用于同步糖化和發酵以生產乙醇的方法

專利名稱：用于同步糖化和發酵以生產乙醇的方法
用于同步糖化和發酵以生產乙醇的方法本申請要求于2009年12月23日提交的美國臨時專利申請61/289749的優先權。發明領域本發明涉及用于由纖維素生物質生產乙醇的方法。具體地講，在用于生產高濃度乙醇的特定同步糖化和發酵方法條件下來使用發酵單胞菌屬(Zymomonas)。
背景技術：
由可再生資源生產燃料乙醇是針對全球的化石燃料短缺、能源成本增加、以及與大氣二氧化碳含量提高相關的全球變暖效應的一種長期解決方案。來自可再生資源的燃料乙醇通過糖發酵來生產。目前在美國來源于玉米粒的葡萄糖是用于乙醇生產的最豐富的糖來源。由于對作為飼料和食品供應的玉米粒的需求，正在研發將多種類型的纖維素生物質(包括半纖維素)轉化成可發酵糖的方法。來源于這種生物質來源的糖是己糖和戊糖的混 合物，主要是葡萄糖和木糖。作為開發纖維素生物質加工方法的結果，可釋放高濃度的這些糖并將其用于高濃度發酵以產生乙醇，同時減少水消耗并具有較高的生產能力。同樣地，將生物質轉化成乙醇通過向化石燃料提供潛在地經濟上可行的替代方案，提出了對于改善環境影響的極大可能性。將纖維素生物質轉化成乙醇的典型方法包括三個步驟；化學和/或物理處理生物質以降低生物質的木質素含量并制備酶水解可利用的多糖；糖化或消化或水解，其中將多糖酶促轉化成可發酵糖；以及發酵，其中通過用于產生乙醇的產乙醇生物(ethanologen)消耗可發酵糖。在一些情況下，取決于條件和產乙醇生物的性質，組合糖化和發酵步驟可能是能量上最高效的。需要優化這些步驟中的每一步以生產高濃度乙醇。產乙醇生物通常為酵母(例如糖酵母屬(Saccharomyce))或細菌(例如發酵單胞菌屬)。發酵單胞菌屬適用于乙醇生產，因為它一般生命力強，在相對高的葡萄糖濃度下生長良好，并且能夠經工程化以利用C5糖例如木糖和阿拉伯糖(常見的糖化產物)產生乙醇。然而，發酵單胞菌屬的有效利用需要改善使用發酵單胞菌屬作為產乙醇生物的方法。發酵單胞菌屬作為產乙醇生物的用途是已知的(Saddler等人，Can.J. Microbiol. (1982)，28 (12)，1311-19 :Golias 等人，J. Biotechnol.，(2002 年 6 月 26 日)
(96)2，第 155168 頁；Ma 等人，Renewable Energy (2009) 34 :1466-1470)，然而發酵單胞菌屬對由多種生物質預處理方法產生的高濃度乙酸敏感。可通過例如洗滌經預處理的生物質的方法降低乙酸水平(Teixeira 等人，Appl. Biochem. Biotechnol. , (Spring, 2000)第 84-86卷，第 111-127頁)。在同步糖化和發酵中利用木糖的發酵單胞菌屬的用途也是已知的，其中所述生物質用氫氧化鈉處理，隨后用過乙酸處理并洗漆(Teixeira等人，同上)。Eklund等人(Enzymeand Microbial Technology (1995), 17 (3), 255-9)展不了使用發酵單胞菌屬作為產乙醇生物的同步糖化和發酵，其中所述生物質用蒸汽和二氧化硫進行預處理并洗滌，然后發酵在燒瓶和發酵罐中以約10%的總不溶性固體濃度進行，同時進行一定地攪拌，其中所述乙醇產量為約28g/L。
此外，McMillan等人(Appl. Biochem. Biotechnol. (1999) Vol. 77-79 :649-665)展示了發酵單胞菌屬在同步糖化和發酵方法中的用途，其中所述發酵單胞菌屬菌株經改造以適用于楊樹水解產物，所述生物質用稀酸預處理，然后用MTBE萃取，糖化酶為纖維素酶，并且其中發酵在發酵罐中以11. 5%的不溶性固體濃度和150RPM的攪拌速度進行。使用這種方法，作者能夠獲得約35g/L的乙醇產量。上述方法說明發酵單胞菌屬可用于用來生產乙醇的同步糖化和發酵方法中。然而，使用這些方法的乙醇產量低并且清楚的是所述方法需要進行優化以影響商業數量的乙
醇產量。發明概沭通過確定允許在糖化和發酵混合物中使用的高輸入不溶性固體含量并維持 原核產乙醇生物生產以便獲得高乙醇產量,本發明的方法尋求解決優化原核產乙醇生物在同步糖化和發酵(SSF)方法中的使用的問題。使用本發明方法的乙醇產量可超過60g/L。因此本發明提供了用于生產乙醇的方法，包括a)提供包含不溶性固體和多糖的經預處理的生物質；b)提供至少一種用于將多糖轉化成可發酵糖的糖化酶；c)提供原核產乙醇生物；d)在包括攪拌裝置的生物反應器中制備糖化-發酵混合物，其包含a)的經預處理的生物質、b)的糖化酶、和c)的原核產乙醇生物；以及e)在所述糖化-發酵混合物中使所述原核產乙醇生物生長，其中在所述糖化-發酵混合物中的總輸入不溶性固體的濃度基于每升干重計為至少約16%，并且其中所述原核產乙醇生物產生乙醇。在本發明的一個方面，本發明的所述攪拌裝置提供不超過約O. 2瓦特/kg總糖化-發酵混合物的功率。在另一方面，本發明提供了用于生產乙醇的方法，包括a)提供粒度等于或小于約100 μ m或粒度等于或大于約600 μ m的經預處理的生物質，所述經預處理的生物質包含不溶性固體和多糖；b)提供至少一種用于將多糖轉化成可發酵糖的糖化酶；c)提供原核產乙醇生物；d)在包括攪拌裝置的生物反應器中制備糖化-發酵混合物，其包含a)的經預處理的生物質、b)的糖化酶、和c)的原核產乙醇生物；以及e)在所述糖化-發酵混合物中使所述原核產乙醇生物生長，其中I)在所述糖化-發酵混合物中的總輸入不溶性固體的濃度基于每升干重計為至少約16% ;并且2)其中所述原核產乙醇生物產生乙醇。在另一方面，本發明提供糖化-發酵體系，包括a)包含不溶性固體和多糖的經預處理的生物質；b)至少一種用于將多糖轉化成可發酵糖的糖化酶；和c)原核產乙醇生物；其中(a)的生物質、(b)的酶、和(C)的產乙醇生物在糖化-發酵混合物中混合，所述混合物具有基于每升干重計至少約16重量％的總輸入不溶性固體濃度。
附圖
簡沭、牛物保藏和序列描沭申請人:已經按照國際承認的用于專利程序目的的微生物保藏的布達佩斯條約的有關條款進行了以下生物保藏保藏菌株信息·
國際
保藏人鑒定保藏所
參考文獻_命名__保藏日期_
發酵單胞菌屬ZW658 ATCC No PTA-7858 2006年9月12日圖I為顯示了固體載量和攪拌RPM對SSF的效應的圖，所述SSF使用重組發酵單胞菌屬和稀氨預處理過的玉米芯，其具有15mg的H3A蛋白/g葡聚糖+木聚糖。圖2為顯示了在SSF條件下RPM和固體載量對重組運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)活力的效應的圖,所述SSF使用稀氨預處理過的玉米芯,其具有15mg的H3A蛋白/g葡聚糖+木糖。圖3A和B為顯示了不同粒度對使用重組運動發酵單胞菌進行的發酵的效應的圖，所述發酵在25%的固體載量中使用具有不同粒度的Ballotini玻璃小珠。A和B是使用不同粒度范圍的不同實驗。圖4為顯示了來自IL SSF級別的乙醇、木糖和葡萄糖濃度的圖，其具有兩個Rushton 6葉片葉輪(直徑45mm)，轉速為100RPM。圖5為顯示了來自IL SSF級別的乙醇、木糖和葡萄糖濃度的圖，其具有兩個船用式6葉片葉輪(直徑45mm)，轉速為150RPM。圖6為顯示了在SSF運行中的乙醇產量的圖，該運行具有初始的25重量％的生物質加入量并在250或750RPM下攪拌(A);或者分開加入生物質并在80或250RPM下攪拌⑶。圖7A為顯示了 SSF運行中的攪拌速率(Njs)的圖，該運行具有22. 5%的固體，使用菌株AR3 7-31和兩個不同的載入酶。圖7B是在相同SSF運行中的乙醇產量圖。圖8為顯示了在使用玉米秸桿水解產物和兩個不同載入酶的SSF運行中的乙醇產量的圖。圖9為顯示了在SSF運行樣品中的葡萄糖、木糖和乙醇濃度的圖，該運行樣品使用酵母、大腸桿菌、或運動發酵單胞菌作為生物催化劑。下列序列符合37C. F. R. I. 821-1. 825 (“對含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求一序列規則”)，并且與世界知識產權組織(WIPO)標準ST. 25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(規則5. 2和49. 5 (a-bis)，并且行政指導的208節和附錄C相一致)。用于核苷酸和氨基酸序列數據的符號和格式遵循在37C.F.R. § I. 822中列出的規定。SEQ ID NO : I是Fv43D的氨基酸序列，其包括對應于位點I至20的預測信號序列。SEQ ID NO 2是未成熟的Fv3A的序列，其包括對應于位點I至23的預測信號序列。SEQ ID NO 3是未成熟的Fv51A的序列，其包括對應于位點I至19的預測信號序列。SEQ ID NO :4是未成熟的Xyn3的序列，其包括對應于位點I至16的預測信號序列。SEQ ID NO 5是里氏木霉(T. reesei) β -葡糖苷酶BglI的氨基酸序列。發明詳沭本發明涉及原核產乙醇生物例如發酵單胞菌屬在用于由纖維素生物質生產乙醇的同步糖化和發酵(SSF)方法或混合糖化和發酵(HSF)方法中的通途。由可再生資源生產用作燃料添加劑的乙醇將解決化石燃料短缺問題、降低能耗并影響全球變暖。SSF或HSF方法在乙醇生產中是優選的，因為它們提高從原料纖維素生物質到乙醇的轉化過程中的總體
效率。 以下定義和縮寫用于權利要求和說明書的解釋。除非另外指明，本文引用的所有美國專利公開和美國專利公開申請全文以引用方式并入本文。此外，當數量、濃度或其它數值或參數以范圍、優選范圍或優選上限數值和優選下限數值的列表形式給出時，它應理解為具體地公開由任何范圍上限或優選數值和任何范圍下限或優選數值的任何一對所構成的所有范圍，而無論所述范圍是否被單獨地公開。當本文描述數值范圍時，除非另外指明，所述范圍旨在包括其端點，以及所述范圍內的所有整數和分數。當定義范圍時，不旨在將本發明的范圍限定于所列舉的具體值。如本文所用，在本發明的元件或組分之前的詞語“一個”、“一種”旨在表明元件或組分的實例(即出現的事物)數量為非限制性的。因此，應將“一個”和“一種”理解為包括一個(種)或至少一個(種)，并且元件或組分的詞語單數形式也包括復數指代，除非有數字明顯表示單數。如本文所用，術語“包含”是指如權利要求中提及的所述特征、整數、步驟或成分的存在，但它不預先排除一種或更多種其它特征、整數、步驟、成分或其組的存在或添加。術語“包含”旨在包括由術語“基本上由…組成”和“由…組成”涵蓋的實施方案。類似地，術語“基本上由…組成”旨在包括由術語“由…組成”涵蓋的實施方案。如本文所用，術語“約”指本發明的成分或反應物的數量變化，或用于指數值數量的變化，它們可能發生在，例如典型的測量和用于制備濃縮液或實際使用溶液的液體處理程序中；這些程序中的偶然誤差中；制造、來源、或用于制備組合物或實施方法的成分的純度的差異中；等。術語“約”還包括由于相對于由特定起始混合物所得組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術語“約”來修飾，權利要求包括量的等同量。如本文所用，術語“發明”或“本發明”是非限制性術語，并且不旨在指本發明的任何單獨實施方案，而是涵蓋如本說明書和權利要求所述的所有可能的實施方案。術語“產乙醇生物”指通過代謝碳水化合物原料而生產乙醇的生物。術語“同步糖化和發酵(SSF) ”指生物質被糖化并且同時糖化產生的可發酵糖通過生物催化劑被用于產生某種產物的方法，其通常在相同反應容器中進行。術語“混合糖化和發酵(HSF) ”指生物質被糖化至有限程度(不完全或部分糖化)，隨后繼續糖化和發酵同時進行的方法。術語“可發酵糖”指在發酵過程中能被微生物用作碳源的低聚糖和單糖。術語“部分糖化”指生物質的有限糖化，其中釋放的可發酵糖少于如果糖化完全的話將釋放的總可發酵糖。術語“纖維質”指包含纖維素和包括半纖維素和木質素在內的附加組分的組合物。術語“糖化”指由多糖產生可發酵糖。術語“預處理的生物質”是指在糖化之前已經經過預處理的生物質。“生物質”指任何纖維質的或木質纖維質的材料并包括包含纖維素的，并且任選地還包含半纖維素、木質素、淀粉、低聚糖和/或單糖的材料。生物質也可包含附加組分例如蛋白質和/或脂質。生物質可來源于單一來源，或者生物質可包括來源于一種以上來源的混合物；例如，生物質可包括玉米芯和玉米秸桿的混合物，或草和葉片的混合物。生物質包括但不限于生物能作物、農業殘余物、市政固體垃圾、工業固體垃圾、來自造紙業的淤渣、庭院垃圾、木材和林業垃圾。生物質的實例包括但不限于玉米芯、作物殘余例如玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、小麥秸桿、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱，得自谷物、樹、枝、根、葉、木屑、鋸末、灌木及灌叢、蔬菜、水果、花和動物糞肥的研磨物的組分。“生物質水解產物”指來源于生物質糖化的產物。也可在糖化前經預處理的生物質。術語“糖化酶”指能夠催化生物質組分轉化成可發酵糖的酶。如果生物質為預處理的，所述酶通常更有效。術語“不溶性固體”指不溶于溶液的固體。術語“總輸入不溶性固體”指在糖化-發酵混合物中包括的生物質不溶性固體的總干重。當將生物質以多個部分加入時，每部分不溶性固體的干重相加得到總輸入不溶性固體。在糖化-發酵混合物中的不溶性固體的濃度用基于每升干重計的％表示，是指每升總糖化-發酵混合物的干重克數，因此例如基于每升干重計16%指每升總糖化-發酵混合物干重為160克。術語“攪拌裝置”指可通過其施用功率于混合物以混合該混合物組分的機構。通常有一個旋轉運動的機構通過攪拌裝置進行混合。除非另外特別說明，當本文提供數值范圍時，應理解它涵蓋范圍的端點。應理解，數值具有由有效數字位數提供的精度。例如，應將數值I理解為涵蓋O. 5至I. 4的范圍,而應將數值I. O理解為涵蓋O. 95至I. 04的范圍，包括所述范圍的端值。本發明涉及在SSF方法中使用發酵單胞菌屬菌株來生產乙醇的方法。所述方法如下進行在至少一種糖化酶的存在下，在低速攪拌能量條件下預處理纖維素生物質并在糖化-發酵混合物中包括高濃度不溶性固體，所述糖化-發酵混合物包含發酵單胞菌屬產乙醇生物。所得方法可產生超過60g/L的乙醇。預處理過的牛物質本發明方法的生物質可通過任何方法來預處理，所述方法使生物質在糖化期間有效釋放可發酵糖。預處理是本領域熟知的并且包括例如用酸性或堿性化學制品處理和/或機械處理以減小尺寸。預處理的生物質包含不溶性固體、多糖(其通常是不溶性固體的一部分)和其它組分，所述其它組分包括一些抑制發酵單胞菌屬生長和乙醇生產的組分。期望在本發明方法中使用的經預處理的生物質具有足夠低的發酵抑制劑含量以使在包含經預處理的生物質的糖化-發酵混合物中原核產乙醇生物如發酵單胞菌屬的生長和生產最大化。
例如，乙酸是經預處理的生物質的組分，它抑制發酵單胞菌屬。可通過洗滌經預處理的生物質來降低經預處理的生物質中的乙酸含量以除去乙酸和其它抑制劑。作為另外一種選擇，特定的預處理可導致乙酸含量與發酵單胞菌屬生長和生產相容。在預處理中使用氨可導致經預處理的生物質中的抑制劑例如乙酸的含量降低。申請人已經發現氨處理的生物質可具有大于約I的乙酰胺/乙酸根的摩爾比以及大于60%，例如大于約65%，或大于約70%的乙酰基轉化率。因此由于抑制劑濃度降低，過濾和洗滌步驟不是獲得改善的糖收率所必需的，并且因為與這些步驟相關聯的成本可對所述方法的經濟性產生不利影響，優選地不進行生物質的過濾和洗滌。因此在本發明方法中優選使用氨預處理的生物質。按照在共有的美國專利公開7，781，191中公開的預處理方法，優選地使用相對于生物質干重小于約12重量％的氨濃度。此外，不同的發酵單胞菌屬或其它產乙醇生物菌株可具有對經預處理的生物質中 存在的乙酸和/或其它抑制劑的不同耐受性水平。發酵單胞菌屬菌株可對例如4_5g/L的乙酸水平敏感。此外，可制備具有改善的乙酸耐受性的發酵單胞菌屬菌株，例如通過在共有的和共同未決的美國專利申請公布US 2009-0203099A1中公開的基因工程制備上述菌株。此外，可通過適應包含乙酸的培養基獲得改善的乙酸耐受性，這公開于共有的和共同未決的美國專利申請12/641642中，該專利申請以WO 2010/075241公布，其以引用方式并入本文。使用該公開適應方法制備的發酵單胞菌屬菌株對至少約9-10g/L的乙酸具有合適的耐受性。為了最大化發酵單胞菌屬的生長和乙醇產量，在包含糖化-發酵混合物的經預處理的生物質中的乙酸水平與用于乙醇生產的發酵單胞菌屬菌株的乙酸耐受性水平之間存在相容性，其基于發酵單胞菌屬菌株的耐受性水平，其中耐受性指菌株在具有特定乙酸水平的培養基中生長并制備乙醇的能力與在具有更少乙酸或無乙酸的培養基中生長并制備乙醇的能力相似。同步糖化和發酵本發明方法涉及同步糖化和發酵(SSF)。制備糖化-發酵混合物，其包括預處理的生物質、原核產乙醇生物和至少一種酶，所述酶將經預處理的生物質的多糖轉化成可發酵糖。附加的培養基組分例如糖、鹽、生長增強劑、和/或對應于產乙醇生物細胞中的抗生素抗性基因的抗生素通常不是必需的，但是可包括它們。通過一種或更多種糖化酶將經預處理的生物質的組分糖化、或水解以釋放可發酵糖如葡萄糖和木糖。從預處理的生物質中逐漸釋放糖。通過產乙醇生物代謝釋放的糖以產生乙醇作為產物。糖化糖化酶參見Lynd, L. R.等人(Microbiol. Mol. Biol. Rev.，66 :506-577, 2002)。使用至少一種酶，并且通常使用糖化酶聚生體，其包括一種或更多種糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚鍵，并且存在于廣義“水解酶”(EC 3.)的酶分類EC 3. 2. I. X (EnzymeNomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA,以及增補 I (1993)、增補 2 (1994)中、增補 3(1995、增補 4(1997)和增補 5[分別在 Eur. J. Biochem. ”，223 :1_5，1994 ;“Eur.J. Biochem. ”，232 :1_6，1995 ;“Eur. J. Biochem. ”，237 :1_5，1996 ;“Eur. J. Biochem. ”,250 :1-6，1997 ;和 “Eur. J. Biochem. ”，264 :610-650 1999 中])中。本發明的方法中可用的糖苷酶能根據它們水解的生物質組分進行分類。可用于本發明方法中的糖苷酶包括纖維素水解糖苷酶(例如，纖維素酶、內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶)、半纖維素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、內切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果膠酶、葡糖醛酸糖苷酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、異淀粉酶)。此外，它可用于將其它活性加入到糖化酶聚生體中，例如肽酶(EC 3. 4. X. y)、脂肪酶(EC 3. I. I. x和3. I. 4. X)、木素酶(EC I. 11. I. X)和阿魏酸酯酶(EC3. I. I. 73)以有助于從生物質的其它組分中釋放多糖。本領域熟知的生產多糖水解酶的微生物常常表現出某種活性，例如纖維素降解，該活性由多種酶或一組具有不同底物特異性的酶(或“酶聚生體”)催化。因此，來自微生物的“纖維素酶”可包括一組酶、一種或更多種酶或所有酶，它們都可有助于纖維素降解活性。取決于獲取酶制劑時利用 的純化方案，商業或非商業酶制劑，如纖維素酶，可包括多種酶。糖化酶可以分離形式商購獲得,例如Spezyme CP纖維素酶(Danisco US, Inc.,Rochester, NY)和Multifect 木聚糖酶(Danisco US, Inc.)。此外糖化酶可為未純化的并以細胞提取物或完整細胞制劑的形式提供。可使用已經經工程化以表達多個糖化酶的重組微生物制備所述酶。本領域的技術人員將懂得如何測定在本發明的SSF方法中使用的酶的有效量，以及如何調節條件以在SSF中獲得最佳酶活性。本領域的技術人員也將懂得如何優化此類酶的所需活性，以在選擇條件下獲得給定經預處理的生物質的最佳糖化效果。混合糖化和發酵此外，本發明的方法可進行為混合糖化和發酵(HSF)。在這個方法中糖化在發酵前一段時間發生，其中發生部分而非完全的糖化。在這個方法中在經預處理的生物質和糖化酶混合后一段時間加入產乙醇生物以便在未進行發酵的情況下發生一些糖化。在加入產乙醇生物前的時間段可不同并且通常在一小時至多個小時的范圍內，以便釋放可發酵糖并在加入產乙醇生物時已經呈現期望的濃度。在實施例4中例示了 HSF，其中在加入糖化酶一小時后加入發酵單胞菌屬細胞。原核產乙醇牛物本發明的糖化-發酵混合物最初包括來自原核產乙醇生物菌株的種子細胞種菌。高效生產乙醇的任何原核細胞可被用作產乙醇生物。使用的細胞可天然產生乙醇、經工程化以產生乙醇、或者可為經工程化以具有改善乙醇產量的天然乙醇生產者。原核產乙醇生物的實例包括但不限于梭菌屬(Clostridium) (Stevenson和Weimer (2005)Appliedand Environmental Microbiology 71 :4672-4678)、經工程化以生產乙醇的大腸桿菌菌株(US 5，000，000)、經工程化以生產乙醇的嗜熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillusthermoglucosidasius)菌株(Cripps 等人(2OO9)Metabolic Engineering 11 :398-408) >經工程化以生產乙醇的產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)菌株(Ohta等人(1991)Applied and Environmental Microbiology 57 :2810-2815)、發酵桿菌屬(Zymobacter)(Yanase 等人(2007) Appl. Environ. Mirobiol. 73 :2592-2599)、以及發酵單胞菌屬。優選的原核產乙醇生物是發酵單胞菌屬，它天然發酵葡萄糖以產生乙醇。發酵單胞菌屬菌株已經經工程化以用于木糖利用率(美國專利公開5，514，583,5, 712，133、6，566，107、PCT 專利申請號 WO 95/28476，Feldmann 等人(1992) Appl MicrobiolBiotechnol 38:354-361，Zhang 等人(1995) Science 267 :240-243)，它可用于本發明的方法。已經通過基因工程和/或適應制備出具有改善的與乙醇產量相關的特性的發酵單胞菌屬菌株。優選地是具有多個工程化和/或適應改善的發酵單胞菌屬菌株，其用于本發明方法中以最大化乙醇產量。已經進行了可存在的改善，其包括但不限于1)工程化并適應改善的木糖利用率(美國專利公開7，223，575和共有的美國專利公開7，741，119、US-2009-0246876A1和US-2009-024 6846A1) ；2)減少不利于乙醇生產的副產物的合成(共有的US 7，741，119) ；3)工程化以改善乙酸耐受性(共有的和共同未決的美國專利申請公布US2009-0203099A1，以及公布為 WO 2010/075241 的美國專利申請 12/641642)。如WO 2010/075241中公開的方法制備的具有改善的乙酸耐受性的發酵單胞菌屬菌株優選地用于本發明方法。由于使用這些菌株，在本發明的糖化-發酵混合物中可包括高濃度的經預處理的生物質，同時保留不妨害乙醇生產的乙酸水平，不需要進行大量的洗滌以從經預處理的生物質中除去乙酸。通常期望的發酵單胞菌屬菌株作為種子培養物進行培養。種子培養物可例如在由以下組分組成的培養基中生長5-20g/L的酵母提取物，2-4g/L的磷酸氫二鉀，l-5g/L的硫酸鎂七水合物和100-200g/L的葡萄糖，所述培養物在32°C -33°C,pH 5. 5-5. 8的上述培養基中生長至0D600nm為10。種子培養物用于啟動SSF，其加入體積等同于糖化-發酵混合物體積的約10%。SSF中的不溶件固體為了最大化SSF中的乙醇產量，在糖化-發酵混合物中包括高水平的存在于經預處理的生物質中的不溶性固體量。經預處理的生物質中包括的不溶性固體量與在SSF期間可生成的可發酵糖量相關聯，它繼而關聯可從發酵單胞菌屬細胞中代謝可發酵糖生成的乙醇量。取決于所用的特定預處理以及是否包括任何洗滌步驟，相對于經預處理的生物質制劑中的固體量的不溶性固體量將不同。洗滌將增溶不溶解的固體，在總固體中留下較高的不溶性固體百分比。一些酸預處理可將多達30%的未預處理的生物質固體轉化成可溶固體,從而留下的總固體的70 %為不溶性固體。與之相反，用低氨預處理的固體量和不溶性固體量在經預處理的生物質中可能是相似的。相對于經預處理的生物質樣品中的總固體的不溶性固體量通常可在約70%至約99%的范圍內。例如，在本文實施例中使用的低氨預處理的生物質中，不溶性固體占總固體的90% -91%。在本發明的方法中，糖化-發酵混合物包括的來自經預處理的生物質的總輸入不溶性固體量對原核產乙醇生物的乙醇生產的輸入功率效應是重要的。在本發明的方法中，糖化-發酵混合物中載入的不溶性固體總量為每升總糖化-發酵混合物至少約160克干重或16%。為了輔助混合糖化-發酵混合物，可將經預處理的生物質分成兩個或更多個部分加入。當加入初始部分時，不溶性固體濃度可小于16%。在較低的不溶性固體濃度下調節PH和溫度有促進作用。然后可加入附加的經預處理的生物質使得總輸入不溶性固體重量為至少約16%。可在載入酶和/或發酵單胞菌屬之前或之后加入附加的生物質。可將附加的生物質分成一個或更多個部分加入。載入的總輸入不溶性固體可為至少約16%、17%、18%、19%、20%、21%、24%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、或更高，包括所述列出數值間的任何整數。
隨著SSF運行進行，由于SSF中存在的糖化酶糖化經預處理的生物質，不溶性固體量降低。在給定的SSF運行約120小時后，不溶性固體通常可減少至約一半、或更少的初始量。攪拌裝置的功率在生物反應器中使用攪拌裝置攪拌糖化-發酵混合物以混合組分，所述組分包括經預處理的生物質、糖化酶、發酵單胞菌屬細胞、以及任選的其它培養基組分。申請人已經發現當在包含例如約25%或更多不溶性固體的糖化-發酵混合物的攪拌中提供高能量時，發酵單胞菌屬產乙醇生物的乙醇產量受到負面影響。劇烈振蕩(200RPM)具有25%不溶性固體濃度的混合物導致乙醇產量和發酵單胞菌屬活力降低，而劇烈振蕩具有12%固體的混合物無此類效應。
因此在SSF期間需要混合，然而需要保持發酵單胞菌屬細胞的乙醇生產能力。如本文實施例5所述，申請人已經計算出攪拌器可提供給包含發酵單胞菌屬產乙醇生物和至少約22. 5%不溶性固體的糖化-發酵混合物的功率以維持期望的乙醇產量。在本發明的方法中進行混合，其中通過攪拌裝置提供的功率不超過約O. 2瓦特每千克總糖化-發酵混合物。對于最大化乙醇產量，優選的輸入功率小于約O. 2、0. 15,0. 1、0. 05、0. 01、0. 005、或O. 003瓦特/kg總糖化-發酵混合物。攪拌裝置可為任何旋轉攪拌器，包括任何類型的葉輪如Rushton(6葉片)和任何類型的斜葉槳(船用式、4葉片、3片段)。可使用兩種或更多種葉輪葉片，其中單個葉輪功率的總和小于約O. 2瓦特/kg。功率可隨時間變化，因為糖化-發酵混合物的粘度由于生物質的糖化而降低。此外，發現在粒度范圍介于100 μ m和600 μ m之間的玻璃小珠的存在下，當進行劇烈攪拌時發酵單胞菌屬的乙醇生產性能降低。因此當生物質粒度在這一范圍內時，如上所述減少攪拌以最大化乙醇產量。當生物質粒度小于約100 μ m或大于約600 μ m時,可使用劇烈攪拌。然而，經預處理的生物質初始可為較大粒度，但是粒度減小可在SSF運行期間發生。任何類型的生物質的粒度可對發酵單胞菌屬細胞產生效應，如玻璃小珠所示。SSF的條件在具有攪拌裝置的生物反應器中保留糖化-發酵混合物以生產乙醇。保持有利于發酵單胞菌屬糖化并發酵的條件。通常使用苛性溶液(例如氫氧化銨、氫氧化鉀、或氫氧化鈉)以及或者硫酸或者磷酸將PH保持在約5和約7之間。通常使用NaOH作為堿并使用H2SO4作為酸將pH保持在5. 8。溫度保持在約28°C和約37°C之間。通常溫度保持在約33°C或在33°C和約28°C之間變化。SSF持續至少約40小時，通常120小時或更長時間為一次運行。所述運行可為分批形式的，其中進行極小的改變如pH調節，或者可為分批補料形式的，其中當進行SSF時將組分給料于糖化-發酵混合物。分批和分批補料培養方法在本領域內是常用的且熟知的，并且實例可見于Biotechnology :A Textbook of IndustrialMicrobiology, Crueger, Crueger,和 Brock,第二版(1989) Sinauer Associates, Inc.(Sunderland, MA)或 Deshpande, Mukund V. ,Appl. Biochem. Biotechnol. ,36,227, (1992)。在本發明方法中在分批補料運行中可加入的組分可包括附加的經預處理的生物質和/或附加的糖化酶。乙醇濃度
使用本發明方法可獲得高乙醇產量。在本發明SSF方法中產生的特定乙醇量將取決于以下條件而不同，如使用的具體發酵單胞菌屬菌株、生物質類型、生物質預處理方法、不溶性固體濃度和糖化酶。通常可生產大于約40g/L的乙醇。生產的乙醇可為例如約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、或約85g/L。
實施例本發明將在以下實施例中得到進一步闡述。應該理解，盡管這些實施例說明了本發明的優選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。通過上述論述和這些實施例，本領域的技術人員可確定本發明的必要特征，并且在不脫離本發明的實質和范圍的前提下，可對本發明進行各種變化和修改以使其適應多種用途和條件。使用的縮寫詞的含義如下“min”指分鐘，“h”指小時，“ μ L”指微升，“mL”或“ml”指毫升，“L”指升，“nm”指納米，“mm”指毫米，“cm”指厘米，“ μ m”指微米，“mM”指毫摩爾每升，“M”指摩爾，“mmol ”指毫摩爾，“ μ mole”指微摩爾，“g”指克，“ μ g”指微克，“mg”指毫克，“kg”指千克，“g”指引力常數，“RPM”或“rpm”指每分鐘轉數，“h. p. ”指馬力，”為體積％，“atm”指大氣，“”為重量百分比，“CFU”為菌落形成單位數，“ ”指大約，“hr”指小時，“ P ”指密度，“ μ ”指粘度，“D/’指葉輪直徑，“RPS”指每秒轉數，“EFT”指過去的發酵時間。一般方法適合細菌培養物維持及生長的材料和方法在領域內也是眾所周知的。適用于下面實施例的技術可存在于以下文獻中Manual of Methods for GeneralBacteriology,Phillipp Gerhardt,R. G. E. Murray,Ralph N. Costilow,Eugene ff. Nester,Willis A. Wood, Noel R. Krieg 和 G. Briggs Phillips,編輯，American Society forMicrobiology(Washington, DC. ) 1994,或者 Thomas D. Brock 在 Biotechnology 中的 A Textbook of Industrial Microbiology,第二 版，Sinauer Associates, Inc.(Sunderland, MA) 1989。使用的用于細菌細胞生長和維持的所有試劑和材料均得自 Aldrich Chemicals(Milwaukee, WI)> BD Diagnostic Systems(Sparks, MD) > LifeTechnologies (Rockville,MD)或Sigma Chemical Company (St. Louis,MO),除非另外說明。芯的預處理將玉米芯在酶水解之前進行預處理，所述預處理使用如共有的美國專利公開7，781，191中所述的低氨方法。使用水平Littleford Day 130L反應容器進行預處理以生成稱為SSL21的預處理芯，所述反應容器包含圍繞容器主體用于傳輸蒸汽的夾套。容器載入來自加工種子谷物(尺寸小于Imm)的芯以達到基于濕芯的46￥%的反應器填充度(57. 51bs)。使用大型微粒粉磨機(Model#lSH, Serial#10019),用I. Omm的篩網將所述芯減小到小于Imm的尺寸。在碾磨前按需加入一匙干冰到所述芯中以防止設備升溫。微粒粉磨機的主要驅動裝置是5h. p.馬達，其最大轉速為9，600RPM。它有六個旋轉錘；殼，并且沿相對作用邊排列。所述芯具有0. 420g/cm3的松散濕堆積密度和7. 5重量％的水分。在加入28. 9重量％的氫氧化銨溶液(11. 21bs)和水(20. Ilbs)到靠近容器頂部以提供容器中相對于生物·質干重6重量％的順3和60重量％的固體之前向容器施加真空以達到0. latm。表I列出了用于二次預處理批(稱為SSL22)的芯特性和氫氧化銨與水的量。在兩種情況下，均將反應器攪拌器設為70rpm并且蒸汽通過容器的夾套。當容器達到內部溫度80°C時，將蒸汽導入靠近容器頂部以提高容器內部溫度至145°C。保持這一溫度20分鐘。在保持15分鐘后，停止流經夾套的蒸汽流。在預處理末期，通過排氣冷凝器將反應器壓力降至大氣壓。隨后，在打開容器的底部閥門并回收經預處理的生物質之前，施加真空(大約小于latm) 15分鐘以將溫度降至小于60°C并從預處理芯中除去多余的氨和水。表2列出了 SSL21和SSL22批的預處理芯規程。期望小于O. 3kg順3/1001^干固體的殘余氨以及大于1.0的乙酰胺對乙酸比率。測得SSL21芯預處理批的不溶性固體為總固體的90% -91 %。表I:用于二次預處理批(SSL 22)的芯特性和氫氧化銨與水的暈。
權利要求
1.用于生產乙醇的方法，包括 a)提供包含不溶性固體和多糖的經預處理的生物質； b)提供至少一種用于將多糖轉化成可發酵糖的糖化酶； c)提供原核產乙醇生物； d)在包括攪拌裝置的生物反應器中制備糖化-發酵混合物，其包含a)的經預處理的生物質、b)的糖化酶、和c)的原核產乙醇生物；以及 d)在所述糖化-發酵混合物中使所述原核產乙醇生物生長，其中在所述糖化-發酵混合物中的總輸入不溶性固體的濃度基于每升干重計為至少約16%，并且其中所述原核產乙醇生物產生乙醇。
2.權利要求I的方法，其中所述攪拌裝置提供不超過約O.2瓦特/kg總糖化-發酵混合物的功率。
3.權利要求I的方法，其中所述原核產乙醇生物是選自下組的屬的成員發酵單胞菌屬、發酵桿菌屬、梭菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏菌屬和地芽孢桿菌屬。
4.權利要求I的方法，其中所述攪拌裝置包括至少一個葉輪。
5.權利要求I的方法，其中c)的產乙醇生物在加入b)的糖化酶后已經發生部分糖化的時間加入。
6.權利要求I的方法，其中經預處理的生物質以至少兩份被加入，所述至少兩份聯合提供基于每升干重計至少約16%的總輸入不溶性固體濃度。
7.權利要求I的方法，其中在所述糖化-發酵混合物中的總輸入不溶性固體的濃度基于每升干重計為至少約20%。
8.權利要求I的方法，其中所述原核產乙醇生物耐受所述糖化-發酵混合物中的乙酸濃度。
9.權利要求I的方法，其中生物質選自柳枝稷、廢紙、來自造紙業的淤渣、玉米芯、玉米殼、玉米稻桿、草、小麥、小麥稻桿、干草、大麥稻桿、稻桿、甘鹿洛、高粱、得自谷物、樹、枝、根、葉、木屑、鋸末、灌木及灌叢、蔬菜、水果、花和動物糞肥的加工的組分。
10.權利要求I的方法，其中所述經預處理的生物質通過用氨處理纖維素生物質而制成。
11.權利要求10的方法，其中所述氨相對于生物質的干重為小于約12重量％。
12.權利要求I的方法，其中所述至少一種糖化酶選自纖維素水解糖苷酶和半纖維素水解糖苷酶。
13.權利要求I的方法，其中所述至少一種糖化酶是酶聚生體中的一員。
14.權利要求13的方法，其中所述糖化酶聚生體包含選自以下的酶纖維素酶、內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β -葡糖苷酶、木聚糖酶、內切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β -木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果膠酶、葡糖醛酸糖苷酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、異淀粉酶、肽酶、脂肪酶、木素酶和阿魏酸酯酶。
15.權利要求I的方法，其中所述多糖包括木聚糖和葡聚糖。
16.權利要求I的方法，其中所述可發酵糖包括木糖和葡萄糖。
17.權利要求I的方法，其中所述產生的乙醇的濃度為至少約40g/L。
18.用于生產乙醇的方法，包括 a)提供粒度等于或小于約100μ m或粒度等于或大于約600 μ m的經預處理的生物質，其包含不溶性固體和多糖； b)提供至少一種用于將多糖轉化成可發酵糖的糖化酶； c)提供原核產乙醇生物； d)在包括攪拌裝置的生物反應器中制備糖化-發酵混合物，其包含a)的經預處理的生物質、b)的糖化酶、和c)的原核產乙醇生物；以及 e)在所述糖化-發酵混合物中使所述原核產乙醇生物生長,其中 1)在所述糖化-發酵混合物中的總輸入不溶性固體的濃度基于每升干重計為至少約16% ;并且 2)其中所述原核產乙醇生物產生乙醇。
19.權利要求18的方法，其中所述原核產乙醇生物是選自下組的屬的成員發酵單胞菌屬、發酵桿菌屬、梭菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏菌屬和地芽孢桿菌屬。
20.糖化-發酵體系，包括 a)包含不溶性固體和多糖的經預處理的生物質； b)至少一種用于將多糖轉化成可發酵糖的糖化酶；和 c)原核產乙醇生物； 其中(a)、(b)和(C)的生物質、酶和產乙醇生物在糖化-發酵混合物中混合，所述混合物具有基于每升干重計至少約16%的總輸入不溶性固體濃度。
21.權利要求20的體系，其中(a)、(b)和(C)的生物質、酶和產乙醇生物被包含在生物反應器中，所述生物反應器包括提供不超過O. 2瓦特/kg總糖化-發酵混合物的功率的功能性攪拌裝置。
22.權利要求20的糖化-發酵體系，其中所述原核產乙醇生物選自發酵單胞菌屬、發酵桿囷屬、fe囷屬、埃希氏囷屬、克雷伯氏囷屬和地牙抱桿囷屬。
全文摘要
本發明公開了使用發酵單胞菌屬作為產乙醇生物從生物質中生產高濃度乙醇的方法。在用于生產高濃度乙醇的同步糖化和發酵反應期間，使發酵單胞菌屬在低葉輪攪拌、糖化-發酵混合物中的不溶性固體的高濃度條件下生長。
文檔編號C12P7/06GK102933714SQ201080059411
公開日2013年2月13日 申請日期2010年12月22日 優先權日2009年12月23日
發明者W·D·希茨, T·黃, A·K·艾弗森, B·G·勒菲弗爾, C·米欽森 申請人:納幕爾杜邦公司