專利名稱：包含末端取代的sirna化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及經修飾的SiRNA化合物、包含其的藥物組合物以及使用其抑制基因表達的方法。所述化合物和組合物展現有利的特性(包括敲低靶標基因表達的活性)，且用于治療罹患在其中基因表達具有不利影響的疾病或病況和/或與此疾病或病況相關的癥狀或有患上該疾病或病況的風險的受試者。
背景技術：
本發明受讓人的PCT專利公布No. W02008/104978及W02009/044392中公開新的 siRNA結構，所述專利以全文引用的方式并入本文中。仍需要展現增強的敲低基因表達的活性、提高的穩定性和/或降低的脫靶效應的活性且有效的siRNA治療劑。發明概述本文所公開的雙鏈RNA(dsRNA)化合物具有可例如增強活性、提高穩定性、降低免疫原性、增強對RISC復合物的負載和/或使毒性最小的結構及修飾；siRNA的新修飾可有利地應用于用于阻止或削弱靶標基因表達的雙鏈RNA。本文提供用于下調基因表達的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸化合物。本發明在某種程度上基于如下意外的觀測結果包含有義鏈及互補反義鏈且在反義鏈的5’端核苷酸與靶標RNA的核苷酸之間具有錯配的雙鏈核酸分子顯示有效下調靶標基因的活性。在優選實施方案中，dsRNA包含在反義鏈的位置1(5’端)上取代而替代胞苷或鳥嘌呤的腺苷、脫氧腺苷、尿苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或胸苷。根據一方面，提供具有下述所列結構(A)的經修飾的雙鏈核酸分子(A) 5，N1-(N)x-Z3，(反義鏈)3，Z，-N2-(N，)y_z，，5，(有義鏈)其中N2、N及N’各自為未經修飾或經修飾的核糖核苷酸或非常規部分；其中(N)X及(N’)y各自為寡核苷酸，其中每個連續N或N’通過共價鍵與相鄰N 或N’連接；其中χ及y各自獨立地為17至39的整數；其中(N，)y的序列與(N)x的序列互補，且(N)X與靶標RNA中的連續序列互補；其中N1與(N) χ共價結合，且與靶標RNA錯配或為與靶標RNA互補的DNA部分；其中N1選自由天然或經修飾的尿苷、脫氧核糖尿苷、核糖胸苷、脫氧核糖胸苷、腺苷或脫氧腺苷組成的組的部分；其中ζ”可存在或不存在，但若存在，則為共價連接于N2-(N’ )y的5’端的加帽部分；及其中Z及Z’各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地為共價連接于其所存在的所述鏈的3’端的1-5個連續核苷酸、連續非核苷酸部分或其組合。在一些實施方案中，(N’ )y的序列與(N)X的序列完全互補。在各種實施方案中， N2-(N')y的序列與N1-(N)x的序列互補。在一些實施方案中，(N)x包含與靶標RNA中的約 17至約39個連續核苷酸完全互補的反義序列。在其它實施方案中，(N)x包含與靶標RNA 中的約17至約39個連續核苷酸實質上互補的反義序列。在一些實施方案中，N1和N2形成沃森-克里克(Watson-Crick)堿基對。在ー些實施方案中，N1與N2形成非沃森-克里克堿基對。在一些實施方案中，堿基對在核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸之間形成。在一些實施方案中，χ = y = 18，x = y = 19或χ = y = 20。在優選實施方案中， χ = y = 18。在一些實施方案中，N1與(N)x共價結合且與靶標RNA錯配。在各種實施方案中， N1與(N) χ共價結合且為與靶標RNA互補的DNA部分。在一些實施方案中，處于反義鏈的位置1的尿苷經選自腺苷、脫氧腺苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或脫氧胸苷的N1取代。在各種實施方案中，N1選自腺苷、脫氧腺苷或脫氧尿苷。在一些實施方案中，處于反義鏈的位置1的鳥苷經選自腺苷、脫氧腺苷、尿苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或脫氧胸苷的N1取代。在各種實施方案中，N1選自腺苷、脫氧腺苷、尿苷或脫氧尿苷。在一些實施方案中，處于反義鏈的位置1的胞苷經選自腺苷、脫氧腺苷、尿苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或脫氧胸苷的N1取代。在各種實施方案中，N1選自腺苷、脫氧腺苷、尿苷或脫氧尿苷。在一些實施方案中，處于反義鏈的位置1的腺苷經選自脫氧腺苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或脫氧胸苷的N1取代。在各種實施方案中，N1選自脫氧腺苷或脫氧尿苷。在一些實施方案中，N1與N2形成介于尿苷或脫氧尿苷與腺苷或脫氧腺苷之間的堿基對。在其它實施方案中，N1與N2形成介于脫氧尿苷與腺苷之間的堿基對。在一些實施方案中，雙鏈核酸分子為siRNA、siNA或miRNA。
下表提供附及對應N2的實例。
權利要求
1.一種雙鏈核酸分子，其具有下述所列結構(A) (A) 5，N1-(N)x-Z3，(反義鏈)3，Z，-N2-(N' )y-z”5，(有義鏈) 其中N2、N及N’各自為未經修飾或經修飾的核糖核苷酸或非常規部分； 其中(N)x及(N’)y各自為寡核苷酸，其中每個連續N或N’通過共價鍵與所述相鄰N 或N’連接；其中χ及y各自獨立地為17至39的整數；其中(N，)y的序列與(N)x的序列互補，且(N)x與靶標RNA中的連續序列互補； 其中N1與(N) χ共價結合，且與所述靶標RNA錯配或為與所述靶標RNA互補的DNA核苷酸；其中N1選自由天然或經修飾的尿苷、脫氧核糖尿苷、核糖胸苷、脫氧核糖胸苷、腺苷或脫氧腺苷組成的組的部分；其中ζ”可存在或不存在，但若存在，則為共價連接于N2-(N’)y的5’端的加帽部分；及其中Z及Ζ’各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立地為共價連接于其所存在的所述鏈的3’端的1-5個連續核苷酸、連續非核苷酸部分或其組合。
2.如權利要求1所述的雙鏈核酸分子，其中(N’)y的所述序列與(N)x的所述序列完全互補。
3.如權利要求1所述的雙鏈核酸分子，其中N2-(N’)y的所述序列與N1-(N)x的所述序列互補。
4.如權利要求1所述的雙鏈核酸分子，其中(N)χ包含與靶標RNA中的約17至約39個連續核苷酸完全互補的反義序列。
5.如權利要求1所述的雙鏈核酸分子，其中(N)χ包含與靶標RNA中的約17至約39個連續核苷酸實質上互補的反義序列。
6.如權利要求1所述的雙鏈核酸分子，其中N1和N2形成沃森-克里克堿基對。
7.如權利要求1所述的雙鏈核酸分子，其中N1與N2形成非沃森-克里克堿基對。
8.如權利要求1至7中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中χ= y = 18，x = y = 19或 χ = y = 20。
9.如權利要求8所述的雙鏈核酸分子，其中χ= y = 18。
10.如權利要求1至9中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中N1與(N)x共價結合且與所述靶標RNA錯配。
11.如權利要求1至9中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中N1與(N)x共價結合且為與所述靶標RNA互補的DNA部分。
12.如權利要求1至9中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中N1選自腺苷、脫氧腺苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或脫氧胸苷，且其中所述靶標RNA中所述配對核苷酸中的核苷酸為腺苷。
13.如權利要求12所述的雙鏈核酸分子，其中N1選自腺苷、脫氧腺苷或脫氧尿苷。
14.如權利要求1至9中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中N1選自腺苷、脫氧腺苷、尿苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或脫氧胸苷，且其中所述靶標RNA中所述配對核苷酸中的核苷酸為胸苷。
15.如權利要求14所述的雙鏈核酸分子，其中N1選自腺苷、脫氧腺苷、尿苷或脫氧尿苷。
16.如權利要求1至9中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中N1選自腺苷、脫氧腺苷、尿苷、脫氧尿苷、核糖胸苷或脫氧胸苷，且其中所述靶標RNA中所述配對核苷酸中的核苷酸為鳥苷。
17.如權利要求16所述的雙鏈核酸分子，其中N1選自腺苷、脫氧腺苷、尿苷或脫氧尿苷。
18.如權利要求1至9中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中N1選自脫氧腺苷、脫氧尿苷、 核糖胸苷或脫氧胸苷，且其中所述靶標RNA中所述配對核苷酸中的核苷酸為尿苷。
19.如權利要求18所述的雙鏈核酸分子，其中N1選自脫氧腺苷或脫氧尿苷。
20.如權利要求1至9中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中N1與N2形成尿苷或脫氧尿苷與腺苷或脫氧腺苷之間的堿基對。
21.如權利要求1至9中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中N1與N2形成介于脫氧尿苷與腺苷之間的堿基對。
22.如權利要求1至21中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中ζ”存在。
23.如權利要求1至22中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中Z及Z’不存在。
24.如權利要求1至22中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中Z或Z’中的ー個存在。
25.如權利要求1至22中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中Z或Z’包含非核苷酸部分。
26.如權利要求1至25中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中N或N’中的至少ー個包含經2' OMe糖修飾的核糖核苷酸。
27.如權利要求沈所述的雙鏈核酸分子，其中N包含単一交替的未經修飾的核糖核苷酸與2’ OMe糖修飾的核糖核苷酸。
28.如權利要求1至27中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中N2包含2’OMe糖修飾的核糖核苷酸。
29.如權利要求1至觀中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中所述雙鏈核酸分子為 siRNA、siNA 或 miRNA。
30.如權利要求1所述的雙鏈核酸分子，其中χ= y = 18，Z’不存在，Z存在且包含兩個彼此經由磷酸ニ酯鍵共價連接的烷基部分，N2包含腺苷且N1包含尿苷。
31.如權利要求1所述的雙鏈核酸分子，其中χ= y = 18，Z’不存在，Z存在且包含兩個彼此經由磷酸ニ酯鍵共價連接的烷基部分，N2包含尿苷或脫氧尿苷且N1包含腺苷。
32.如權利要求1至31中任一項所述的雙鏈核酸分子，其中所述靶標mRNA為哺乳動物基因的mRNA。
33.如權利要求32所述的雙鏈核酸分子，其中所述靶標mRNA為人基因的mRNA。
34.如權利要求1至33中任一項所述的雙鏈核酸分子，其用于治療。
35.一種藥物組合物，其包含至少ー種如權利要求1至34中任一項所述的雙鏈核酸分子；及藥學上可接受的載體。
36.一種用于治療或預防有需要的受試者中疾病或病況的發生或嚴重度的方法，其包括以有效地預防或治療或延遲疾病或病況的發生或嚴重度的量向所述受試者施用權利要求1至33中任一項所述的雙鏈核酸分子或權利要求35所述的藥物組合物，其中所述疾病或病況和/或與其相關的癥狀選自由以下組成的組聽カ喪失；急性腎衰竭(ARF)；腎移植后移植腎功能延遲恢復(DGF)；青光眼；眼缺血性病況，包括非動脈炎性缺血性視神經病變 (NAION)、前部缺血性視神經病變、年齡相關的黃斑變性(AMD)、缺血性視神經病變(ION)及干眼綜合癥；急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)及其它急性肺及呼吸道損傷；慢性阻塞性肺病 (COPD)；原發性移植失敗；缺血再灌注損傷；再灌注損傷；再灌注水腫；同種異體移植物功能障礙；器官移植、尤其肺移植后肺再植入反應和/或原發性移植物功能障礙(PGD)；器官移植，包括肺、肝、心臟、胰臟及腎移植；腎毒性及神經毒性；脊髓損傷；腦損傷；神經退行性疾病或病況；褥瘡；口腔粘膜炎；纖維變性病癥及癌癥。
37.一種產生由有義鏈及反義鏈組成的雙鏈siRNA分子的方法，其包括以下步驟a)選擇靶標RNA中的連續17至25個核苷酸的序列且合成包含與所述靶標mRNA的連續17至25個核苷酸的序列的互補性的反義鏈，其中所述反義鏈的5’端核苷酸經尿苷、經修飾的尿苷、核糖胸苷、脫氧核糖胸苷、腺苷、經修飾的腺苷、脫氧腺苷或經修飾的脫氧腺苷取代，其限制條件為rG:rU鏈寡核苷酸及所述靶標mRNA的3’端核苷酸。b)合成與所述反義鏈互補的具有17至25個核苷酸的有義鏈，其中所述有義鏈的3’端核苷酸與所述反義鏈的5’端核苷酸形成沃森-克里克堿基對；及c)使所述有義鏈與反義鏈退火；從而產生雙鏈RNA分子。
38.一種產生由有義鏈及反義鏈組成且在與未經修飾的siRNA雙鏈體比較時展現增強的RNAi活性的經修飾的siRNA雙鏈體的方法，其包括以下步驟a)選擇靶標RNA中的連續17至25個核苷酸的序列且合成包含與所述靶標mRNA的連續17至25個核苷酸的序列的互補性的反義鏈，其中所述3’端核苷酸經腺苷、經修飾的腺苷、脫氧腺苷或經修飾的脫氧腺苷取代；b)合成與所述反義鏈互補的具有17至25個核苷酸的有義鏈，其中所述反義鏈的5’端核苷酸包含核糖尿苷、經修飾的核糖尿苷、脫氧核糖尿苷或經修飾的脫氧核糖尿苷且與所述過客鏈的3’端核苷酸形成堿基對；c)使有義鏈與反義鏈退火；從而產生具有增強的RNAi活性的siRNA雙鏈體。
39.如權利要求37或38所述的方法，其中所述3’端核苷酸不為腺苷。
全文摘要
本發明涉及下調靶標基因表達的經修飾的siRNA化合物、包含該化合物的藥物組合物以及治療和/或預防與所述基因相關的各種疾病或病況和/或與該疾病或病況相關的癥狀的發生或嚴重度的方法。
文檔編號C12N15/113GK102597239SQ201080049901
公開日2012年7月18日 申請日期2010年11月25日 優先權日2009年11月26日
發明者莎倫·阿夫金-納祖姆 申請人:夸克醫藥公司