制備植物來源的vlp的方法

專利名稱：制備植物來源的vlp的方法
技術領域：
本發明涉及制備植物來源的病毒樣顆粒(virus like particle, VLP)的方法。
背景技術：
目前宿主細胞(如大腸桿菌、昆蟲細胞培養物和哺乳動物細胞培養物)中的重組表達策略在培養基中以非常高的水平表達和分泌蛋白質。使用這些系統獲得了高水平表達、正確蛋白質折疊和蛋白質翻譯后修飾。此外，由于可以容易地將細胞內蛋白質與其他組分(DNA、囊泡、膜、色素等)分離，所表達蛋白質的純化得以簡化。對于植物或酵母表達系統，細胞壁阻止表達的蛋白質分泌到培養基中。對抗病毒感染的一種主要方法是通過免疫接種。應對流行爆發或滿足季節性需求(例如，每年秋季發生的“流感季”或最近全球爆發的“豬流感”)的疫苗生產需要在獲知后短時間內生產足量的疫苗。在面對全球流感大流行時，目前全球的流感疫苗產量可能不足。此外，主導(dominant)流感毒株每年變化，因此在一年中的低需求時間中儲備是不實際的。經濟、大規模地生產有效的流感疫苗有顯著價值。病毒樣顆粒(VLP)可用于制備流感疫苗。超結構(suprastructure)(如VLP)模擬病毒衣殼結構，但缺少基因組，從而不能復制或提供再次感染。VLP刺激強免疫應答，為分離(可溶)的重組抗原提供了替代方法。VLP在特定病毒蛋白表達后進行組裝并具有類似于其同類病毒的外表面，但不同于真的病毒顆粒，遺傳物質不會整合到其中。與天然病毒類似的顆粒狀多價結構抗原的呈遞引發具有均衡的體液和細胞成分的增強的免疫應答刺激。 認為優于分離抗原產生之刺激的這種改進對于包膜病毒尤其適用，因為包膜VLP以其天然膜結合狀態呈遞表面抗原(Grgacic和Anderson，2006年，Methods 40，60-65)。此外，已證明與重組血凝素(HA)(即單體HA，或組成花環的HA;3-8個三聚體的HA組裝物)相比， 擁有納米顆粒組織結構的流感VLP是更佳的候選疫苗，并且他們能激活體液和細胞免疫應答。(Bright，R.A.，等，2007，Vaccine 25,3871-3878)。目前市場上的絕大部分流感疫苗由從蛋中培養之病毒粒獲得的病毒顆粒或病毒抗原構成。來源于蛋的疫苗的生產依賴于在具有胚胎的雞蛋中培養活病毒。在用去污劑化學滅活和破壞純化的病毒粒后獲得裂解流感疫苗。作為大流行性疫苗產品，重組流感抗原是病毒來源抗原的有效替代品。一旦可獲得新毒株的遺傳構成信息，可以使用該信息生產重組抗原，并且其允許快速啟動生產過程。但是，與滅活的裂解流感疫苗相比，純化的重組HA亞基表現出更低的效力，并且需要更高的抗原含量來產生強免疫應答(Treanor等， 2007，J. Am. Med. Assoc. 297，1577-1582)。已通過在培養的哺乳動物細胞中共表達全部10種流感病毒蛋白獲得流感 VLP (Mena等，1996年，J. Viro 1. 70，5016-5024)。幾種病毒蛋白對于VLP的生產是可缺省的， 而且在疫苗發展中已通過共表達2種主要抗原性包膜蛋白(HA和NA)以及Ml或者僅共表達 HA 和 Ml 生產流感 VLP (Kang 等，2009 年，Virus Res. 143，140-146)。Chen 等(2007 年， J. Virol. 81,7111-7123)證實單獨的HA可以驅動VLP形成和出芽，在他們的系統中可以省去Ml共表達。但是，由于發現HA與產生VLP的哺乳動物細胞表面的唾液酸化糖蛋白結合，所以共表達了病毒唾液酸酶以使VLP在出芽后從生產細胞中釋放。期望有更簡單的VLP生產系統(例如依賴于表達僅一種或幾種病毒蛋白質而不需要表達非結構病毒蛋白的生產系統)以加快疫苗的開發。在植物系統中生產病毒抗原(包括VLP)提供了這樣的生產優勢，既它們可以在溫室或田間培養，不需要無菌組織培養法和處理。PCT公開WO 2006/119516 (Williamson和Rybicki)公開了在植物中表達流感病毒A/越南/1194/2004的全長和截短的人密碼子優化H5HA。截短的構建體缺少膜錨定結構域。通過靶向ER的構建體獲得最高的HA蛋白積累。缺少膜靶向結構域的構建體沒有產生可檢測的HA。沒有報道VLP的生產情況。之前WO 2009/009876和WO 2009/076778的發明人已描述了包含脂質包膜的流感 HAVLP的生產(D’ Aoust等；兩者均通過引用并入本文)。對于包膜病毒，病毒保留脂質層或膜可以是有利的。不同系統的脂質構成可以有所不同(例如植物生成的包膜病毒會在包膜中包含植物脂質或植物留醇)，這可有助于增強免疫應答。Mason等描述了表達HBV表面抗原(HBsAg)的轉基因煙草中包膜VLP的組裝 (1992 年，Proc. Natl. Acad. ki. USA 89,11745-11749)。已證明植物生成的 HBV VLP 在腸胃外施用時在小鼠中顯示出誘導強B和T細胞免疫應答((Huang等，2005年，Vaccine 23， 1851-1858)，但飼喂實驗的口服免疫僅誘導了中度的免疫應答(Smith等，2003年，Vaccine 21,4011-4021)。Greco (2007 年，Vaccine 25,8228-8240)證明與 HBsAg 融合的人免疫缺陷病毒(HIV)表位在轉基因煙草和擬南芥(Arabidopsis)中表達時累積為VLP，產生了二價 VLP疫苗。在轉基因煙草和馬鈴薯植株中表達病毒衣殼蛋白(NVCP)導致無包膜VLP的組裝 (Mason 等，1996 年，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93，5335-5340)。已在農桿菌浸潤的本塞姆氏煙草(N. benthamiana)葉中產生了 NVCP VLP (Huang等 2009年，Biotechnol. Bioeng. 103， 706-714)，并且在小鼠中證實了其口服施用后的免疫原性(Santi等，2008年，Vaccine26, 1846-1854)。給健康成人志愿者施用含有215-751 μ gVLP形式的NVCP的2或3劑量生馬鈴薯在95%的免疫志愿者中產生免疫應答(Tacket等2000年，J. Infect. Dis. 182，302-305)。 還由 HBV 核心抗原(HBcAg ；Huang 等，2009 年，Biotechnol. Bioeng. 103，706-714)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)主要衣殼蛋白 Ll (Varsani 等，2003 年，Arch. Virol. 148，1771-1786)的表達獲得了無包膜VLP。可期望在將VLP用于疫苗制備之前從植物或植物物質中存在的一些或全部蛋白質、碳水化合物等中分離VLP。PCT公開WO 00/09725 (Turpen等)描述了一種從植物的細胞間隙提取蛋白質的方法，包括真空和離心處理以提供包含目的蛋白質的間質液 (interstitial fluid)提取物。該方法適于能在真空和離心條件下通過孔的小蛋白質 (50kDa或更小)，但不適于較大超級結構蛋白(superstructure protein)或蛋白復合物如 VLP。1999 年 McCormick 等(Proc Natl Acad Sci USA 96:703-708)公開了使用與單鏈Fv(scFV)表位融合的大米淀粉酶信號肽將表達的蛋白質靶向到細胞外部分 (compartment)，隨后通過對葉和莖組織進行真空過濾來回收scFv多肽。2008年Moehnke 等(Biotechnol Lett 30 =1259-1264)描述了使用McCormick的真空過濾法通過質外體提取從煙草中獲得重組植物過敏原。PCT公開WO 2003/025124 Oiang等)公開了在植物中表達scFv免疫球蛋白，其通過鼠信號序列靶向質外體空間。考慮到VLP和生產它們的植物組織的復雜性，期望有這樣的VLP制備方法，其中 VLP基本上不含植物蛋白質或容易與其分離，但仍保留包膜病毒的結構和免疫原特性。發明概述本發明涉及制備植物來源的病毒樣顆粒(VLP)的方法。更具體地，本發明涉及制備包含流感抗原的VLP的方法。本發明的一個目的是提供制備植物來源的病毒樣顆粒的改進方法。本發明提供了制備植物來源之VLP的方法(A)，包括獲取定位于質外體 (apoplast)中的包含植物來源之VLP的植物或植物物質；產生原生質體(protoplast)和質外體級分，質外體級分包含植物來源的VLP ；回收質外體級分。該方法還可包括從質外體級分純化植物來源之VLP的步驟。植物來源之VLP可以是嵌合的植物來源VLP。植物來源的VLP可選自以下組病毒包膜蛋白(viral envelope protein)、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白(viral coat protein) 0植物來源的VLP可以包含流感血凝素。質外體和原生質體級分可以通過用酶組合物處理植物或植物物質來產生。酶組合物可以包括一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。此外，如期望，酶組合物不包括脂肪酶或蛋白酶，或該組合物不包括添加的脂肪酶或蛋白酶。植物或植物物質可以通過種植、收集或者種植并收集植物來獲得。植物物質可以包括一部分或整株植物、植物細胞、葉、莖、根或培養的植物細胞中的一種或多于一種。本發明提供了如上所述(方法A)制備植物來源之VLP的方法，其中編碼VLP的核酸以瞬時方式引入植物，所述VLP選自病毒包膜蛋白、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白的組。或者，核酸穩定地整合進植物基因組。本發明提供如上所述(方法A)制備植物來源的VLP的方法，其還包括從質外體級分純化植物來源的VLP的步驟。純化步驟可以包括通過深層過濾(cbpth filtration)來過濾所述質外體級分以產生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂來層析所述澄清的提取物。不希望被理論所約束，從質外體獲取的蛋白質較為均一，因為翻譯后修飾蛋白的中間形式或包含在多種細胞內部分進行之其他類型的加工的蛋白質沒有被共提取。重組蛋白均一性水平更高通常使得包含該蛋白質的制劑的質量更高，并可生成具有更高的效力、 更長的半衰期或更好的免疫力的有益特性的產品。例如，與含有復合糖基化的蛋白質相比， 含有高度甘露糖糖基化的血液蛋白在血液循環中被更快地被清除。產生于質外體級分的糖基化蛋白表現出更復合類型的糖基化。因此，使用本文所述方法(其涉及細胞壁消化)制備的質外體來源蛋白表現出，例如在循環中更長的半衰期。本發明還提供了制備包含植物來源之脂質包膜的植物來源VLP的方法(B)，所述方法包括獲取包含位于質外體之VLP的植物或植物物質；用酶組合物處理植物或植物物質以產生原生質體級分和一種或多于一種質外體蛋白組合物；將所述一種或多于一種質外體蛋白復合物與所述原生質體級分分離，其中所述一種或多于一種質外體蛋白復合物包含 VLP。所述酶組合物可以包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。此外，如期望，酶組合物不包含脂肪酶或蛋白酶，或該組合物不包含添加的脂肪酶或蛋白酶。植物來源的VLP可以是嵌合的植物來源 VLP。植物來源的VLP可以選自病毒包膜蛋白、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白的組。植物來源的VLP可以包含流感血凝素。本發明提供了如上所述(方法B)制備植物來源之VLP的方法，其中編碼VLP(選自病毒包膜蛋白、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白的組)的核酸以瞬時方式引入植物。或者，核酸穩定地整合進植物基因組。本發明提供如上所述(方法B)的制備植物來源的VLP的方法，其還包括從質外體級分中純化植物來源的VLP的步驟。所述純化步驟可以包括使用深層過濾來過濾質外體級分以產生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂層析所述澄清的提取物。植物來源VLP可以包含一種或更多種流感HA多肽。流感HA多肽還可以是嵌合HA 多肽。植物來源的VLP還可以包含凝血活性。植物或植物物質可以通過培養、收集或者培養并收集植物來獲得。所述植物物質可以包括部分或全部植物或者植物細胞、葉、莖、根或培養的細胞中的一種或多于一種。本發明還提供了制備植物來源的VLP的方法(C)，包括獲取包含植物來源的VLP的植物或植物物質，用細胞壁降解酶組合物消化所述植物物質以產生消化級分，過濾所述消化級分以產生過濾級分，從所述過濾級分中回收植物來源的VLP。所述酶組合物可以包含一種或多于一種果膠酶，一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。此外，如期望，酶組合物不包含脂肪酶或蛋白酶，或該組合物不包含添加的脂肪酶或蛋白酶。植物來源的VLP可以是嵌合的植物來源VLP。植物來源的VLP可以選自病毒包膜蛋白、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白的組。植物來源的VLP可以包含流感血凝素。本發明提供了如上所述(方法C)制備植物來源之VLP的方法，其中編碼VLP(選自病毒包膜蛋白、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白的組)的核酸以瞬時方式引入植物。或者，核酸穩定地整合進植物基因組。本發明提供如上所述(方法C)的制備植物來源的VLP的方法，其還包括將過濾級分中的VLP與細胞碎片和不溶物質分離的步驟。分離步驟可以通過離心、深層過濾或者離心并深層過濾來進行以產生澄清的級分。植物來源的VLP可以通過層析來進一步純化，例如，澄清的提取物可以使用陽離子交換樹脂來純化。植物來源VLP可以包括包含一種或更多種流感HA多肽的VLP。流感HA多肽還可以是嵌合HA多肽。植物來源的VLP還可以包含凝血活性。植物或植物物質可以通過培養、 收集或者培養并收集植物來獲得。所述植物物質可以包括部分或全部植物或者植物細胞、 葉、莖、根或培養的細胞中的一種或多于一種。不希望被理論所約束，包含植物來源脂質的植物制得的VLP可以誘導比用其他生產系統制得的VLP更強的免疫反應，并且這些植物制得的VLP誘導的該免疫反應比活或減毒全病毒疫苗所誘導的免疫反應更強。從宿主細胞獲得的蛋白提取物成分是復雜的，并且往往包含與待分離的目的蛋白質或超結構一起的細胞外和細胞內成分。制備質外體級分隨后進行分離細胞內蛋白質和成分的步驟是有利的，因為目的蛋白質或超結構可以在制造過程中被富集和提高效力。包括更少有效步驟的更簡單過程可以顯著增加產量并且降低成本。還發現用細胞壁降解酶消化細胞壁的過程提高VLP蛋白的產量，即使在原生質體在提取過程中不保持完整的情況下也是如此。不希望被理論所約束，細胞壁消化步驟可松動細胞壁的多聚成分，并有助于使VLP 釋放而非結合在細胞壁中。該方案還可以將細胞內成分對VLP的污染降到最低。消化植物細胞壁的方法是已知的，并且消化細胞壁的酶混合物(enzyme cocktail mixture)可以有所不同。本發明并不受所用的細胞壁消化方法限制。與使用勻漿、攪拌(blending)或研磨來制備植物來源之VLP的方法相比，本文所述方法使植物來源的VLP提取物受到更少的破壞和污染。本文所述方法提供植物組織的質外體級分并且可以保持原生質體及其成分的完整性。本文所述方法即使在原生質體或原生質體的一部分失去其完整性而不再完整的情況下也能有效純化VLP。與涉及標準組織破碎技術(例如，勻漿、攪拌或研磨)的VLP提取方法相比，這些方法提供更高的VLP產量。更高的產量可以部分歸因于破壞VLP和/或脂質包膜之結構完整性的剪切力的減少。從質外體級分制備VLP可以是有利的，因為質外體級分具有顯著降低的細胞質蛋白或不含細胞質蛋白。因此，在質外體級分中將其他蛋白質和物質(包括HA 單體、三聚體或HA片段)與VLP分離可以被容易地實施。但是，即使原生質體制備物或部分原生質體制備物是不完整的，VLP的產量增加也可以通過本文所述方法來實現。與通過標準組織破碎技術獲得的VLP相比，本發明的VLP的特征還在于顯示出更高的凝血活性。這種改進的凝血活性可歸因于完整VLP產量更高(溶液中游離的HA單體或三聚體更少)、具有完整脂質包膜的完整VLP產量更高，或其組合。與用全病毒制成的疫苗相比，用VLP制成的疫苗的優勢在于它們是無感染性的。 因此，不用考慮生物防護并且這在生產中也是不需要的。植物制備的VLP提供的另外一個優勢是允許在溫室或田間培養表達系統，從而顯著地更加經濟并適于擴大規模。 此外，植物不包含參與向蛋白質合成或添加唾液酸殘基的酶。VLP可以在沒有神經氨酸酶(NA)的情況下產生，并且不需要共表達NA或用唾液酸酶(神經氨酸酶)處理生產細胞或提取以確保植物中的VLP生產。本發明的該概述并不必然描述本發明的所有特征。附圖簡述本發明的這些和其他特征將從以下描述中顯而易見，其中參照了以下附圖

圖1顯示了表達H5A/印度尼西亞/5/05血凝素的基于CPMVHT的表達盒(構建體 685)。圖2顯示了 A)表達H5/lndo (構建體編號685)的構建體的部分(從I^acI (35S啟動子上游)到AscI (緊鄰NOS終止子的下游))核酸序列(SEQ ID NO. 1)。來自A/印度尼西亞/5/2005的H5的編碼序列以下劃線表示。圖2B顯示了構建體編號685編碼的H5A/ 印度尼西亞/5/05的氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)。圖3顯示了用體積排阻層析(SEC)表征的包含血凝素(HA)的結構。離心經消化的植物提取物之后，重懸沉淀并通過SEC分離。圖3A顯示了每個級分的總可溶性蛋白質含量(實心三角形；左側Y-軸，最大值用Bradford法測定)。還顯示了所收集級分(實心柱；右側Y-軸)的凝血活性。圖3B顯示了 SEC洗脫級分的SDS-PAGE分析結果。通過丙酮沉淀級分并在分析前用1/40體積的還原性樣品上樣緩沖液重懸。用0. 的考馬斯R-250溶液對凝膠染色。純化的VLP用作跑膠對照。對應于HAO單體的帶用箭頭表示。MW-分子量標準(kDa) ；C-純化的VLP(對照)；泳道7至10和14至16對應于圖3A所示的SEC分析洗脫的級分編號。圖4顯示了酶消化和通過Comitrol 勻漿器機械勻漿所獲得的蛋白譜對比。用變性樣品上樣緩沖液處理樣品，通過洗脫級分的SDS-PAGE分析分離蛋白質。用0. 的考馬斯R-250溶液對凝膠染色。MW-分子量標準(kDa)；泳道1_25 μ 1酶混合物；泳道2_25 μ 1 植物組織酶消化物，泳道3-通過Comitrol勻漿器獲得的5 μ 1提取物。圖5顯示了 HA表達盒的核酸序列(SEQ ID NO :9)，其包括苜蓿質體藍素啟動子和5’ UTR、A/印度尼西亞/5/2005(構建體號660)的H5的血凝素編碼序列、苜蓿質體藍素 3’ UTR和終止子序列。圖6顯示了陽離子交換樹脂捕獲的直接來自質外體級分的HA-VLP分離物的 HA-VLP。樣品用非還原變性樣品上樣緩沖液處理，通過SDS-PAGE分離蛋白質。用0.1%考馬斯R-250溶液對凝膠染色。泳道1 離心后的質外體級分；泳道2-3 連續微過濾后的質外體級分；泳道4 陽離子交換的上樣物；泳道5 陽離子交換的流出級分。泳道6 ；陽離子交換的洗脫物，濃縮10倍；泳道7 分子量標準(kDa)。圖7顯示了 H5/lndo VLP(A)、澄清之后沒有向消化緩沖液中添加NaCl的Hl/Cal VLP (B)和進行了該添加的Hl/Cal VLP(C)的納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking analysis，NTA)譜。NTA 實驗是用 NanoSight LM20 (NanoSight, Amesbury, UK)進行的。該裝置配備了藍激光G05nm)、樣品室和Viton氟橡膠0型圈。室溫下記錄視頻并用NTA2. O 軟件分析。樣品記錄60秒。手動選擇快門和增益(gain)以獲得最優粒子分辨率。圖8顯示了用不同緩沖液酶消化產生的H3/布里斯班VLP提取物的Western印跡結果。泳道 1)純重組 HA 標準(5 μ g，Immune Technology Corp. IT-003_0042p)，泳道 2-5包含7 μ 1如下緩沖液中進行的離心酶提取物泳道2~) 600mM甘露糖醇+125m檸檬酸鹽 +75mM NaP04+25mMEDTA+0. 04% 亞硫酸氫鹽(pH6. 2)，泳道 3) 600mM 甘露糖醇+125mM 檸檬酸鹽 +75mM NaP04+50mM EDTA+0. 04% 亞硫酸氫鹽(pH6. 2)，泳道 4) 200mM 甘露糖醇 +125mM 檸檬酸鹽 +75mM NaP04+25mMEDTA+0. 03% 亞硫酸氫鹽(pH6. 2)，泳道 5) 200mM 甘露糖醇 +125mM 檸檬酸鹽+75mM NaP04+50mM EDTA+0. 03%亞硫酸氫鹽(pH6. 2)。箭頭代表HAO的免疫檢測信號。詳細描述本發明涉及制備植物來源的病毒樣顆粒(VLP)的方法。更具體地，本發明涉及制備包含流感血凝素(HA)的VLP的方法。以下描述是一個優選的實施方案。本發明提供了獲取目的蛋白質或蛋白超結構的方法。目的蛋白質可以存在于質外體或細胞外部分(compartment)中(對應于除原生質體/原生質球(spheroplast)部分之外的植物細胞部分)。該方法包括去除、消化或者消化并去除包圍植物細胞的纖維素植物細胞壁。通過消化細胞壁，細胞壁的聚合成分松動，目的蛋白質或蛋白超結構可以更容易地釋放。通過使用該方法，目的蛋白質或蛋白質超結構被富集，這是由于包含的主要宿主細胞蛋白和成分的原生質體/原生質球部分與質外體分離。如下所述，如果在過程中原生質體/ 原生質球部分失去完整性，如果原生質體/原生質球部分是不完整的，如果來自原生質體/原生質球部分的部分宿主細胞蛋白和成分存在于質外體級分中，本文提供的方法在獲得目的蛋白質或蛋白超結構方面仍然有效。蛋白超結構的實例是由2個或更多個多肽構成的結構；所述多肽可以是相同或不同的；如果是不同的，它們的存在比例可以為約1 1至約10 1或更高。蛋白超結構還可以包含一種或更多種脂質、磷脂、核酸、膜等。2個或更多個多肽可以通過共價鍵、二硫鍵、電荷相互作用、疏水吸引力、范德華力、氫鍵等連接。蛋白超結構的例子是病毒樣顆粒(VLP)， 其可以是包膜或非包膜的，例如病毒包膜蛋白、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白或病毒外殼蛋白。本發明還提供了制備植物來源的病毒樣顆粒(VLP)的方法。該方法包括獲取包含定位于質外體中的植物來源VLP的植物或植物物質；由植物物質產生原生質體/原生質球級分和質外體級分，質外體級分包含植物來源的VLP，以及回收質外體級分。如期望的話，可從質外體級分中純化植物來源的VLP。本發明還提供了制備包含植物來源的脂質包膜的VLP的方法。該方法包括獲取包含VLP的植物或植物物質，用酶組合物處理植物或植物物質以產生一種或多于一種質外體蛋白復合物和原生質體/原生質球級分，將一種或多于一種質外體蛋白復合物與原生質體級分分離。所述一種或多于一種質外體蛋白復合物包含含有植物來源的脂質包膜的VLP。本發明還提供了制備植物來源的VLP的方法，其包括獲取包含植物來源的VLP的植物或植物物質，用細胞壁降解酶組合物消化植物物質以產生消化級分，過濾消化級分以產生過濾級分，和從過濾級分回收植物來源的VLP。在這個方法中，原生質體的完整性可以不是必需的。原生質體是完全或部分去除細胞壁的植物細胞。原生質球可以部分去除細胞壁。 原生質體、原生質球或原生質體和原生質球(原生質體/原生質球)均如本文所述使用，并且本文使用的這些術語是可以互換的。可以通過機械方式(例如通過勻漿、攪拌)破碎和去除細胞壁，可全部或部分地酶消化細胞壁，或可以通過機械和酶聯合的方法去除細胞壁， 例如勻漿之后用酶處理以消化細胞壁。原生質體也可以從培養的植物細胞獲取，例如從液體培養的植物細胞或固體培養的植物細胞。給出植物組織培養物、培養的植物細胞和原生質體、原生質球生產等的一般原則的標準參考文獻包括 introduction to Plant Tissue Culture, MK Razdan 著， 第二版(Science Publishers，2003年；通過引用并入本文)，或例如參見下述URL : molecular-plant-biotechnology, info/plant-tissue-culture/protoplast-isolation, htm。與原生質體(或原生質球)的生產和操作相關的方法和技術綜述于，例如，Davey MR等，2005 (Biotechnology Advances 23 :131-171 ；通過引用并入本文)。給出蛋白生物化學、分子生物學等的一般方法與原則的標準參考文獻包括，例如Ausubel等，Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons，New York(1998 年禾口 2001 年的增干1J ；通過弓I用并入本文)；Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989 (通過弓|用并入本文)；Kaufman 等編· ,Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton，1995 (ilil弓入*t) ；McPherson H, Directed Mutagenesis :A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1991 (通過弓|用并入本文)。
消化或降解細胞壁以釋放原生質體或原生質球的酶是本領域技術人員已知的，可以包括纖維素酶(EC 3. 2. 1.4)、果膠酶(EC 3. 2. 1. 15)、木聚糖酶(EC 3. 2. 1.8)、幾丁質酶(EC 3.2. 1.14)、半纖維素酶或其組合。合適的酶的非限制性實例包括多組分酶的混合物，其包含纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，例如MACER0ZYME (約含纖維素酶0. lU/mg, 半纖維素酶0. 25U/mg，和果膠酶0. 5U/mg)。另一些商業化酶、酶混合物的例子和供應商列于表1 (參見Jntroduction to Plant Tissue Culture, MK Razdan 第二版，Science Publishers,2003 年)。替代性的纖維素酶的名稱和種類包括內-I，4_i3-D-葡聚糖酶；β-1，4_葡聚糖酶；β -1，4-葡聚糖內切水解酶；纖維素酶A ;cellulosin AP ；葡聚糖內切酶D，堿性纖維素酶；纖維素酶A3;纖維素糊精酶(celludextrinase) ；9. 5纖維素酶；微晶纖維素酶; pancellase SS和1，4_ (1，3 ； 1，4) - β-D-葡聚糖4_葡聚糖水解酶。替代性的果膠酶(多聚半乳糖醛酸酶)的名稱和種類包括果膠去聚合酶；果膠酶；多聚半乳糖醛酸內切酶； 果膠酶(pectolase)；果膠水解酶；果膠多聚半乳糖醛酸酶；多聚半乳糖醛酸內切酶；多聚- α -1，4-半乳糖醛酸聚糖水解酶；半乳糖醛酸內切酶；內-D-半乳糖醛酸酶和多聚(1， 4-a-D-半乳糖醛酸)聚糖水解酶。替代性的木聚糖酶的名稱和種類包括半纖維素酶， 內-(1 — 4) - β -木聚糖4-木聚糖水解酶；內-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；β -1，4-木聚糖酶；內-1，4-木聚糖酶；內-β -1，4-木聚糖酶；內-1，4- β -D-木聚糖酶；1，4- β -木聚糖木聚糖水解酶；β -木聚糖酶；β -1，4-木聚糖木聚糖水解酶；內-1，4-β -木聚糖酶；β -D-木聚糖酶。替代性的幾丁質酶的名稱和種類包括幾丁質糊精酶；1，4-β -多聚-N-乙酰氨基葡糖苷酶；多聚-β -氨基葡糖苷酶；β -1,4-多聚-N-乙酰氨基葡糖苷酶 ’多聚[1，4-(Ν-乙酰-β -D-氨基葡糖苷酶)]聚糖水解酶。表1 用于原生質體分離的市售酶的非限制性實例
權利要求
1.制備植物來源的VLP的方法，其包括a.獲取包含定位于質外體的VLP的植物或植物物質，b.產生原生質體/原生質球級分和質外體級分；和，c.回收所述質外體級分，所述質外體級分包含所述植物來源的VLP。
2.權利要求1的方法，其中在所述產生步驟(步驟b)中，通過用細胞壁降解酶組合物處理所述植物或植物物質來產生所述質外體級分和原生質體級分。
3.權利要求2的方法，其中所述細胞壁降解酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。
4.權利要求3的方法，其中所述細胞壁降解酶組合物不包含脂肪酶、蛋白酶或果膠酶中的一種或更多種。
5.權利要求1的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用編碼選自以下組的蛋白質的核酸序列轉化所述植物病毒包膜蛋白、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白， 以及收集所述植物或植物物質。
6.權利要求5的方法，其中所述核酸以瞬時方式引入所述植物中。
7.權利要求5的方法，其中所述核酸穩定整合進所述植物的基因組。
8.權利要求1的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，培養所述植物并收集所述植物或植物物質。
9.權利要求5的方法，其中所述核酸編碼流感血凝素。
10.權利要求1的方法，其中所述植物來源的VLP不包含神經氨酸酶或M蛋白。
11.權利要求1的方法，其中所述植物物質選自葉和培養的植物細胞的組。
12.權利要求1的方法，其還包括步驟d)從所述質外體級分中純化所述植物來源的VLP。
13.權利要求12的方法，其中所述純化步驟包括利用深層過濾來過濾所述質外體級分以產生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂來層析所述澄清的提取物。
14.制備包含植物來源之脂質包膜的植物來源VLP的方法，其包括a.獲取包含定位于質外體的VLP的植物或植物物質，b.用酶組合物處理所述植物或植物物質，以產生原生質體/原生質球級分和一種或多于一種包含所述VLP的質外體蛋白復合物；以及c.將所述一種或多于一種質外體蛋白復合物與所述原生質體級分分離。
15.權利要求14的方法，其中所述酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。
16.權利要求14的方法，其中所述酶組合物不包含脂肪酶、蛋白酶或果膠酶中的一種或更多種。
17.權利要求14的方法，其還包括步驟d)從所述質外體級分中純化所述植物來源的VLP。
18.權利要求17的方法，其中所述純化步驟包括利用深層過濾來過濾所述質外體級分以產生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂來層析所述澄清的提取物。
19.權利要求14的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用編碼選自以下組的蛋白質的核酸序列轉化所述植物病毒包膜蛋白、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白，以及收集所述植物或植物物質。
20.權利要求19的方法，其中所述核酸以瞬時方式引入所述植物中。
21.權利要求19的方法，其中所述核酸穩定整合進所述植物的基因組。
22.權利要求14的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，培養所述植物并收集所述植物或植物物質。
23.權利要求19的方法，其中所述VLP包含流感血凝素。
24.權利要求14的方法，其中所述植物物質選自葉和培養的植物細胞的組。
25.權利要求14的方法，其中所述VLP不包含神經氨酸酶或M蛋白。
26.制備植物來源的VLP的方法，其包括a.獲取包含植物來源的VLP的植物或植物物質；b.用細胞壁降解酶組合物消化所述植物物質以產生消化級分；c.過濾所述消化級分以產生過濾級分，從所述過濾級分中回收所述植物來源的VLP。
27.權利要求沈的方法，其中所述細胞壁降解酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、 一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。
28.權利要求27的方法，其中所述細胞壁降解酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、 一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。
29.權利要求27的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用編碼選自以下組的蛋白質的核酸序列轉化所述植物病毒包膜蛋白、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白，以及收集所述植物或植物物質。
30.權利要求四的方法，其中所述核酸以瞬時方式引入所述植物中。
31.權利要求四的方法，其中所述核酸穩定整合進所述植物的基因組。
32.權利要求四的方法，其中所述植物來源的VLP包含流感血凝素。
33.權利要求27的方法，其中所述植物物質選自葉和培養的植物細胞的組。
34.權利要求沈的方法，其還包括步驟d)將所述過濾級分中的VLP與細胞碎片和不溶物質分離開。
35.權利要求34的方法，其中所述分離步驟通過離心進行。
36.權利要求34的方法，其中所述分離步驟通過深層過濾進行。
37.權利要求27的方法，其還包括步驟d)從所述過濾級分中純化所述植物來源的VLP。
38.權利要求34的方法，其中所述純化步驟包括深層過濾所述過濾級分以產生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂來層析所述澄清的提取物。
全文摘要
提供了制備植物來源之病毒樣顆粒(virus like particle，VLP)的方法。該方法可包括獲取包含定位于質外體(apoplast)之VLP的植物或植物物質，從所述植物或植物物質產生原生質體(protoplast)/原生質球(spheroplast)級分和質外體級分，以及回收質外體級分。質外體級分包含植物來源的VLP。或者，可以通過用細胞壁降解酶組合物消化植物物質來產生消化級分，從而從包含植物來源之VLP的植物或植物物質獲得VLP。過濾消化級分以產生過濾級分，從過濾級分中回收植物來源的VLP。
文檔編號C12N7/00GK102549148SQ201080042333
公開日2012年7月4日 申請日期2010年9月21日 優先權日2009年9月22日
發明者米凱萊·達吉斯, 路易斯-菲利普·韋齊納, 達尼·帕克特, 馬克-安德烈·德奧斯特, 馬農·科圖雷 申請人:麥迪卡格公司