡核苷酸探針的5’末端處的連接部分能夠與在其它探針的3’末端處的連接部分相互作用。在適當條件下，化學連接可以自發地發生，無需加入任何額外的活化劑或刺激。或者，可以使用“活化”劑或外部刺激來促進化學連接反應。活化劑的實例包括、但不限于 碳二亞胺、溴化氰(BrCN)、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/胱胺、N-氰基咪唑、二硫蘇糖醇 (DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和其它還原劑以及外部刺激如紫外光、熱和/或壓力變化。
如本文所述，本發明的連接部分可以采取多種構型，這取決于許多因素。本文所述的大部分化學試劑被用于亞磷酰胺反應中，該反應通常以3’至5’方向進行。也就是說，樹脂含有這樣的化學試劑，其允許在分子的5’末端連接亞磷酰胺。但是，如本領域已知的，亞磷酰胺可以用于以5’至3’方向進行；因而，本發明包括具有與本文所述的那些相反的取向的部分。每個連接探針(或轉移探針)集合含有一組第一連接部分和第二連接部分。這些連接部分對的鑒別依賴于要使用的連接的化學試劑。另外，如本文所述，在探針結構域和一個或兩個連接探針的連接部分之間可以存在連接物(包括但不限于去穩定化連接物)。一般而言，為了便于討論，本文的描述可以使用術語“上游”和“下游”連接探針，盡管這無意進行限制。髓胃絲,仆岸i·在本發明的一個實施方案中，所述化學試劑是基于5’鹵素離去基團技術，諸如一般地描述在Gryanov, S. M.，禾口 Letsinger，R. L. ， (1993) Nucleic Acids Research, 21 1403 ；Xu, Y.和 Kool，Ε. T. (1997) Tetrahedron Letters, 38 :5595 ；Xu, Y.和 Kool，Ε. T.， (1999)Nucleic Acids Research, 27 875 ；Arar φ 人，(1995)，BioConj. Chem.，6 :573 ； Kool, Ε. T.等人，(2001)Nature Biotechnol 19 148 ；Kool, Ε. T.等人，(1995)Nucleic Acids Res, 23 (17) 3547 ；Letsinger 等人，美國專利號 5, 476, 930 ；Shouten 等人，美國專利號6，955，901 ；Andersen等人，美國專利號7，153，658，它們都特別地通過引用并入本文。 在該實施方案中，所述第一連接探針在它的5’末端處包括具有5’離去基團的核苷，且所述第二連接探針在它的3’末端處包括具有3’親核基團(諸如3’硫代磷酰基)的核苷。所述5’離去基團可以包括本領域技術人員已知的許多常見的離去基團，包括，例如鹵素物質 (I、Br、Cl)和基團，諸如 Abe 和 Kool，J.Am. Chem. Soc. (2004) 126 13980-13986 (通過引用整體并入本文)所述的那些。在本發明的該方面的一個更優選的實施方案中，所述第一連接探針具有通過柔性連接物連接的5’離去基團和具有3’硫代磷酰基的下游寡核苷酸。該構型會導致反應速率的顯著提高，并導致針對每個靶物產生連接產物的多個拷貝。“上游”寡核苷酸(按照多核苷酸模板的5'至3'方向被定義為結合在模板的 “上游”側(即，左側或5'側)的寡核苷酸)包括5'-離去基團作為它的5'末端。可以使用能夠參與、2反應的任意離去基團，所述、2反應包含硫、硒、或碲作為親核體。離去基團是這樣的原子或基團其連接在碳上，使得在修飾的磷酰基的親核體(硫、硒或碲) 對碳原子進行親核攻擊以后，所述離去基團作為陰離子離開。合適的離去基團包括，但不限于鹵化物(諸如碘化物、溴化物或氯化物)、甲苯磺酸酯、苯磺酸酯或對硝基苯基酯以及RSO3，其中R是苯基或被1至5個原子或基團取代的苯基，所述原子或基團包括F、Cl、 Br、I、烷基(C1-C6)、硝基、氰基、磺酰基和羰基，或R是具有1至6個碳的烷基。所述離去基團優選地是碘化物，且在DNA的情況下，在上游寡核苷酸的5'末端處的核苷是5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧核苷。合適的5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧核苷的實例包括、 但不限于5'-脫氧-5'-碘胸苷(5' -I-T)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧胞苷 (5' -I-dC)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧腺苷(5' -I-dA)、5'-脫氧 _5'-碘 _3_ 脫氮-2'-脫氧腺苷(5' -1-3-脫氮-dA)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧鳥苷(5' -I-dG) 和5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮-2'-脫氧鳥苷(5' -1-3-脫氮-dG)、和它們的亞磷酰胺衍生物(參見圖幻。在RNA寡核苷酸的情況下，合適的5'-脫氧-5'-碘核苷的類似實例包括、但不限于5'-脫氧-5'-碘尿嘧啶(5' -I-U)、5'-脫氧-5'-碘胞苷(5' -I-C)、 5'-脫氧-5'-碘腺苷(5‘ -I-A)、5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮腺苷(5‘ -1-3-脫氮-A)、 5'-脫氧-5'-碘鳥苷(5 ‘ -I-G)和5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮鳥苷(5 ‘ -1-3-脫氮-G)、和它們的亞磷酰胺衍生物。在一個優選的實施方案中，上游連接探針含有2'-脫氧核糖核苷酸，但是在5'末端上的修飾的核苷酸(其包含5'離去基團)是核糖核苷酸。 上游核苷酸的該實施方案是有利的，因為倒數第二位的2'-脫氧核糖核苷酸和末端5'核糖核苷酸之間的鍵對使用堿的切割是敏感的。這允許潛在地重復使用寡核苷酸探針，所述探針例如結合在固體支持物上，如下面更詳細地描述的。參照下面更完整地描述的CLPA試驗，“上游”探針的5’離去基團最優選地是DABSYL。“下游”寡核苷酸(其結合在上游寡核苷酸“下游”(即，3'側)的多核苷酸模板)包括具有連接在它的3'羥基上的下述基團的核苷作為它的3'末端硫代磷酸酯基團(即，“3'-硫代磷酸酯基團”)、硒代磷酸酯基團(即，“3'-硒代磷酸酯基團)、或碲代磷酸酯基團(即，“3'-碲代磷酸酯基團”)。用于自動連接的化學試劑因而是硫-介導的、硒-介導的、或碲-介導的。自-連接產生這樣的連接產物其含有5'橋連的硫代磷酸酯(一O--P(O) (0. sup. -)—S—)、硒代磷酸酯(一O--P(O) (0. sup. -)—Se—)或碲代磷酸酯 (-0--P (0)(0. sup.-)-Te-)，如構成下游寡核苷酸的3'末端的基團所指示的。該非天然的、非手性的橋連二酯位于兩個鄰近的核苷酸之間，并替代天然存在的5'橋連的磷酸二酯。令人驚奇地，硒-介導的連接速率是硫-介導的連接的3-4倍，且含有硒的連接產物是非常穩定的，盡管Se—P鍵的鍵強度更低。此外，預見到橋連的硒代磷酸酯以及橋連的碲代磷酸酯在非常溫和的條件下可被銀或汞離子選擇性地切割(參見Mag等人，Nucleic Acids Res. (1991)19 :14371441)。在一個實施方案中，下游寡核苷酸含有2'-脫氧核糖核苷酸，但是在3'末端上的修飾的核苷酸(其包含3'硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、或碲代磷酸酯)是核糖核苷酸。上游核苷酸的該實施方案是有利的，因為倒數第二位的2'-脫氧核糖核苷酸和末端核糖核苷酸之間的鍵對使用堿的切割是敏感的，這允許潛在地重復使用寡核苷酸探針，所述探針例如結合在固體支持物上。參照下面更完整地描述的CLPA試驗，“下游”探針最優選地在它的3’末端處包括3’ -硫代磷酸酯。應當指出，“上游”和“下游”寡核苷酸可以任選地構成單個寡核苷酸的兩個末端， 在該情況下，連接會產生環狀連接產物。在線性前體寡核苷酸的5'和3'末端上的結合區必須通過許多插入核苷酸進行連接，所述插入核苷酸足以允許5'和3'結合區與多核苷酸靶物結合。本發明提供的組合物包括5'-脫氧-5」碘-2'-脫氧核苷，例如5'-脫氧-5'-碘胸苷(5' -I-T)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧胞苷(5' -I_dC)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧腺苷(5' -I-dA)、5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮-2'-脫氧腺苷(5' -1-3-脫氮-dA)、5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧鳥苷(5 ‘ -I-dG)和5 ‘-脫氧-5'-碘-3-脫氮-2'-脫氧鳥苷(5' -1-3-脫氮-dG)、和它們的亞磷酰胺衍生物，以及包含本發明的5'-脫氧-5'-碘-2'-脫氧核苷作為它的5'末端的寡核苷酸。本發明提供的組合物另外包括5'-脫氧-5'-碘核苷，諸如5'-脫氧-5'-碘尿嘧啶(5' -I-U)、5'-脫氧-5'-碘胞苷(5' -1-0,5'-脫氧-5'-碘腺苷(5' -1-A)、 5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮腺苷(5‘ -1-3-脫氮-A)、5'-脫氧_5'-碘鳥苷(5‘ -I-G) 和5'-脫氧-5'-碘-3-脫氮鳥苷(5' -1-3-脫氮-G)、和它們的亞磷酰胺衍生物，以及包含本發明的5'-脫氧-5'-碘核苷作為它的5'末端的寡核苷酸。本發明也包括含有3'-硒代磷酸酯基團或3'-碲代磷酸酯基團的核苷，和包含含有3'-硒代磷酸酯基團或3'-碲代磷酸酯基團的核苷作為它的3'末端的寡核苷酸。本發明也包括含有這些種類的修飾的核苷中的任一種或兩種的寡核苷酸，以及制備不同的核苷和寡核苷酸的方法。根據本發明在5'或3'末端中的任一個或兩個處被修飾的寡核苷酸任選地、但不一定包括可檢測的標記，優選放射性標記、熒光能供體或受體基團、受激子標記、或它們的任意組合。另外，在某些情況下，取代基也可以是保護基(有時在本文中稱作“PG”)。合適的保護基取決于要保護的原子和所述部分將要暴露的條件。多種保護基是已知的；例如，DMT 經常被用作亞磷酰胺化學法(如在附圖中所描繪的)中的保護基；但是，在這些實施方案中，DMT可以被其它保護基替換。多種保護基是合適的；關于保護基和有關的化學法，參見例如，Greene' s Protective Groups in Organic Synthesis，它通過弓|用并入本文。“烷基”或語法等同描述在本文中是指直鏈或支鏈烷基，其中直鏈烷基是優選的。 如果是分支的，它可以在一個或多個位置處分支，且除非指出，在任意位置處分支。烷基可以具有約1至約30個碳原子(C1-C30)，一個優選的實施方案使用約1至約20個碳原子 (C1-C20)，其中約Cl至約C12至約C15是優選的，且Cl至C5是特別優選的，盡管在有些實施方案中，烷基可以大得多。在烷基的定義內也包括環烷基，諸如C5和C6環和含有氮、氧、 硫或磷的雜環。烷基也包括雜烷基，其中硫、氧、氮、和硅雜原子是優選的。烷基包括取代的烷基。“取代的烷基”在本文中是指另外含有一個或多個上面定義的取代部分“R”的烷基。“氨基”或語法等同描述在本文中是指NH2、-NHR和一NR2基團，其中R如本文所定義。在有些實施方案中，例如在肽連接反應的情況下，伯胺和仲胺具有特定用途，其中伯胺通常表現出更快的反應速率。“硝基”在本文中是指一NO2基團。“含有硫的部分”在本文中是指含有硫原子的化合物，所述硫原子包括但不限于， 硫雜_、硫代-和磺基-化合物、硫醇(一SH和一SR)、和硫化物(--RSR--)。含有硫的部分的一種具體類型是硫代酸酯(-(CO)-S-)，通常作為取代的硫代酸酯(-(CO)-SR)存在。“含有磷的部分”在本文中是指含有磷的化合物，所述磷包括、但不限于膦和磷酸鹽。“含有硅的部分”在本文中是指含有硅的化合物。“醚”在本文中是指一O--R基團。優選的醚包括烷氧基，其中一O--(CH2)2CH3 和一0— (CH2) 4CH3是優選的。“酯”在本文中是指一C00R基團。“鹵素”在本文中是指溴、碘、氯、或氟。優選的取代的烷基是部分地或完全地鹵代的烷基，諸如CF3等。“醛”在本文中是指一RC0H基團。“醇”在本文中是指一OH基團和烷基醇一R0H。“酰氨基”在本文中是指一RC0NH—或RC0NR—基團。
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“乙二醇”在本文中是指一(O--CH2--CH2)n-基團，盡管亞乙基的每個碳原子也可以是單取代的或雙取代的，即一(O--CR2--CR2)n--,其中R如上所述。用其它雜原子替代氧的乙二醇衍生物(即一(N--CH2--CH2)n-或一(S--CH2--CH2)n-或含有取代基團)也是優選的。另外，在有些實施方案中，所述R基團可以是官能團，包括猝滅劑、去穩定化部分和熒光團(如下面所定義)。在該實施方案中特別有用的熒光團包括、但不限于熒光素和它的衍生物、TAMRA(四甲基-6-羧基羅丹明)、Alexa染料、和菁染料(例如Cy3和Cy5)。猝滅劑部分或分子是本領域已知的，且通常是可以滅活另一分子的激發態的芳族多環化合物。熒光團-猝滅劑對是本領域眾所周知的。合適的猝滅劑部分包括、但不限于 Dabsyl (二甲氨基(偶氮苯)磺酰基)、Dabcyl (二甲氨基(偶氮苯)羰基)、遮蔽猝滅劑 (Glen Research Catalog)和來自 Biosearch Technologies 的黑洞猝滅劑(BHQ-1、BHQ-2 和 BHQ-3)。合適的去穩定化部分在下面予以討論，包括、但不限于導致寡核苷酸向它的靶部位的總結合能降低的分子實體。潛在的實例包括、但不限于烷基鏈、帶電荷的復合物、和環結構。親核體連接部分在該實施方案中，其它的連接探針包含含有親核體(諸如胺)的連接部分。含有硫醇和胺的連接部分特別適用于某些反應。一般而言，親核體連接部分可以包括多種潛在的氨基、硫醇化合物，只要所述親核體連接部分含有在伯氨基或仲氨基附近的硫醇基，且相對定位使得，在S至N酰基轉移過程中，可以實現至少5或6元環過渡態。因此，包含1，2或1，3胺硫醇基的親核體連接分子特別適用。當反應時間比較重要時，伯胺可以用于有些實施方案中，因為伯胺的反應時間通常比仲胺更快，盡管仲胺可以用于下面討論的促成去穩定化的酰基轉移酶反應。氨基和硫醇基之間的碳可以被非氫的R 基團取代，盡管每個碳通常僅使用一個非氫的R基團。另外，鄰近的R基團(在圖*0中描繪為R’和R”)可以連接在一起以形成環狀結構，包括取代的和未取代的環烷基和芳基，包括雜環烷基和雜芳基，和它們的取代的和未取代的衍生物。在使用1，2氨基硫醇基并連接鄰近的R基團的情況下，通常優選的是鄰近的R基團形成環烷基(包括雜環烷基和它們的取代的衍生物)，而不是芳基。在該實施方案中，為了去穩定化而造成鏈的4 ο鍵收縮，置換連接部分依賴于酰基轉移酶反應。連接物在許多實施方案中，可以任選地在連接探針內的多個位置處包括連接物(有時在本文中顯示為“L”或“-(連接物) -，其中11是0或1)。合適的連接物包括烷基和芳基，包括雜烷基和雜芳基，和它們的取代衍生物。在有些情況下，例如當進行天然的肽連接反應時，連接物可以是基于氨基酸的和/或含有酰胺鍵。如本文所述，有些連接物允許連接探針被一個或多個核苷堿基隔開，從而在連接產物內形成無堿基位點，它們用作如下所述的去穩定化部分。去穩定化部分根據本發明的一個方面，希望在沒有酶輔助下，為每個靶物分子生產連接產物的多個拷貝。實現該目的的一種方法包括，在化學連接反應以后，使連接的產物脫離靶物，以允許新的探針集合結合靶物。為了增加連接產物周轉，增加產物從靶物分子脫離的探針設計、儀器使用、和化學連接反應化學法是合乎需要的。以前的工作已經證實了一種實現產物脫離和增加產物周轉的方法是“熱循環”反應混合物。熱循環是改變反應溫度、從而促進希望的結果的過程。最常見地，熱循環采取下述形式簡單地升高反應混合物的溫度，使得反應溫度高于連接產物的解鏈溫度短時間段， 從而造成產物脫離靶物。在冷卻后，一組新的探針能夠結合靶物，并發生另一個連接反應。 該熱循環操作已經廣泛地用于酶反應，如PCR。盡管熱循環是實現產物周轉的一種方法，可以設計探針，使得在沒有熱循環下存在顯著的產物周轉。通過減少反應循環的產物抑制，有助于降低連接產物的解鏈溫度的探針設計和連接化學會增加產物周轉。因此，在一個方面，將探針設計成包括這樣的元件(例如去穩定化部分)，其在連接探針后，用于去穩定化連接產物與靶序列的雜交。結果，在連接后，連接的底物脫離，從而導致連接產物(例如包含從靶序列脫離的2個連接探針的連接產物)的周轉，而釋放出靶序列以用于與另一個探針集合雜交。另外，提高游離的(例如未雜交的)連接探針的濃度，也可以幫助驅動向連接產物 (或轉移產物)從靶序列的釋放的平衡。因此，本發明的有些實施方案使用比靶物濃度高 1，000, 000倍的探針濃度，而在其它實施方案中，探針濃度比靶物濃度高10，000至100倍。 本領域技術人員會理解，提高游離探針的濃度可以單獨使用，或與本文所述的任意實施方案一起使用，以實現產物周轉(例如擴增)。盡管提高探針濃度可以導致增加的產物周轉， 它也可以導致顯著的脫靶反應，諸如探針水解和非靶物介導的連接。在一個方面，探針元件包括降低連接產物的解鏈溫度的結構。在有些實施方案中， 將探針元件設計成與非鄰近的靶物核苷堿基雜交，例如在2個雜交的但是未連接的探針之間存在“缺口 ”。一般而言，這通過在探針結構域和連接部分之間使用一個或兩個連接物來實現。也就是說，在第一探針結構域和第一連接部分之間可以存在連接物，在第二探針結構域和第二連接部分之間可以存在連接物，或兩種情況都存在。在有些實施方案中，所述缺口包含單個核苷堿基，盡管也可以根據需要使用更多個核苷堿基。本領域技術人員會理解，在反應動力學和連接物長度之間可以存在折衷；如果連接物的長度太長，使得在動力學上不利于產生連接的接觸，則可能需要更短的連接物。但是，在某些情況下，當動力學不重要時， 缺口的長度和得到的連接物可以更長，以允許跨1至10個核苷堿基的缺口。通常，在該實施方案中，重要的是，連接物的長度與缺口中核苷堿基的數目大致對應。在本發明的該實施方案的另一個方面，與靶序列相比無堿基位點在連接產物中的形成用于去穩定化雙鏈體。例如，Abe 和Kool (J. Am. Chem. Soc. (2004) 126 :13980-13986)對比了當使2種不同的8-聚體寡核苷酸探針(Bu42和DT40)與相同的7-聚體探針(Thio 4) 連接時的周轉。當使Thio4與DT40連接時，形成具有幾乎天然的DNA結構的連續的15-聚體寡核苷酸探針，其與DNA靶物精確匹配。但是，當使Thio4與Bu42連接時，形成15-聚體寡核苷酸探針，但是當該探針結合靶物時，它在中間具有被烷烴連接物跨過的無堿基位點。 對比這兩種探針當結合靶物時的解鏈溫度(Tm)，顯示出解鏈溫度相差大約12°C (Bu4k是 58.5°C，而DT40是70.7°C )。解鏈溫度的該12°C差異導致當探針集合(10，000-倍過量，ΙΟμΜ濃度)相對于靶物(InM)而言非常過量地存在時在25°C的產物周轉增加約10-倍 (91.6-Bu42，8. 2DT40)。類似地，Dose等人(Dose 2006)證實，兩個相同序列、化學連接的 PNA探針的Tm的4°C降低(53°C和57°C )導致產物周轉增加大約4-倍。近期的工作已經證實了基于化學連接的猝滅的自動-連接(QUAL)探針用于監測 RNA表達和檢測細菌和人細胞內的單堿基錯配的應用(W0 2004/0101011，通過引用并入本文)。在一個實施方案中，去穩定化部分是基于穩定化部分的去除。也就是說，如果連接探針含有穩定化它與靶物的雜交的部分，在連接和釋放穩定化部分以后，連接產物的穩定性存在下降。因此，一種用于減少產物抑制的一般方案是開發這樣的探針其在最初的化學連接反應過程中或在連接后的后續反應以后，釋放出分子實體，如小溝結合分子。根據寡核苷酸序列，小溝結合劑如Kutyavin (Kutyavin 1997和Kutyavin 2000)所述的二氫吡咯并吲哚三肽(DPI3)可以使與寡核苷酸探針的末端綴合時雙鏈體核酸的Tm提高最多40°C。相比而言，DPI3的未連接形式僅使相同雙鏈體的Tm提高了 2°C左右。因而，小溝結合劑可以用于產生具有增強的結合強度的探針集合，但是，如果小溝結合劑在反應過程中被釋放，結合增強會損失，且連接產物會表現出比小溝結合劑仍然連接的探針降低的Tm。合適的小溝結合分子包括、但不限于二氫吡咯并吲哚三肽(DPI3)、偏端霉素A、和吡咯-咪唑聚酰胺類(Gottesfeld, J. M.，等人，J. Mol. Biol. (2001) 309 :615-629)。除了小溝結合分子以外，連接的嵌入劑和有關的分子也可以顯著提高寡核苷酸雙鏈體的解鏈溫度，且該穩定作用在未連接的狀態時明顯更小(Dogan，等人，J. Am. Chem Soc. (2004)126 :4762-4763 和 Narayanan，等人，Nucleic Acids Research, (2004)32 2901-2911)。類似地，本領域技術人員會理解，具有連接的能夠形成三螺旋的寡核苷酸片段 (DNA、PNA、LNA等)的探針可以用作穩定化部分，其在釋放后，導致連接產物對靶序列的穩定作用減小(Pooga，M，等人，Biomolecular Engineering (2001) 17 183-192)。另一個用于通過降低連接產物的結合強度來減少產物抑制的一般方案是，在連接點處摻入無堿基位點。該方案以前已經被Abe (J.Am. Chem. Soc. (2004) 126 :13980-13986) 證實，但是，還可以設計后續探針重排，以進一步放大Tm的降低，這通過強化連接的探針和靶物之間的比對來實現。例如，Dose等人(Org. Letters (2005) 7 20 4365-4368)證實，將 PNA堿基之間的間隔從理想的12σ鍵變成13的連接后重排，導致Tm降低了 4°C。更大的重排和干擾產物與靶物的結合或導致寡核苷酸堿基減少的后續反應，可以進一步降低Tm。本發明提供了用于連接反應的方法和組合物，所述連接反應導致重排過程中最多 4 σ鍵的鏈收縮，與使用Dose所述的化學法的1堿基放大相比，這對重排后Tm具有顯著影響。該化學法是基于以前已經描述的酰基轉移反應(acyl transfer auxiliary) (Offer等人，J Am Chem Soc. (2002) 124(17) :4642-6)。在鏈收縮結束后，產生游離的硫醇，其能夠與單獨的分子或與它自身發生另一個反應。例如，該硫醇可以與內部的硫代酸酯反應，以嚴重地扭結寡核苷酸，并從而進一步降低連接產物的結合靶物的能力。因而，在該實施方案中，釋放出會與連接產物發生第二反應的官能團的連接反應， 可以降低連接產物和靶序列的雜合體的穩定作用。連接探針的其它官能團
除了靶結構域、連接部分、和任選的連接物以外，一個或多個本發明的連接探針可以具有額外的官能團，包括、但不限于啟動子和引物序列(或其互補序列(complement)， 取決于試驗)、標記(包括標記探針結合序列和錨序列)。在下文中參照CLPA試驗，描述了其它官能團，包括可變間隔序列(也稱作填充序列)。在本發明的一個方面，上游寡核苷酸探針可以具有啟動子位點或引物結合位點， 用于后續的酶擴增反應。在一個實施方案中，所述上游探針含有RNA聚合酶(例如T7、SP6 或T3)的啟動子序列。在另一個實施方案中，上游和下游寡核苷酸都含有引物結合序列。啟動子和引物結合序列被設計成不會在任何可察覺的程度上與核酸靶物相互作用。在一個優選的實施方案中，當同時檢測多種靶物時，在反應物中的所有寡核苷酸探針集合被設計成含有相同的啟動子或引物對結合位點，使得在適當的連接和純化以后，所有連接產物可以使用相同的酶和/或相同的引物同時擴增。在一個實施方案中，一個或多個連接探針包含啟動子序列。在采用啟動子序列的實施方案中，啟動子序列或它的互補序列具有足以允許適當的聚合酶與它相互作用的長度。除了其它地方以外，在Sambrook和Russell中，可以發現對于聚合酶相互作用而言足夠長的序列的詳細描述。在某些實施方案中，擴增方法包括至少一個擴增循環，例如、但不限于，下述的先后操作使聚合酶與啟動子相互作用；使用聚合酶，以模板-依賴性的方式合成核苷酸鏈；和變性新形成的核酸雙鏈體，以分離鏈。在另一個實施方案中，一種或兩種連接探針包含引物序列。如下所述，本發明的連接產物可以用于其它反應諸如酶擴增反應中。在一個實施方案中，所述連接探針包括引物序列，所述引物序列設計成允許額外的擴增水平。本文使用的術語“引物”表示這樣的核苷酸序列，無論是天然存在的(如在純化的限制性消化中)，還是合成地產生的當置于一定條件下時，所述核苷酸序列能夠作為核酸序列合成的起點，在所述條件中會誘導合成與核酸鏈互補的引物延伸產物，即存在在適當緩沖液(“緩沖液”包括PH、離子強度、輔因子等) 中的不同的三磷酸核苷酸和聚合酶，并在合適的溫度。可以修飾引物的一個或多個核苷酸， 例如，通過添加甲基、生物素或地高辛配基部分、熒光標簽或通過使用放射性的核苷酸。引物序列不需要反映精確的模板序列。例如，可以將非互補的核苷酸片段連接至引物的5'末端，剩余的引物序列與靶物鏈基本上互補。通過使用幾種引發序列和引物，第一連接產物可以用作其它連接產物的模板。這些引物序列可以用作PCR反應的引發位點，所述PCR反應可以用于擴增連接產物。除了 PCR 反應以外，其它擴增方法可以利用引發序列，包括但不限于連接酶鏈反應、Invader 、通過切口平移實現的定位擴增(NICK)、引物延伸/切口平移、和本領域已知的其它方法。本文使用的“擴增”表示特定核酸的拷貝數的增加。在體外在擴增反應中制備的特定核酸的拷貝稱作“擴增子”或“擴增產物”。擴增也可以通過第二連接反應而發生，其中引物位點用作新的連接探針集合的雜交位點，所述連接探針可能包含或不包含與產生最初連接產物的第一連接探針集合相同的序列。因而通過在隨后的擴增循環中擴增連接產物，可以指數地擴增靶序列。在本發明的該方面的另一個實施方案中，所述引物序列用于嵌套的連接反應。在這樣的嵌套的連接反應中，使用本文所述的方法，實現第一連接反應，使得連接產物可以被捕獲(例如通過使用生物素化的引物)到希望的鏈上，和捕獲在用抗生蛋白鏈菌素包被的珠子(特別是磁珠)上。在捕獲連接產物以后，通過使連接探針與在一部分連接產物內的引物序列雜交而實現第二連接反應，所述一部分連接產物在空間上分離自連接在捕獲珠、 探針等上的連接產物的末端(即，在其下游)。第二連接反應的至少一種引物序列將位于與連接探針互補的連接產物區內，所述連接探針不是包括錨序列或捕獲序列的連接探針。來自該第二連接反應的連接產物因而必然地僅源自從第一化學連接成功地形成的那些序列， 從而從擴增反應去除了任何“假陽性”。在另一個實施方案中，在第二反應中使用的引物序列可以是其它類型擴增反應(諸如PCR)的引物位點。在一個實施方案中，一個或多個連接探針包含錨序列。，，錨序列”在本文中是指這樣的連接探針組分其允許為了檢測目的將連接產物連接到支持物上。合適的檢測方法包括具有與其相連的適當捕獲部分的支持物。通常，這樣的連接會通過錨序列與捕獲探針的雜交而發生，所述捕獲探針與所述錨序列基本上互補。在本發明的該方面的一個實施方案中，將上游寡核苷酸設計成具有額外的核苷酸區段，所述區段不會結合目標靶物，但是將會用于以后將連接產物捕獲在合適的固體支持物或某些種類的裝置上。在本發明的該方面的一個優選的實施方案中，下游寡核苷酸具有與它相連的可檢測標記，使得在連接以后，得到的產物含有固體支持物的捕獲序列(在它的3’末端)和可檢測標記(在它的5’末端)，且僅連接的產物會含有所述捕獲序列和所述標記。在涉及多路靶物檢測的本發明的另一個方面，探針集合的每個上游探針可以被設計成在它的3’末端處具有獨特序列，該序列與DNA陣列上的不同位置相對應。探針集合的每個下游探針可以任選地含有與其它下游探針相同的可檢測標記，但是含有與它各自的靶物相對應的獨特靶物結合序列。在與DNA陣列雜交以后，僅具有地址序列(上游探針)和標記(下游探針)的連接的探針是可觀察到的。在本發明的另一個方面，可以將可檢測標記連接至上游探針上，且捕獲序列可以是下游探針的一部分，使得連接產物具有更靠近3’末端的可檢測標記和更靠近連接產物的 5’末端的捕獲序列。通過考慮合成的容易性以及以后用于后續檢測連接的反應產物的裝置的特征，可以最佳地測定精確構型。錨序列可以具有核酸部分和非核酸部分。因而，例如，可以使用柔性連接物(諸如烷基，包括聚乙二醇連接物)來提供錨序列的核酸部分和支持物表面之間的空間。當連接產物較大時，這可能是特別有用的。另外，在某些情況下，可以使用與“通用陣列”的捕獲探針相對應的錨序列集合。如本領域已知的，使用合成的一般序列作為捕獲探針，可以制備陣列，所述捕獲探針被設計成與要分析的樣品的靶序列不互補，但是與連接探針集合的陣列結合序列互補。這些“通用陣列”可以用于多類樣品和診斷實驗，因為探針的相同的陣列結合序列可以重復使用/與不同的靶物識別序列配對。在一個實施方案中，一個或多個連接探針包含標記。”標記”或“標記的”在本文中是指，化合物具有至少一個連接的元件、同位素或化合物，以實現化合物的檢測，例如使得連接探針或連接產物或轉移產物可使用已知的檢測方法檢測出，例如，電子的、光譜的、光化學的、或電化學發光的方法。一般而言，標記分為3類a)同位素標記，其可以是放射性的或重同位素；b)磁性的、電的、熱的；和c)有色的或發光的染料；盡管標記還包括酶和顆粒諸如磁性顆粒。所述染料可以是生色團或磷光體，但是優選熒光染料，這是由于它們的強信號會提供好的信噪比。適用于本發明中的染料包括、但不限于熒光的鑭系元素復合物(包括銪和鋱的那些)、熒光素、異硫氰酸熒光素、羧基熒光素(FAM)、二氯三嗪基胺熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、傘形酮、曙紅、赤蘚紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、Malacite綠、 Cy3、Cy5、均二苯代乙烯(stilbene)、螢光黃、Cascade Blue 、德克薩斯紅、alexa染料、丹磺酰氯、藻紅蛋白、綠色熒光蛋白和它的波長偏移變體、bodipy、和本領域已知的其它染料， 諸如在下述文獻中描述的那些:Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, Oreg.) 第 6 版；The Synthegen catalog (Houston, Tex. ), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy,第 2 版，Plenum Press New York (1999),禾口在 Richard P. Haugland 的 Molecular Probes Handbook第6版中描述的其它染料，它們都特別地通過引用并入本文。 其它標記包括在美國系列號09/315，584中描述的納米晶體或Q-點，特別地通過引用并入本文。在一個優選的實施方案中，所述標記是第二標記，所述第二標記是結合配偶體對的一部分。例如，所述標記可以是半抗原或抗原，其會結合它的結合配偶體。在一個優選的實施方案中，所述結合配偶體可以連接至固體支持物上，以允許分離延長的和未延長的引物。例如，合適的結合配偶體對包括、但不限于抗原(諸如蛋白(包括肽))和抗體(包括其片段(FAb等))；蛋白和小分子，包括生物素/抗生蛋白鏈菌素；酶和底物或抑制劑；其它蛋白一蛋白相互作用對；受體-配體；和碳水化合物和它們的結合配偶體。核酸一核酸結合蛋白對也是有用的。一般而言，所述對中的較小者被連接至NTP上，用于摻入引物中。優選的結合配偶體對包括、但不限于生物素(或亞氨基-生物素)和抗生蛋白鏈菌素、地高辛配基和Ab和ftOlinx 試劑。在一個優選的實施方案中，所述結合配偶體對包含生物素或亞氨基-生物素和抗生蛋白鏈菌素。亞氨基-生物素是特別優選的，因為亞氨基-生物素在PH 4.0緩沖液中會脫離抗生蛋白鏈菌素，而生物素需要苛刻的變性劑(例如6M鹽酸胍pH 1.5或90%甲酰胺， 95 0C )。在一個優選的實施方案中，所述結合配偶體對包含主要檢測標記(例如，連接至連接探針上)和會特異性地結合主要檢測標記的抗體。“特異性地結合”在本文中是指，所述配偶體以足以區分該對和體系的其它組分或污染物的特異性進行結合。所述結合應當足以在試驗條件(包括去除非特異性結合的洗滌步驟)下保持結合。在有些實施方案中，所述對的解離常數小于約10_4至IO-6M-1,其中小于約10_5至IO-9M-1是優選的，IO-9M-1是特別優選的。在一個優選的實施方案中，所述第二標記是化學可修飾的部分。在該實施方案中， 將包含反應官能團的標記摻入核酸中。然后可以用主要標記隨后標記官能團。合適的官能團包括、但不限于氨基、羧基、馬來酰亞胺基、橋氧基和硫醇基，其中氨基和硫醇基是特別優選的。例如，含有氨基的主要標記可以連接至包含氨基的第二標記上，例如使用連接物， 這是本領域已知的；例如，同-或雜-雙功能連接物也是眾所周知的(參見1994 Pierce Chemical Company目錄，關于交聯劑的技術部分，第155200頁，通過引用并入本文)。在該實施方案中，所述標記還可以是標記探針結合序列或其互補序列。“標記探針”在本文中是指，與結合序列基本上互補且通常被直接地標記的核酸。
合成方法通常使用已知的合成技術，制備本發明的組合物。一般而言，基于標準的亞磷酰胺化學法的方法在本發明的一個方面特別適用，盡管如本領域技術人員會理解的，多種核酸合成反應是已知的。制備具有鹵素離去基團的探針的方法是本領域已知的；參見例如Abe等人， Proc Natl Acad Sci U S A(2006) 103(2) :263-8 !Silverman 等人，Nucleic Acids Res. (2005)33(15) :4978-86 ；Cuppolletti 等人，Bioconjug Chem. (2005) 16(3) :528-34 ； Sando 等人，J Am Chem Soc. (2004)4 ； 126 (4) 1081-7 ;Sando 等人，Nucleic Acids Res Supp 1. (2002)2 :121-2 ；Sando 等人，J Am Chem Soc. (2002) 124(10) :2096-7 ；Xu 等人，Nat Biotechnol. (2001) 19(2) :148-52 ；Xu 等人，Nucleic Acids Res. (1998)26(13) :3159-64; Moran 等人，Proc Natl Acad Sci U S A(1997)94QO) :10506-11 ;Kool，美國專利號 7，033，753 ；Kool，美國專利號6，670，193 ；Kool，美國專利號6，479，650 ；Kool，美國專利號 6，218，108 ；Kool，美國專利號6，140，480 ；Kool，美國專利號6，077，668 ；Kool，美國專利號 5，808，036 ；Kool，美國專利號5，714，320 ；Kool，美國專利號5，683，874 ；Kool，美國專利號 5，674，683 ；和Kool，美國專利號5，514，546，它們各自通過引用整體并入本文。如本領域已知的，通常摻入諸如標記、引物序列、啟動子序列等其它組分。熒光團和猝滅劑的添加間距也是眾所周知的。第二反應在檢測連接或轉移反應產物之前，可以存在額外的擴增反應。次要擴增反應可以用于增加靶序列的檢測信號；例如通過增加每個靶物拷貝生成的連接產物的數目。在一個實施方案中，可以在連接產物上進行任意數目的標準擴增反應，包括、但不限于鏈置換擴增(SDA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、連接擴增和聚合酶鏈式反應(PCR)；包括PCR的許多變體，包括“定量競爭PCR”或“QC-PCR”、“任意引發的PCR”或“AP-PCR”、“免疫-PCR”、 “Alu-PCR”、“PCR單鏈構象多態性”或“PCR-SSCP”、“逆轉錄酶PCR”或“RT-PCR”、“生物素捕獲PCR”、“人造載體PCR”、“鍋柄樣PCR”、和“PCR選擇cDNA減法”以及其它。在一個實施方案中，所述擴增技術不是PCR。根據某些實施方案，可以使用連接技術諸如缺口 -填充連接，包括、但不限于，缺口 -填充OLA和LCR、成橋寡核苷酸連接、FEN-LCR、和修正連接。 除了其它地方以外，這些技術的描述，可以參見美國專利號5，185，M3，公開的歐洲專利申請EP 320308和EP 439182，公開的PCT專利申請WO 90/01069，公開的PCT專利申請WO 02/(^823，和美國專利申請系列號09/898，323。除了標準的酶擴增反應以外，可以設計這樣的探針方案，其中最初生成的連接產物本身可以是后續化學連接反應的靶物。此外，可以在起始樣品核酸上進行“預擴增反應”，以制備更多靶序列用于化學反應連接。例如，可以進行全基因組擴增。試驗本領域技術人員會理解，利用本發明的方法和組合物的試驗可以采取多種構型， 這取決于目標用途，且可以包括原位試驗(類似于FISH)、基于溶液的試驗(例如熒光團和 /或猝滅劑的轉移/去除)、和異質試驗(例如利用固體支持物進行操作、去除和/或檢測， 諸如使用高密度陣列)。另外，試驗可以包括額外的反應，諸如靶序列的預擴增和已經發生連接以后的后續擴增反應，如本文所述。如本文所述，屬于本發明該方面的試驗可以依賴于信號的增加，例如熒光或化學發光的產生。但是，本領域技術人員會理解，依賴于這樣的信號的減小的試驗也是可以的。在一個實施方案中，與FISH反應類似，“在原位”(在不同的測定形式中也稱作“在體外”和/或“離體”，取決于樣品)進行測定反應。由于不需要加入外源酶，可以將試劑加給細胞(活細胞、電穿孔的細胞、固定的細胞等)，諸如用于測定靶序列存在的組織學樣品， 特別是與疾病狀態或其它病理學有關的那些。另外，可以進行“體外”測定，其中靶序列提取自樣品。可以處理樣品(例如對于石蠟包埋的樣品，可以制備樣品)，加入試劑，并使反應進行，隨后進行檢測(如本領域所進行的)。在一個實施方案中，使用固體支持物，檢測連接的產物。例如，使用錨探針/捕獲探針雜交或其它結合技術，諸如使用結合配偶體對(例如生物素和抗生蛋白鏈菌素)，可以將連接產物連接至珠子上。在一個實施方案中，轉移反應導致生物素部分從第一連接探針轉移至包含標記的第二連接探針。使包含抗生蛋白鏈菌素的珠子接觸樣品，并檢查珠子上標記的存在，例如使用FACS技術。在其它實施方案中，使用異質試驗，檢測連接的產物。也就是說，所述反應是在溶液中進行，并將產物加給固體支持物，諸如陣列或珠子。通常，一個連接探針包含錨序列或結合對配偶體(例如生物素、半抗原等)，且另一個包含標記(例如熒光團、標記探針結合序列等)。將連接產物加給固體支持物，并任選地洗滌支持物。在該實施方案中，僅連接產物被捕獲和標記。在本發明的另一個方面，寡核苷酸探針之一具有連接的磁珠或某種其它標記(生物素)，其允許容易地操作連接產物。使用本文所述的任意數目的構型，可以將所述磁珠或標記連接在上游或下游探針上。如本文所述，也可以進行第二反應，其中加入額外的功能部分(例如錨序列、引物、標記等)。類似地，如本文所述，可以進行第二擴增反應。檢測系統是本領域已知的，包括光學試驗(包括熒光和化學發光的試驗)、酶試驗、放射性標記、表面等離子體共振、磁阻、懸臂梁偏轉、表面等離子體共振等。在有些實施方案中，連接產物可以用于其它測定技術中，例如，如在2006/0068378(它通過引用并入本文)中所述，連接產物可以用作光散射顆粒(諸如膠體)之間的連接物，在有連接產物存在下導致顏色變化。在有些實施方案中，可以在樣品收集管內包含檢測系統；例如，血液收集裝置可以具有整合進管中的試驗或允許檢測病原體或疾病的裝置。固體支持物如上所述，所述試驗可以以多種方式運行。在利用在固體支持物上的檢測的試驗中，存在多種可以用于本發明中的固體支持物，包括陣列。在有些實施方案中，諸如珠子等固體支持物可以用于本發明中。例如，結合配偶體對(一個在連接產物上，一個在珠子上)可以如上所述用于去除未連接的反應物。在該實施方案中，磁珠是特別優選的。在本發明的有些實施方案中，將捕獲探針連接至固體支持物上進行檢測。例如，可
23以將捕獲探針連接至珠子上，隨后使用任意合適的技術(例如FACQ進行分析。類似地，可以使用如下所述的珠陣列。在一個實施方案中，本發明提供了陣列，每個陣列位置最少包含共價連接的核酸探針，通常稱作“捕獲探針”。“陣列”在本文中是指陣列形式的多個核酸探針；陣列的大小取決于陣列的組成和最終的用途。可以制備含有約2個至數千個不同捕獲配體的陣列。通常，對于基于電極的試驗，陣列包含2至多達100，000個或更多，取決于電極的大小、以及陣列的最終用途。優選的范圍是約2至約10，000，約5至約1000是優選的，約10至約100是特別優選的。在有些實施方案中，本發明的組合物可以不是陣列形式；也就是說，對于有些實施方案，還可以制備包含單個捕獲探針的組合物。另外，在有些陣列中，可以使用多種基質，無論是不同的組成還是相同的組成。因而，例如，大陣列可以包含多個更小的基質。核酸陣列是本領域已知的，且可以以多種方式分類；包括有序陣列(例如在離散位點處分辨化學試劑的能力)和隨機陣列(例如珠陣列)。有序陣列包括、但不限于使用光刻技術 (例如 Affymetrix GeneChip )、印跡技術(Synteni 等)、印刷技術(Hewlett Packard 和 Rosetta)制備的那些、電極陣列、三維“凝膠墊”陣列和液體陣列。在一個優選的實施方案中，所述陣列存在于基質上。“基質”或“固體支持物”或其它語法等同描述在本文中是指，可以修飾成含有離散的單個位點的任意物質，所述位點適用于連接或結合核酸。本領域技術人員會理解，所述基質可以包含多種物質，包括、但不限于玻璃、塑料、聚合物、金屬、類金屬、陶瓷制品、和有機物。當固體支持物是珠子時，多種基質是可行的，包括但不限于磁性材料、玻璃、硅、葡聚糖、和塑料。硬件微流體在本發明的另一個方面，使用與LiiK2006)所述的那些類似的流體裝置來自動化本發明所述的方法。關于組件，參見例如美國專利號6，942，771(通過引用并入本文)，所述組件包括但不限于藥筒、裝置、泵、孔、反應室、和檢測室。流體裝置還可以包括用于捕獲磁性顆粒的區域、分離過濾器和樹脂，包括用于細胞分離的膜(即來自I^ll的Leukotrap )。 所述裝置可以包括用于實時PCR擴增過程中產生的熒光信號(即STOR綠，Taqman, Molecular Beacons)的藥筒內成像的檢測室，以及用于在裝置上分離和檢測反應產物(擴增子和連接產物)的毛細管電泳通道。在一個優選的實施方案中，所述毛細管電泳通道可以模鑄在塑料基質中，并用篩分聚合物基質(來自Applied Biosystems的P0P-7 )填充。 含有未篩分基質的通道也可以與適當設計的探針集合一起使用。在一個優選的實施方案中，本發明的裝置包括液體處理組件，包括用于在每個站或站集合裝載和卸載液體的組件。液體處理系統可以包括自動系統，所述自動系統包括任意數目的組件。另外，可以自動化本文所述的任意或所有步驟；因而，例如，所述系統可以完全地或部分地自動化。本領域技術人員會理解，存在多種可以使用的組件，包括、但不限于一個或多個自動臂；用于定位微量培養板的平板操作器；具有藥筒和/或帽的托架；自動化的蓋或帽操作器，其用于去除和更換在無交叉污染平板上的孔的蓋；使用一次性尖頭進行樣品分布的尖頭組件；用于樣品分布的可洗滌的尖頭組件；96孔裝載塊；冷卻試劑支架；微孔滴定板吸管位置(任選地冷卻)；平板和尖頭的堆疊塔；和計算機系統。
完全自動的系統或微流體系統包括自動化的液體_、顆粒_、細胞-和生物體-操作，包括高通量吸液，以進行篩選應用的所有步驟。這包括液體、顆粒、細胞、和生物體操作， 諸如抽吸、分配、混合、稀釋、洗滌、準確的容量轉移；吸管尖頭的安裝和拋棄；和重復吸量相同體積以用于從單次樣品抽吸實現多個遞送。這些操作是沒有交叉污染的液體、顆粒、細胞、和生物體轉移。該儀器實現微量培養板樣品向過濾器、膜、和/或子代平板的自動化復制、高密度轉移、全平板系列稀釋、和高容量操作。在一個優選的實施方案中，使用化學地衍生化的顆粒、平板、藥筒、試管、磁性顆粒、或對試驗組分具有特異性的其它固相基質。微量培養板、試管或任意固相基質的結合表面包括非極性表面、高度極性的表面、促進共價結合的修飾的葡聚糖涂層、抗體涂層、結合融合蛋白或肽的親和介質、表面-固定的蛋白諸如重組蛋白A或G、核苷酸樹脂或包衣劑、和其它親和基質可用于本發明中。在一個優選的實施方案中，用于多孔平板、多管、托架、藥筒、微型管、深孔平板、微量離心機試管、冷凍管、方孔平板、過濾器、芯片、光學纖維、珠子、和其它固相基質的平臺或具有不同容積的平臺，被安置在可升級的模塊平臺上，以實現額外的容量。該模塊平臺包括可變速的定軌搖床和用于來源樣品、樣品和試劑稀釋、試驗平板、樣品和試劑蓄池、吸管尖頭和有效洗滌站的多位置工作床面。在一個優選的實施方案中，將熱循環儀和熱調節系統用于穩定熱交換器(諸如控制塊或平臺)的溫度，以提供從0°c至100°C的溫育樣品的準確溫度控制；這是站式熱控制器的替代或附加。在一個優選的實施方案中，具有單個或多個磁性探針、親和探針、或吸管的可互換的吸管頭(單通道或多通道)自動地操作液體、顆粒、細胞、和生物體。多孔或多管磁性分離器或平臺會以單個或多個樣品形式操作液體、顆粒、細胞、和生物體。在有些實施方案中，儀器包括檢測器，其可以是多種不同的檢測器，取決于標記和試驗。在一個優選的實施方案中，有用的檢測器包括具有多個熒光通道的顯微鏡；平板讀數器，以提供熒光的、電化學的和/或電阻抗分析儀；具有單和雙波長端點和動力學能力的紫外線和可見光分光光度測量檢測；熒光共振能量轉移(FRET)，發光，猝滅，雙光子激發， 和強度重新分布；CCD照相機，以捕獲和變換數據和圖像為可計量的形式；毛細管電泳系統，質譜儀和計算機工作站。這些儀器可以安裝在無菌的層流或通風柜中，或是封閉的、自含式系統，用于多孔平板或試管中的細胞培養生長和轉化，和用于危險操作。可以在受控的生長條件下培養活細胞，對于活細胞試驗的時間序列，控制溫度、濕度、和氣體。自動化的細胞轉化和自動化的菌落挑選器可以促進目標細胞的快速篩選。流式細胞術或毛細管電泳形式可以用于磁珠和其它珠子、顆粒、細胞、和生物體的單個捕獲。靈活的硬件和軟件可以實現多種用途的儀器適應性。軟件程序模塊允許建立、修改、和運行該方法。系統診斷模塊允許儀器比對、校正連接、和自動操作(motor operation)。定制的工具、實驗室器具、和液體、顆粒、細胞和生物體轉移模式允許實現不同的用途。數據庫允許進行方法和參數儲存。自動界面和計算機界面允許儀器之間通信。在一個優選的實施方案中，自動儀器包括中央處理器，其通過總線與存儲器和一組輸入/輸出裝置(例如，鍵盤、鼠標、監視器、打印機等)通信。另外，如下所述，這可以是用于本發明的多路化裝置的CPU的替代或附加。中央處理器、存儲器、輸入/輸出裝置、和總線之間的一般相互作用是本領域已知的。因而，在CPU存儲器中儲存了多種不同的規程， 這取決于要運行的實驗。這些自動液體處理系統可以利用任意數目的不同試劑，包括緩沖液、試劑、樣品、 洗液、試驗組分諸如標記探針等。試劑盒在本發明的另一個方面，生產了用于預定的核酸靶物集合的常規檢測的試劑盒， 其利用本文所述的探針、技術、方法、和化學連接反應作為檢測方法的一部分。所述試劑盒可以包括探針、靶序列、說明書、緩沖液、和/或其它試驗組分。化學連接依賴性的探針擴增(CLPA)在另一個實施方案中，本發明涉及化學連接依賴性的探針擴增(CLPA)技術。CLPA 是基于靶物特異性的寡核苷酸探針的化學連接，以形成連接產物。該連接產物隨后用作酶擴增反應的模板，以產生隨后使用任意合適的方法進行分析的擴增子。CLPA可以用于多種目的，包括但不限于復合體基因標志模式的分析。不像利用酶連接反應的其它技術諸如 DASL(Bibikova，M.，等人，American Journal of Pathology“2004)，165 :5，1799-1807)和 MLPA(Schouten，美國專利6，955，901)，CLPA使用化學連接反應。在一個實施方案中，所述CLPA試驗包括使用摻入反應部分的寡核苷酸探針對，所述反應部分當在靶序列上適當定位時可以自連接。在一個優選的實施方案中，在一個探針上的3’-硫代磷酸酯部分與其它探針上的5’-DABSl離去基團反應(參見方案1和圖6)。
權利要求
1.一種用于檢測包含多種不同序列的樣品核酸的樣品中至少一種特定靶核酸序列的存在的方法，所述至少一種特定靶核酸序列包含第一靶結構域和第二靶結構域，所述結構域的位置基本上彼此鄰近，所述方法包括下述步驟a)使所述樣品核酸接觸多個不同的探針集合，每個探針集合包含1.第一連接探針，其包含1)與所述第一靶結構域基本上互補的第一探針結構域；和2)與所述靶核酸基本上不互補的第一非互補區，3)5'-連接部分；和 .第二連接探針，其包含1)與所述第二靶結構域基本上互補的第二探針結構域；2)與所述靶核酸基本上不互補的第二非互補區，3)3'連接部分；其中所述連接探針中的至少一個包含可變間隔序列；和b)在沒有連接酶存在下，連接所述第一連接探針和第二連接探針，以形成連接產物；c)擴增所述連接產物；和d)檢測所述連接產物的存在。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述靶序列是RNA和/或DNA。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述靶序列包含未純化的RNA。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述樣品源自哺乳動物體，所述哺乳動物體選自血液、尿、唾液和糞便。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述檢測步驟是通過毛細管電泳。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述檢測步驟是通過微陣列分析。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述檢測步驟是通過熒光或實時熒光分析。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述檢測步驟是通過質譜法。
9.如權利要求1所述的方法，其中在所述第一連接探針上的所述5’連接部分是DABSYL 部分，在所述第二連接探針上的所述3’連接部分是3-硫代磷酸酯部分。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述第一連接探針和第二連接探針各自另外包含用于擴增所述連接產物的通用引物序列。
11.如權利要求10所述的方法，其中結合所述引物序列的通用引物之一含有可檢測的標記。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述可檢測的標記選自熒光標記、化學發光標記、電化學標記和磁性標記。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述標記是選自下述的熒光標記熒光素和它的衍生物、TAMRA(四甲基-6-羧基羅丹明)、Alexa染料、Quasar染料和菁染料(例如Cy3和 Cy5)。
14.一種用于檢測包含多種不同序列的樣品核酸的樣品中至少一種特定靶核酸序列的存在的方法，所述至少一種特定靶核酸序列包含第一靶結構域和第二靶結構域，所述結構域的位置基本上彼此鄰近，所述方法包括下述步驟a)使所述樣品核酸接觸多個不同的探針集合，每個探針集合包含i)第一連接探針，其包含1)與所述第一靶結構域基本上互補的第一探針結構域；和2)與所述靶核酸基本上不互補的第一非互補區，3)5'-連接部分；和 )第二連接探針，其包含1)與所述第二靶結構域基本上互補的第二探針結構域；2)與所述靶核酸基本上不互補的第二非互補區；和3)3'連接部分；其中所述第一連接探針和第二連接探針中的至少一個另外包含錨序列；b)將所述連接產物捕獲在微陣列基質上，所述微陣列基質包含與所述錨序列基本上互補的捕獲探針；和c)檢測所述連接產物的存在。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述第一連接探針和第二連接探針各自另外包含用于擴增所述連接產物的通用引物序列，其中結合所述引物序列的通用引物之一含有可檢測的標記，其中所述可檢測的標記選自熒光標記、電化學標記和磁性標記。
16.一種用于檢測包含多種不同序列的樣品核酸的樣品中至少一種特定靶核酸序列的存在的方法，所述至少一種特定靶核酸序列包含第一靶結構域和第二靶結構域以及位于所述第一靶結構域和第二靶結構域之間的第三結構域，所述結構域的位置基本上彼此鄰近， 所述方法包括下述步驟a)使所述樣品核酸接觸多個不同的探針集合，每個探針集合包含 i.第一連接探針，其包含1)與所述第一靶結構域基本上互補的第一探針結構域；和2)與所述靶核酸基本上不互補的第一非互補區，3)5'-連接部分；和 .第二連接探針，其包含1)與所述第二靶結構域基本上互補的第二探針結構域；2)與所述靶核酸基本上不互補的第二非互補區，3)3'連接部分；iii.第三連接探針，其包含1)與所述第三靶結構域基本上互補的第三探針結構域；2)3’和5’連接部分；b)在沒有連接酶存在下，連接所述第一連接探針、所述第二連接探針、和所述第三連接探針，以形成連接產物；c)擴增所述連接產物；和c)檢測所述連接產物的存在。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述靶序列是RNA和/或DNA。
18.如權利要求16所述的方法，其中所述樣品源自哺乳動物體，所述哺乳動物體選自血液、尿、唾液和糞便。
19.如權利要求16所述的方法，其中所述檢測步驟是通過毛細管電泳。
20.如權利要求16所述的方法，其中所述檢測步驟是通過微陣列分析。
21.如權利要求16所述的方法，其中所述檢測步驟是通過熒光檢測或實時熒光檢測。
22.如權利要求16所述的方法，其中所述檢測步驟是通過質譜法。
23.如權利要求16所述的方法，其中所述第一連接探針和第二連接探針各自另外包含用于擴增所述連接產物的通用引物序列。
24.如權利要求16所述的方法，其中結合所述引物序列的通用引物之一含有可檢測的標記。
25.如權利要求M所述的方法，其中所述可檢測的標記選自熒光標記、化學發光標記、電化學標記和磁性標記。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述標記是選自下述的熒光標記熒光素和它的衍生物、TAMRA(四甲基-6-羧基羅丹明)、Alexa染料、Quasar染料和菁染料(例如Cy3和 Cy5)。
27.一種用于檢測目標核酸序列的流體裝置，所述流體裝置包括i)至少一個樣品處理孔，其包括孔入口和孔出口；ii)第一微通道，以允許在所述樣品入口和所述樣品處理孔之間發生流體接觸；iii)一個或多個下述元件流體控制閥、流體泵送機構、溫度控制元件、檢測室或通道和廢物容納室；且所述裝置被用于自動化如權利要求1所述的方法。
28.如權利要求27所述的流體裝置，其具有毛細管電泳檢測通道。
29.如權利要求27所述的流體裝置，其具有空氣壓力控制的泵和閥。
30.一種用于檢測核酸序列的試劑盒，所述試劑盒包括連接探針集合，所述集合包含i)第一連接探針，其包含1)與第一靶結構域基本上互補的第一探針結構域；和2)5'-連接部分；和 )第二連接探針，其包含1)與第二靶結構域基本上互補的第二探針結構域；和2)3'連接部分；其中所述連接探針中的至少一個包含可變間隔序列，且其中所述第一連接探針和第二連接探針在沒有外源地加入的連接酶存在下能夠結合所述靶序列并發生自-連接。
31.如權利要求30所述的試劑盒，其中所述探針集合另外包含第三連接探針，所述第三連接探針包含i)第三探針結構域，其與位于所述第一靶結構域和第二靶結構域之間的第三靶結構域基本上互補；和ii)3，和5'-連接部分；并且其中所述第一連接探針、第二連接探針、和第三連接探針在沒有外源地加入的連接酶存在下能夠結合所述靶序列并發生自-連接。
全文摘要
本發明提供了用于檢測樣品中存在的一種或多種核酸靶物的組合物、儀器和方法。本發明的方法包括使用2種或更多種寡核苷酸探針，所述探針彼此緊密靠近地可逆地結合靶核酸，并具有互補的反應性連接部分。當這樣的探針已經以適當取向結合靶物時，它們能夠發生自發的化學連接反應，該反應產生連接的寡核苷酸產物。在一個方面，所述連接產物具有與特定靶物有關的可變長度。在化學連接以后，通過毛細管電泳或微陣列分析，可以放大和檢測探針。
文檔編號C12Q1/68GK102449169SQ201080023446
公開日2012年5月9日 申請日期2010年3月29日 優先權日2009年4月1日
發明者R·特布呂根 申請人:德克斯特里蒂診斷公司