專利名稱：細胞保存方法
技術領域：
本發明涉及用于細胞的冷凍保存的方法和用于該方法的冷凍保存溶液。
背景技術：
近年來，隨著醫藥的進展，已經廣泛進行了利用活細胞的基礎研究和治療。因此， 用于安全地保存細胞而同時維持細胞活性的技術是必需的，對此已經進行了多項研究。作為保存細胞的方法，在短期保存的情況下，在懸浮狀態下保存細胞而不冷凍的方法是已知的(例如，專利公開物1)；或者，在長期保存的情況下，包括冷凍的用于保存細胞的方法是已知的(例如，專利公開物2)。例如，在過繼性免疫治療或供體淋巴細胞輸注(DLI)治療 (其為針對癌癥的免疫治療)中，有一些這樣的情況實際操作上難以在制備之后立即使用 (施用)細胞；因此，需要冷凍保存細胞一定的時間段，直至使用細胞。作為冷凍保存的方法，已知有這樣的方法其中，通過將冷凍保護劑加入到含有大約40種成分的細胞培養基中來制備溶液，并使用該溶液作為細胞保存溶液。然而，常規的方法使用如上所述的含有大約40種成分的培養基，在這些成分之中有可能會包括對于細胞或活體而言不想要的那些成分。另外，在“解凍冷凍保存的細胞后將細胞施用至活體”的情況下，需要將細胞保存在溶液狀態持續一段時間，直至細胞被施用至活體，但是，常規的冷凍保存溶液具有一個問題細胞的存活率，換言之，活細胞的數目，隨著保存時間的延續而顯著降低。另外，在“解凍之后需要洗滌細胞”的情況下，也存在一個問題細胞的存活率進一步降低。現有技術參考文獻專利公開物專利公開物1 日本專利特開No. 2006-230396專利公開物2 日本專利特開No. 2002-23335
發明內容
本發明要解決的問題本發明的目標是提供用于冷凍保存細胞的方法，所述細胞能夠維持在高存活率； 還提供了具有用于冷凍保存的必須成分的冷凍保存溶液。解決問題的方法為了解決上述問題，本發明人驗證了在細胞的冷凍保存中常規使用的培養基中的大約40種成分的大量組合中的每一種，以期發現對于活體無害的成分以及在冷凍保存細胞時必不可少的成分。結果為，本發明人發現通過使用含有鈉鹽、鉀鹽、糖、冷凍保護劑和碳酸氫鹽和/或碳酸鹽的溶液獲得了即使在解凍后也具有高存活率的細胞。另外，通過使用該溶液，即使上述冷凍保存的細胞被解凍并經歷在液體懸浮狀態的長期保存時，本發明驚奇地發現保存細胞是可能的，同時維持在高存活率，雖然細胞冷凍了一次，本發明由此完成。
具體地，本發明總體上涉及[1]用于冷凍保存細胞的方法，其特征在于，使用含有下列物質作為必須成分的溶液鈉鹽、鉀鹽、糖、冷凍保護劑、以及碳酸氫鹽和/或碳酸鹽，所述溶液另外可選地包含選自下列的成分蛋白質、鎂鹽和鈣鹽。[2]根據[1]的方法，其中所述的糖是選自下列的至少一種糖葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。[3]根據[1]的方法，其中所述冷凍保護劑是選自下列的至少一種冷凍保護劑二甲基亞砜、羥乙基淀粉、乙二醇和甘油。[4]根據[1]的方法，其中所述蛋白質是源自血液的蛋白質。[5]用于保存細胞的方法，其特征在于，所述方法包括使根據[1]定義的方法進行了冷凍保存的細胞溶液解凍；和，進一步將該細胞溶液保存在液體懸浮狀態。和[6]細胞的冷凍保存溶液，其特征在于，所述冷凍保存溶液包含作為必須成分的下列物質鈉鹽、鉀鹽、糖、冷凍保護劑、以及碳酸氫鹽和/或碳酸鹽，并且所述溶液另外可選地包含選自下列的成分蛋白質、鎂鹽和鈣鹽。發明效果根據本發明，使得獲得在解凍之后保持高存活率的細胞的冷凍保存成為可能，甚至是當細胞在解凍之后維持在液體懸浮狀態時，細胞也維持高存活率，并且也保持生理學功能；因此，本發明對于細胞的基礎性研究和應用性研究和醫學應用是非常有用的。
圖1的圖顯示了當研究本發明的保存方法中使用的溶液的必須成分時，細胞存活活性的一個實例。圖2的圖比較了在反復冷凍和解凍冷凍保存的細胞之后，細胞的存活活性。圖3的圖比較了在冷凍保存的細胞解凍之后、在液體懸浮狀態保持一個長時間段時的細胞存活活性。圖4的圖比較了在冷凍保存的不同細胞解凍之后、在液體懸浮狀態保持一個長時間段時的細胞存活活性。圖5的圖比較了反復冷凍和解凍冷凍保存的細胞之后的細胞存活活性。圖6的圖比較了在冷凍保存的細胞解凍之后、在液體懸浮狀態保持一個長時間段時的細胞存活活性。
具體實施例方式以下將更具體地描述本發明。本發明提供了用于冷凍保存細胞的方法，其特征在于所述方法包括將細胞懸浮于含有鈉鹽、鉀鹽、糖、冷凍保護劑以及碳酸氫鹽和/或碳酸鹽的溶液中，并將得到的細胞懸浮液進行冷凍保存。換言之，鈉鹽、鉀鹽、糖、冷凍保護劑以及碳酸氫鹽和/或碳酸鹽在本發明中對于細胞的冷凍保存是必需的且足夠的[也稱作用于本發明的冷凍保存方法的溶液(本發明的冷凍保存溶液)的必須成分]。如本文使用的“鈉鹽”無特別限定，只要當溶解于溶劑時該鈉鹽產生鈉離子；可以使用含氧酸鹽、商化物、氧化物、氫氧化物、無機鹽、有機酸鹽等。例如，含氧酸鹽包括過碳酸鈉(Nei2CO4)、連二亞硫酸鈉(sodium dithionite、sodium hydrosulfite) (Νει2&04)、亞硫酸鈉(Na2SO3)、亞硫酸氫鈉(NaHSO3)、硫酸鈉(sodium sulfate (總名稱)=Na2SO4)、硫代硫酸鈉(hypo) (Na2S2O3)、亞硝酸鈉(NaNO2)和硝酸鈉(NaNO2)；鹵化物包括氟化鈉(NaF)、氯化鈉 (NaCl)、溴化鈉(NaBr)和碘化鈉(NaI)；氧化物包括氧化鈉(Na2O)和過氧化鈉(Na2O2)；氫氧化物包括氫氧化鈉(sodium hydroxide (總名稱)Na0H)；無機鹽包括氫化鈉(NaH)、硫化鈉(Na2S)、硫氫化鈉(sodium hydrosulf ide) (NaHS)、硅酸鈉(Na2SiO3)、磷酸三鈉(Na3PO4)、 硼酸鈉(Na3BO3)、硼氫化鈉(NaBH4)和四氯代金酸鈉(Na[AuClJ)；有機酸鹽包括乙酸鈉 (CH3COONa)和檸檬酸鈉；等等。可以使用單一種類的這些鈉鹽或多個種類的組合。在本發明中，作為單一的種類，優選使用氯化鈉；作為多個種類，優選使用氯化鈉和檸檬酸鈉。所包含的鈉鹽的量無特別限定，就包含于本發明的冷凍保存溶液中的全部鈉離子的最終濃度而言，數量優選為0. 01至5，000mmol/L,更優選為0. 1至1，000mmol/L,進一步優選為1至 300mmol/L。如本文使用的“鉀鹽”無特別限定，只要當溶解于溶劑時該鉀鹽產生鉀離子；可以使用含氧酸鹽、商化物、氧化物、氫氧化物、無機鹽、有機酸鹽等。例如，含氧酸鹽包括硝酸鉀 (KNO3)、硫酸鉀(K2SO4)和過碳酸鉀(K2CO4)；鹵化物包括氟化鉀(KF)、氟氫化鉀(KHF2)、氯化鉀(KCl)、溴化鉀(KBr)和碘化鉀(KI)；氧化物包括過氧化鉀(K2O2)和氧化鉀(K2O)；氫氧化物包括氫氧化鉀(KOH)；無機鹽包括氫化鉀(KH)、硫化鉀(K2S)、硫氫化鉀(potassium hydrosulfide) (KHS)、高錳酸鉀(KMnO4)、鉻酸鉀(K2CrO4)和氯酸鉀(KClO3)；等等。可以使用單一種類的這些鉀鹽或多個種類的組合。在本發明中，優選使用氯化鉀。所包含的鉀鹽的量無特別限定，就包含于本發明的冷凍保存溶液中的全部鉀離子的最終濃度而言，數量優選為0. 01至5，00(toimol/L，更優選為0. 1至1，00(toimol/L，進一步優選為1至100mmol/L。如本文使用的“碳酸氫鹽”無特別限定，只要當溶解于溶劑時該碳酸氫鹽產生碳酸氫根離子；可以使用含多種陽離子的鹽。例如，碳酸氫鹽包括碳酸氫銨(NH4HCO3)、碳酸氫鉀 (KHCO3)、碳酸氫鈣(Ca(HCO3)2)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、碳酸氫鎂(Mg(HCO3)2)等。如本文使用的“碳酸鹽”無特別限定，只要當溶解于溶劑時該碳酸鹽產生碳酸根離子；可以使用含多種陽離子的鹽。例如，碳酸鹽包括碳酸銨((NH4)2CO3)、碳酸鉀(K2CO3)、 碳酸鈣(CaCO3)、碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸鋇(BaCO3)、碳酸鎂(MgCO3)、碳酸鋰(Li2CO3)、碳酸銅 (II) (CuCO3)、碳酸鐵(II) (FeCO2)、碳酸銀⑴(A^CO3)等。可以使用單一種類的這些碳酸氫鹽和/或碳酸鹽或多個種類的組合。在本發明中，優選使用碳酸氫鈉。所包含的碳酸氫鹽和/或碳酸鹽的量無特別限定，就包含于本發明的冷凍保存溶液中的全部碳酸氫根離子和碳酸根離子的最終濃度而言，數量優選為0.01 至 1，000mmol/L，更優選為 0. 1 至 500mmol/L，進一步優選為 1 至 100mmol/L。如本文使用的“糖”，可以使用單糖、寡糖或糖醇。例如，單糖包括葡萄糖、半乳糖、 果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖包括海藻糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖；糖醇包括木糖醇和山梨糖醇；等等。可以使用單一種類的這些糖或多個種類的組合，在本發明中，糖優選是選自下列的至少一種糖葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖，更優選為葡萄糖。所包含的糖的量優選為冷凍保存溶液的0. 01至100g/L，更優選為0. 1至100g/L， 進一步優選為0. 25至50g/L。
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如本文使用的“冷凍保護劑”包括二甲基亞砜(DMSO)、羥乙基淀粉(HES)、乙二醇、 甘油等。另外，商業上可獲得的產品包括CP-I [含有17.65% (W/V)HES和14.71% (V/V) DMSO 的生理鹽水，由 KY0KUT0 PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.，LTD.生產]。可以使用單一種類的這些冷凍保護劑或多個種類的組合。在本發明中，優選使用DMSO和羥乙基淀粉。所包含的冷凍保護劑的量優選為冷凍保存溶液的0. 01% -50%，更優選為-40%， 進一步優選為3% -30%。另外，當使用DMSO和羥乙基淀粉共同作為冷凍保護劑時，所包含的它們的總量優選在上述范圍內，各自的濃度為=DMSO濃度優選為0. 01 % -50%，更優選為-30%，進一步優選為2% -15% ；羥乙基淀粉的濃度優選為0.01% -50%，更優選為 1% -30%，進一步優選為2% -15%。在本發明的優選實施方式中，除了用于本發明的冷凍保存細胞的方法中的溶液的必須成分之外，該溶液還可以可選地包含選自下列的成分蛋白質、鎂鹽和鈣鹽。如本文使用的“蛋白質”沒有特別限定，蛋白質包括分離的蛋白質或可用的重組蛋白質。例如，蛋白質包括源自血液的蛋白質。源自血液的蛋白質包括源自血漿的蛋白質以及源自血清的蛋白質，具體包括血清白蛋白、血清球蛋白等。同樣，血清白蛋白包括人血清白蛋白或牛血清白蛋白。商業上可獲得的產品包括Buminate Injection 25% (25%的人血清白蛋白，由Baxter Limited生產)等等。可以使用單一種類的這些蛋白質或多個種類的組合。在本發明中，蛋白質優選是人血清白蛋白。所包含的蛋白質的量優選為冷凍保存溶液的0.01% -50%，更優選為-30%，進一步優選為2% -15%。如本文使用的“鎂鹽”沒有特別限定，只要當溶解于溶劑時該鎂鹽產生鎂離子； 可以使用含氧酸鹽、商化物、氧化物、氫氧化物、無機鹽、有機酸鹽等。例如，含氧酸鹽包括硝酸鎂(Mg(NO3)2)、硫酸鎂(MgSO4)和過碳酸鎂(MgCO4)；鹵化物包括氟化鎂(MgF2)、氟氫化鎂(Mg (HF2) 2)、氯化鎂(MgCl2)、溴化鎂(MgBr2)和碘化鎂(MgI2)；氧化物包括過氧化鎂 (MgO2)和氧化鎂(MgO)；氫氧化物包括氫氧化鎂(Mg(OH)2)；無機鹽包括氫化鎂(MgH2)、硫化鎂(MgS)、硫氫化鎂(magnesium hydrosulf ide) (Mg (SH) 2)、高錳酸鎂(Mg(MnO4)2)、鉻酸鎂(MgCrO4)和氯酸鎂(Mg(ClO3)2)；等等。可以使用單一種類的這些鎂鹽或多個種類的組合。在本發明中，優選使用氯化鎂。所包含的鎂鹽的量無特別限定，就包含于本發明的冷凍保存溶液中的全部鎂離子的最終濃度而言，數量優選為0. 01至lOmmol/L，更優選為0. 1至 5mmol/L0如本文使用的“鈣鹽”沒有特別限定，只要當溶解于溶劑時該鈣鹽產生鈣離子； 可以使用含氧酸鹽、商化物、氧化物、氫氧化物、無機鹽、有機酸鹽等。例如，含氧酸鹽包括硝酸鈣(Ca(NO3)2)、硫酸鈣(CaSO4)和過碳酸鈣(CaCO4)；鹵化物包括氟化鈣(CaF2)、氟氫化鈣(Ca (HF2) 2)、氯化鈣(CaCl2)、溴化鈣(CaBr2)和碘化鈣(CaI2)；氧化物包括過氧化鈣 (CaO2)和氧化鈣(CaO)；氫氧化物包括氫氧化鈣(Ca(OH)2)；無機鹽包括氫化鈣(CaH2)、硫化鈣(CaS)、硫氫化鈣(calcium hydrosulf ide) (Ca (SH) 2)、高錳酸鈣(Ca(MnO4)2)、鉻酸鈣 (CaCrO4)和氯酸鈣(Ca(ClO3)2)；等等。可以使用單一種類的這些鈣鹽或多個種類的組合。 在本發明中，優選使用氯化鈣。所包含的鈣鹽的量無特別限定，就包含于本發明的冷凍保存溶液中的全部鈣離子的最終濃度而言，數量優選為0. 01至lOmmol/L，更優選為0. 1至 5mmol/L0本發明方法中使用的冷凍保存溶液的成分中的鈉鹽與鉀鹽的濃度比鈉離子與鉀離子的濃度比，鈉離子/鉀離子優選為1/1000至1000/1，更優選為1/100至100/1，進一步優選為1/10至100/1，進一步優選為1/1至100/1，進一步優選為10/1至50/1。另外，除了上述成分之外，本發明的冷凍保存溶液還可以包含不具有細胞毒性的物質，例如，維生素、氨基酸等。此外，從調節pH或發揮緩沖作用的角度而言，除了上述成分之外，本發明的冷凍保存溶液可以包含磷酸根離子。然而，從“解凍后直接將細胞施用至活體”的角度而言，優選使該成分較少，或者，冷凍保存溶液可以不含磷酸根離子。本發明的冷凍保存溶液可以這樣制備各稱取所需量的鈉鹽、鉀鹽、糖、冷凍保護劑以及碳酸氫鹽和/或碳酸鹽，并將所有成分溶解于純水或生理鹽水中。或者，冷凍保存溶液可以這樣制備將每種成分分別溶解于純水或生理鹽水中，并將每種成分的溶液以所需的量混合。當按照如上所述準備冷凍保存溶液時，可以將每種成分溶解于純水或生理鹽水中，然后可以對其進行除掉細菌的步驟(例如，細菌消除過濾步驟)。此外，可選地，可以按照相同的方式制備蛋白質、鎂鹽或鈣鹽，并加入其中。或者，可以組合使用含有鈉鹽、 鉀鹽、糖、冷凍保護劑以及碳酸氫鹽和/或碳酸鹽的數種商業上可獲得的溶液。可以在無菌條件下混合商業上可獲得的產品，例如，BI CARBON Infusion (由AJIN0M0T0生產)、日本藥典葡萄糖溶液(例如，由Nissin Pharmaceutical Co.，LTD.生產)、日本藥典氯化鈉溶液(例如，由Otsuka Pharmaceutical Co.，LTD.生產)、日本藥典氯化鉀溶液(例如， 由Otsuka Pharmaceutical Co.，LTD.生產)、日本藥典碳酸氫鈉溶液(例如，由Otsuka Pharmaceutical Co. ,LTD.生產)、CP_1 (KY0KUT0 PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO. ,LTD.) 或Buminate Injection 25% (25%的人血清白蛋白，由Baxter Limited生產)，以包含用于本發明的必要的濃度。當使用本發明的冷凍保存溶液時，滲透壓無特別限定，理想的是，冷凍保存溶液具有不會對細胞產生損傷的滲透壓比。例如，當用于人淋巴細胞的保存時，滲透壓優選為120 至1，500m0sm/L，更優選為250至300m0sm/L。在調節滲透壓時，可以使用用于本發明的冷凍保存細胞方法的溶液的必須成分中的任一項。本發明的冷凍保存溶液的pH沒有特別限定，理想的是，溶液具有不會對細胞產生損傷的PH。例如，當用于保存人淋巴細胞時，pH優選為3. 0至10. 0，更優選為4. 5至9. 0。 當調節pH時，可以使用用于本發明的冷凍保存細胞方法的溶液的必須成分中的任一項。本發明中還包括，如上所述的，用于本發明的冷凍保存細胞方法中的，冷凍保存溶液，其含有包括下列的必須成分鈉鹽、鉀鹽、糖、冷凍保護劑以及碳酸氫鹽和/或碳酸鹽， 另外可選地含有選自下列的成分蛋白質、鎂鹽和鈣鹽。可用于本發明的冷凍保存方法中的細胞包括分離自哺乳動物、包括人類的多種細胞和細胞群體，以及從中誘導的細胞。多種分離的細胞包括，例如，外周血單核細胞(PBMC)、 造血干細胞、臍帶血單核細胞、血細胞系細胞、淋巴細胞、T細胞、B細胞、稚細胞、記憶細胞等，誘導的細胞包括淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK細胞)、細胞毒性T細胞(CTL)、腫瘤浸潤的淋巴細胞(TIL)、NK細胞等，每種具有細胞毒性活性，并且細胞不限于這些細胞。這些細胞可以通過已知的方法制備。當期望的細胞勻質地懸浮于冷凍保存溶液中時，細胞濃度無特別限定，可以根據細胞的種類、細胞的用途和應用、細胞的大小、保存容器的大小、保存期限等適宜地決定細胞濃度，細胞濃度是例如，優選為1 X IO4至1 X IO9個細胞/mL，更優選為1 X IO5至1 X IO9個細胞/mL，甚至優選為2X IO5至5X IO8個細胞/mL。保存容器無特別限定，只要保存容器能夠冷凍保存細胞，可以使用冷凍保存袋子、鋁保護器、特效袋(miracle bag)、低溫管等。在本發明中，冷凍保存細胞的方法是指包括下列步驟的方法將期望的細胞懸浮于本發明的冷凍保存溶液中，以制備細胞懸浮液；將該細胞懸浮液在置于超低溫度的冰箱中靜置，從而將細胞懸浮液保存于冷凍狀態。超低溫度在本文中無特別限定，只要其是使細胞懸浮液完全冷凍的溫度，通常可以是零下60°C或更低。同樣，本發明中也包括使用液氮的冷凍保存細胞的方法。優選地，細胞懸浮液保存于充滿液氮的溫度為零下70°C或更低的冰箱中。根據本發明的方法的冷凍保存時間無特別限定，冷凍保存時間是例如5分鐘至48個月，優選為1天至12個月。然后，根據本發明的方法進行了冷凍保存的細胞懸浮液被解凍，從而可以在非冷凍狀態下進一步保存解凍的細胞懸浮液。換言之，本發明還提供了用于保存細胞的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將經歷冷凍保存的上述細胞懸浮液(即冷凍保存的細胞懸浮液)解凍，并進一步在非冷凍狀態保存解凍的細胞懸浮液，換言之，在液體懸浮狀態保存。解凍冷凍保存的細胞懸浮液的方法無特別限定，優選可以在0°C至40°C、更優選20°C至 37°C的溫度解凍處于冷凍狀態的細胞懸浮液。解凍之后的保存溫度優選是0°C至40°C，更優選4°C至37°C。非冷凍狀態的細胞懸浮液的保存時間無特別限定，保存時間是例如0至 18天，優選0至10天，更優選0至3天。即使在解凍之后，根據本發明的方法進行了冷凍保存的細胞也保持高細胞存活率，在解凍之后繼續保存細胞也是可能的。另外，在解凍之后可以不經歷洗滌細胞的步驟而直接將細胞施用至活體。實施例以下將通過實施例的方式更具體地顯示本發明，但不是意在將本發明的范圍限制于此。在本發明的實施例中，“室溫”是指20°C至30°C。實施例1 關于保存溶液的研究(1)制備待研究的溶液制備如表1所示的溶液作為用于篩選的保存溶液[表 1]表 權利要求
1.用于冷凍保存細胞的方法，其特征在于，使用含有下列物質作為必須成分的溶液 鈉鹽、鉀鹽、糖、冷凍保護劑、以及碳酸氫鹽和/或碳酸鹽，所述溶液另外可選地包含選自下列的成分蛋白質、鎂鹽和鈣鹽。
2.根據權利要求1的方法，其中所述的糖是選自下列的至少一種糖葡萄糖、半乳糖、 果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。
3.根據權利要求1或2的方法，其中所述冷凍保護劑是選自下列的至少一種冷凍保護劑二甲基亞砜、羥乙基淀粉、乙二醇和甘油。
4.根據權利要求1至3中任一項的方法，其中所述蛋白質是源自血液的蛋白質。
5.用于保存細胞的方法，其特征在于，所述方法包括使根據權利要求1至4中任一項的方法進行了冷凍保存的細胞溶液解凍；和，進一步將該細胞溶液保存在液體懸浮狀態。
6.細胞的冷凍保存溶液，其特征在于，所述冷凍保存溶液包含作為必須成分的下列物質鈉鹽、鉀鹽、糖、冷凍保護劑、以及碳酸氫鹽和/或碳酸鹽，并且所述溶液另外可選地包含選自下列的成分蛋白質、鎂鹽和鈣鹽。
全文摘要
冷凍保存細胞的方法，其特征在于使用含有作為必須成分的下列物質的溶液鈉鹽、鉀鹽、糖、冷凍保護劑、以及碳酸氫鹽和/或碳酸鹽，該溶液還可選地包含選自下列的成分蛋白質、鎂鹽和鈣鹽。根據本發明，提供了用于冷凍保存細胞的方法，所述細胞能夠在解凍之后維持高存活率，還提供了用于冷凍保存的冷凍保存溶液。另外，通過使用該冷凍保存方法，即使在解凍之后，細胞也可以保存在維持高存活率的狀態，并維持其生理功能；此外，冷凍和解凍之后的細胞洗滌步驟是不必要的，從而使其在細胞的基礎研究和醫學處理的應用性研究上是非常有用的。
文檔編號C12N5/07GK102482641SQ20108003732
公開日2012年5月30日 申請日期2010年8月17日 優先權日2009年8月19日
發明者榎龍嗣, 田邊雅茂, 磯野友美 申請人:寶生物工程株式會社