用于cd34-陰性干細胞的擴增培養基的制作方法

專利名稱：：用于cd34-陰性干細胞的擴增培養基的制作方法用于CD34-陰性干細胞的擴增培養基本申請要求2009年12月23日提交的申請號為61/289，796的美國臨時申請的優先權,其全部內容通過引用并入本文。本申請通篇引用了不同的出版物。這些出版物的公開內容在此通過引用并入本申請，以便更全面地描述本發明涉及的技術現狀。
背景技術：
：來源于骨髓和臍血的人類非造血干細胞越來越多地被用作用于患者的再生和免疫調節指征的間充質細胞。在全球范圍內已經利用間充質干細胞實施了超過80例臨床試驗。幾乎所有的研究人員都使用含胎牛血清(FBS)的培養基作為標準血清補充物。FBS是牛源的，可以傳播TSE(即可傳播性海綿狀腦病)和刺激接受者的免疫應答。只有無BSE的牛被權威機構核準用于人類(新西蘭)，研究人員正努力研發用于促進細胞生長的替代方法。由于細胞療法很可能在未來幾年將被越來越多地使用，隨之而來的將是FBS的短缺。ー些公司已經研發了無血清培養基。但是這些培養基顯示出比理想的生長速率低的生長速率，骨髓源性CD34-陰性干細胞的形態和性質在這些培養基中不能如在含FBS培養基中那樣廣泛表征。人類凝血細胞(即血小板)已經被其他研究人員用作新鮮冰凍血漿(FFP)，用作促生長成分。血小板及其用于再生醫學的潛在意義由Stellos和Gawaz,以及Langer和Gawaz分別評述。關于使用血小板或FFP的干細胞擴增可提及本領域的下列具體教導。Schallmoser等人公開了使用血小板裂解物的間充質干細胞擴増。Capelli等人公開了未過濾的人類血小板裂解物用于擴增和生產間充質基質細胞的用途。Kocaoemer等人公開了人類AB血清和凝血酶激活的富血小板血漿在擴增來自脂肪組織的間充質干細胞中的用途。Muller等人公開了用于分離和擴增來自人類骨髄的多潛能間充質基質細胞的無動物血清培養條件，所述條件使用FFP和血小板兩者。Blande等人公開了脂肪組織間充質干細胞在無動物血清培養基中的擴增，所述無動物血清培養基中補充有已經無菌過濾的人自體血小板裂解物。而且，SalvadS等人公開了血小板裂解物在培養間充質基質細胞中的用途，其中所述裂解物是無菌過濾的。盡管血小板裂解物和FFP用于培養間充質干細胞的已知用途，仍然存在未滿足的需求，即更快速、更低廉和更安全地以穩定方式培養這種細胞，同時保留其以后在需要時進行分化的能力。
發明內容本發明提供了一種細胞生長培養基，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的2%至15%；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的1%至10%；(c)濃度為所述細胞生長培養基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基，其中所述無血清低葡萄糖培養基構成所述細胞生長培養基的總體積的75%至97%，且可以包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，所得經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力。本發明還提供了一種細胞生長培養基補充物，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基補充物的總體積的17%至94%;和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基補充物的總體積的6%至83%；其中在將所述細胞生長培養基補充物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力，所述細胞生長培養基包含(i)3體積％至25體積％的細胞生長培養基補充物；(ii)濃度為OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺。本發明另外提供了ー種無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中根據下列步驟制備所述血小板裂解物(i)冷凍血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再次離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。本發明還另外提供了ー種無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中根據下列步驟制備所述FFP濾出物⑴融化FFP；(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。本發明還提供了ー種用于擴增人類⑶34_干細胞的試劑盒，其在分開的區室中包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中⑴所述裂解物構成(a)和(b)合并的體積的17%至94%;(ii)所述FFP濾出物構成(a)和(b)合并的體積的6%至83%，和(iii)在將所述裂解物和所述濾出物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得經擴增的CD34—干細胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內容物構成所述培養基體積的3%M25%;和(ii)肝素的濃度為OU/ml至IOU/ml0本方明還提供了ー種物質組合物，其包含(a)人類⑶34_干細胞和(b)上述任意實施方式的主題細胞生長培養基。本發明另外提供了一種用于制備無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物的方法，其包括下列步驟(i)冷凍血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。本發明還另外提供了一種用于制備無直徑大于0.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物的方法，其包括下列步驟⑴融化FFP；(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。本發明還提供了一種用于制備細胞生長培養基的方法，其包括組合下列物質的步驟(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的2%至15%；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的1%至10%；(c)其量足夠產生所述細胞生長培養基的OU/ml至10U/ml的濃度的肝素；(d)其量足夠產生O.5mM至IOmM的濃度的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基，其中所述無血清低葡萄糖培養基構成所述細胞生長培養基的總體積的75%至97%，且所述無血清低葡萄糖培養基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，所得經擴增的CD34_〒_胞保持分化的能力。本發明提供了ー種用于擴增人類CD34_干細胞群的方法，其包括在適當的溫度下在主題細胞生長培養基中培養所述干細胞的步驟。本發明還提供了一種人類CD34_干細胞，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人類CD34_干細胞群的擴增獲得，其中所述擴增包括在適當的溫度下在主題細胞生長培養基中培養所述干細胞群。最后，本發明提供了人類CD34_干細胞群，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人類CD34_干細胞群的擴增獲得，其中所述擴增包括在適當的溫度下在主題細胞生長培養基中培養所述干細胞群。ISI在不同組成的培養基中MSC的倍增時間。IS2在不同培養基中MSC的增殖速率。IS3在Bio-I中MSC生長的動力學。圖4MSC特異性表面蛋白質的表達。圖5通過流式細胞儀對MSC種群的分析。左側在IMDM+20%FBS中培育的MSC;右側在Bio-I中培育的MSC。S6Bio-I中MSC生長的誘導分化。S7MSC的倍增時間(天)。紅(柱4-6):用FFP培養的MSC的倍增時間，所述FFP通過至少40μm的過濾器或具有更小孔徑的過濾器過濾。藍(柱1-3):用沒有過濾或者僅通過100μm的過濾器過濾的FFP培養的MSC的倍增時間。S8在12天后達到的倍增量。紅(柱4-6):用FFP培養的MSC達到的倍増，所述FFP通過至少40μm的過濾器或具有更小孔徑的過濾器過濾。藍(柱1-3):用沒有過濾或者僅通過100μm的過濾器過濾的FFP培養的MSC達到的倍増。圖9在培育4天之后進行顯微鏡分析。通過40μm、40μm或O.22μm過濾器來過濾FFP明顯增加了MSC的生長速率。僅通過100μm的過濾器的過濾只是稍微改善了效果。圖10MSC的倍增時間(天)。在含有通過40μm過濾器的FFP的培養基中培育的MSC的倍增時間(紅，柱4-6)，是用未經過濾的FFP培養的MSC的倍增時間(藍，柱1-3)的大約一半。圖11在培育9天之后的顯微鏡分析。在所述分析中使用晚代的MSC，這解釋了衰老MSC典型的長倍增時間和扁平化的形態(圖1-4)。但是在含有經過濾的FFP的培養基中的培養不僅提高了細胞生長速率，而且還改善了細胞的形態(圖5-8)。圖12對不同TK和FFP制備物中MSC生長的對照。TK和FFP都經過不同的過濾步驟。顯微圖片示出培育7天之后的細胞生長。用都經過40μm和O.20μm的過濾器過濾的TK和FFP制備的培養基提供了最高效的MSC生長(樣品2)，即使在所得到的培養基又經過O.20μm的過濾器過濾時也是如此(樣品5)。在所有情況下都充分促進了細胞生長。圖13對在經過不同過濾步驟制備的Bio-I中生長的⑶41+MSC的分析。所述分析使用來自供體AP00029、AP00042和AP00045的MSC。(A)I-對照；2-TKO.8μm/0.2μm+FFP；3-TK+FFP0.8μm/0.2μm;4_Tk0.8μm/0.2μm+FFP0.8μm/0.2μmo(B)ト對照；2-TK8μm+FFP；3-TK+FFP8ym；4-ΤΚ8μm+FFP8μm。(C)I-對照；2-TK8μm/0.8μm/0.2μm+FFP；3-TK+FFP8μm/0.8μm/0.2μm;4_TK8μm/0.2μm+FFP8μm/0.8μm/0.2μm。(D)I-對照；2_TKO.8μm/0.2μm+FFP0.8μm/0.2μm+Bio—10·8μm/0.2μm;3_TK8μm/0.8μm/0.2μm+FFP8μm/0.8μm/0.2μm+Bio-10.8μm/0.2μm。圖14對在Bio-I中生長的MSC的分析，所述Bio-I含有(I)標準FFP和⑵無冷沉淀物的FFP。發明的詳細說明本發明提供了ー種新型生長培養基，所述培養基允許人類CD34_干細胞出人意料地快速擴增。經擴增的干細胞不分化，直至另外誘導才分化。因此，本發明的生長培養基，以及其相關的方法構成了快速地、安全地和廉價地產生臨床上有效數量的CD34_干細胞用于治療疾病的能力的顯著進歩。特別地，本發明提供了一種細胞生長培養基，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板(即凝血細胞)裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的2%至15%；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的1%至10%；(c)濃度為所述細胞生長培養基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基，其中所述無血清低葡萄糖培養基構成所述細胞生長培養基的總體積的75%至97%，且可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且其中得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力。這種細胞生長培養基的優選實施方案包括如下(i)所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的3%至8%，5%至7%，和優選6%；(ii)所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的2%至7%，4%至6%，和優選5%肝素的濃度為所述細胞生長培養基的O.8U/ml至I.2U/ml，和優選lU/ml；(iv)L-谷氨酰胺的濃度為O.5mM至IOmM,和優選2mM;和(V)所述無血清低葡萄糖(lmg/ml)培養基是含L-谷氨酰胺的低葡萄糖DMEM(達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium)),且構成所述細胞生長培養基的總體積的85%至93%，87%至91%，和優選89%。在另外優選的實施方案中，經擴增的⑶34_干細胞具有下列表現型⑶347⑶45_/⑶73+/⑶105+/⑶90+。對于所述表現型，它意味著在測試標志物⑶34和⑶45(例如使用流式細胞儀分析)吋，這種標志物在經擴增的細胞上出現0%±10%(和優選±0.5%)。同樣地，在測試標志物⑶73、⑶105和⑶90時，所述標志物在經擴增的細胞上出現100%±10%(和優選+0.5%)ο如本文所用的，“⑶34_干細胞”應表示在其表面上缺少⑶34的干細胞。⑶34_干細胞可來源于組織，例如骨、臍帶和脂肪細胞。例如在LangeC等人的Acceleratedandsafeexpansionofhumanmesenchymalstromalcellsinanimalserum-freemediumfortransplantationandregenerativemedicine.J.CellPhysiol.2007，Apr.25[印刷目！]電子出版(Epubaheadofprint)]中描述了⑶34-干細胞及其分離方法。[54]在本發明的一種實施方案中，術語新鮮冰凍血漿(FFP)指的是已經冷凍和保存的人類血液的液體部分。在實施方案中術語FFP尤其指采集后6小時內已經離心、分離和在-18°C下冷凍成固體的人類血液的流體部分。[55]適用于哺乳動物細胞生長的無血清的低葡萄糖培養基可以包含例如各種氨基酸、維生素、鹽和其它化合物。在本發明的優選實施方案中，所述無血清低葡萄糖培養基是低葡萄糖的(DMEM)，其還可包含L-谷氨酰胺。下面的表I和2中作為實例提供了兩種幾乎一致的生長培養基配方。表I低葡萄糖達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)DMEM包含(mg/ml)無機鹽:0.0002mgCaCl0.000ImgFe(NO3)X9H200.0004mgKCl0.0000977mgMgSO40.0064mgNaCl0.000125mgNaH2PO4X2H200.0037mgNaHCO3氨基酸:0.000084mgL-精氨酸XHCl0.000048mgL-胱氨酸0.000584mgL-谷氨酰胺0.000030mg甘氨酸0.000042mgL-組氨酸XHClXH2O0.000105mgL-異亮氨酸0.000105mgL-亮氨酸0.000146mgL-賴氨酸XHCl0.00003mgL-甲硫氨酸0.000066mgL-苯丙氨酸0.000042mgL-絲氨酸0.000095mgL-蘇氨酸0.000016mgL-色氨酸0.000072mgL-酪氨酸0.000094mgL-纈氨酸維牛素0.000004mgD-泛酸鈣0.000004mg氯化膽堿0.000004mg葉酸鹽/酷0.0000072mg肌-肌醇0.000004mg煙酰胺0.000004mg吡哆醛XHCl0.0000004mg核黃素0.000004mg硫胺XHCl其他成分0.OOlmgD-葡萄糖0.000015mg苯酚紅0.OOOllmg丙酮酸鈉0.9862567mgH2O水0.9862567mg表2達爾伯克改良伊格爾培養基，DMEM低葡萄糖化合物配方mg/L部分A:無機鹽氯化鈣(無水)200.00硝酸鐵0.10硫酸鎂200.00氯化鉀400.00碳酸氫鈉3700.00氯化鈉6400.00磷酸鈉，H2O125.00部分B:其他成分D-葡萄糖1000.00苯酚紅15.00丙酮酸鈉110.00部分C:氨基酸L-鹽酸精氨酸84.00L-胱氨酸48.00L-谷氨酰胺584.00甘氨酸30.00L-鹽酸組氨酸42.00L-異亮氨酸105.00L-亮氨酸105.00L-賴氨酸HCl146.00L-甲硫氨酸30.00L-苯丙氨酸66.00L-絲氨酸42.00L-蘇氨酸95.00L-色氨酸16.00L-酪氨酸72.00L-纈氨酸94.00部分P:維生素D-泛酸鈣4.00氯化膽堿4.00i-肌醇7.20煙酰胺4.00鹽酸吡哆醛4.00鹽酸硫胺4.00葉酸4.00核黃素0.40[pH7.O滲透摩爾濃度324_333m0sm]人類血小板(即凝血細胞)可以從全血獲得或從單采血液成分法獲得。血小板可以來源于單個供體或相匹配的混合供體。在優選的實施方案中，使用單個供體單采血液成分法。同樣，FFP可以從全血獲得或從單采血液成分法獲得。優選地，使用單采血液成分方法來制備FFP。血小板濃縮物以及FFP濃縮物可以根據常規方法制備，例如在歐洲委員會推薦的“血液成分的制備、使用和質保指南(Guidetothepreparation,useandqualityassuranceofbloodcomponents)”；和“用于血液療法的輸血法則(TransfusionsgesetzandRichtlinienzurHSmotherapie)”(德國)中描述的那些方法。在優選的實施方案中，所用的血小板単位具有下列特征體積為200_300ml;凝血細胞含量為2-4X1011/単位血小板；紅細胞含量<3XIO9/単位血小板；白細胞含量<1X106/単位血小板；且供體對HLA抗體是陰性的(對于避免免疫并發癥重要)。這些是根據制造商許可的特征。也可以使用其他的血小板単位。在主題細胞生長培養基的優選實施方案中，根據下列步驟制備部分(a)的血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。在本發明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(V)。在一種實施方案中，如下制備步驟(i)的人類血小板濃縮物離心血小板并從而使其成丸；分離成丸的血小板與液相；和在FFP中重懸(reconstituting)得到的血小板。以下是用于制備血小板裂解物的這種方法的特定額外優選的實施方案在_20°C至_80°C，優選在_80°C冷凍人類血小板濃縮物；在18°C至37°C，優選在37°C融化經裂解的血小板；在9000Xg至55000Xg,優選在10000Xg下離心融化的經裂解的血小板10至20分鐘，優選20分鐘；在3000Xg至5000Xg，優選在4000Xg下再次離心來自步驟(iii)的上清液10分鐘；和使用孔徑漸減的過濾器，即40μm±5μm、5μm±Iμm和0.22μm的過濾器過濾來自步驟(iv)的上清液三次。重懸的血小板隨后可以經過上述的步驟(i)，冷凍步驟。這種程序可以實現血漿中血型抗原和同族凝集素之間良好的血型相容性。在步驟(ic)中用于重懸血小板的FFP可以根據任一種下面描述的方法來制備。而且，在主題細胞生長培養基的優選實施方案中，根據下列步驟制備部分(b)的FFP濾出物⑴融化人類FFP;(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。在本發明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(iii)。在本發明的另ー種實施方案中，如下制備部分(b)的FFP濾出物(i)融化人類FFP；(ii)冷凍融化的人類FFP;(iii)融化所得的人類FFP;和(iv)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心得到的融化的FFP。優選地，在離心步驟(iv)之前至少再一次冷凍和融化來自步驟(iii)的融化的FFP。在一種實施方案中，還省略了對得自步驟(iv)的液體部分的過濾。以下是用于制備FFP濾出物的這種方法的特定優選的實施方案在18°C至37°C，優選在37°C融化FFP;在9000Xg至55000Xg,優選在10000Xg下離心融化的FFPlO至20分鐘，優選20分鐘；和使用孔徑漸減的過濾器，即40μm±5μm、5μm±lμm和O.22μm的過濾器過濾來自步驟(ii)的液體部分三次。理想地是，主題細胞生長培養基不含動物血清。這減少了在將非人源抗原引入人受試者時可引起的并發癥。優選地，在主題細胞生長培養基中，血小板裂解物和FFP濾出物與血型抗原ABO和Rh相匹配。也就是說，血小板裂解物和FFP濾出物優選來源于具有相同血型抗原的受試者(例如裂解物和濾出物都來源于0+/Rh+受試者)。下面將更詳細地討論這個題目。本發明還提供了一種細胞生長培養基補充物，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基補充物的總體積的17%至94%;和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基補充物的總體積的6%至83%；其中在將所述細胞生長培養基補充物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成如下細胞生長培養基時其包含(i)3體積％至25體積％的細胞生長培養基補充物；(ii)濃度為OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_〒_胞的擴增，且所得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力。該細胞生長培養基補充物實際上被用作“濃縮物”添加到標準生長培養基如DMEM中。因此，所述補充物優選帶來前面討論的優選濃度的血小板裂解物和FFP濾出物(例如血小板裂解物和FFP濾出物分別構成所述補充物的54.5%和45.5%)。在一種實施方案中，主題細胞生長培養基補充物另外包含肝素，其中在將所述細胞生長培養基補充物與含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞如下生長培養基時其包含3體積％至25體積％(優選11體積％)的細胞生長培養基補充物，并且含有OU/ml至10U/ml(優選lU/ml)的肝素，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力。在主題細胞生長培養基補充物中優選地，根據下列步驟制備部分(a)的血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。在本發明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(V)。在主題細胞生長培養基補充物中還優選，根據下列步驟制備部分(b)的FFP濾出物⑴融化人類FFP;(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。在本發明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(iii)。正如主題生長培養基的所有實施方案，這種細胞生長培養基補充物理想地也是不包動物血清。在主題細胞生長培養基中還優選，血小板裂解物和FFP濾出物與血型抗原ABO和Rh相匹配。這又與前面關于主題生長培養基的討論一祥。本發明另外提供了ー種無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中根據下列步驟制備所述血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。在本發明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(V)。本發明還另外提供了ー種無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中根據下列步驟制備所述FFP濾出物⑴融化人類FFP;(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。在本發明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(iii)。本發明還提供了ー種用于擴增人類⑶34_干細胞的試劑盒，其在分開的區室中包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中⑴所述裂解物構成(a)和(b)合并體積的17%至94%(優選54.5%);(ii)所述FFP濾出物構成(a)和(b)合并體積的6%至83%(優選45.5%)，和(iii)在將所述裂解物和所述濾出物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內容物構成所述培養基體積的3%至25%(優選11%);和(ii)肝素的濃度為OU/ml至10U/ml(優選lU/ml)。在主題試劑盒的ー種實施方案中，所述試劑盒在分開的區室中包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，和(c)肝素，其中⑴所述裂解物構成(a)-(c)合并體積的17%至94%(優選54.5%)；(ii)所述FFP濾出物構成(a)-(c)合并體積的6%至83%(優選45.5%)，和(iii)在將所述裂解物、所述濾出物和肝素與含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內容物構成所述培養基體積的3%至25%(優選11%);和(ii)肝素的濃度為OU/ml至IOU/ml(優選lU/ml)。本方明還提供了ー種物質組合物，其包含(a)人類⑶34_干細胞和(b)任ー種實施方式的主題細胞生長培養基。如本發明所預想的，在對受試者施用這種培養基和干細胞的組合物的情況下，優選所述組合物與患者的血型是免疫相容的。在這點上，存在與這種物質組合物的臨床應用有關的幾種優選的實施方案。在第一種優選實施方案中，血小板裂解物是O型(萬能供血血型)，FFP是AB型(萬能供血血型)，將該組合物對具有任意血型(即0、Α、Β或AB)的患者施用。在第二種優選實施方案中，血小板裂解物、FFP濾出物和患者均具有相同的血型。在第三種優選實施方案中，FFP濾出物是AB型，血小板裂解物和患者具有相同的血型并且可以是任意血型(例如FFP濾出物是AB型，血小板裂解物和患者都是O型)。最后，如果患者是O型，所用FFP可以具有任意血型。關于Rh因子，優選但不是必須的，患者血型與FFP濾出物和血小板裂解物類型相匹配。本發明另外提供了一種用于制備無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物的方法，其包括下列步驟(i)冷凍人類血小板濃縮物,從而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(V)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。在本發明的一種實施方案中，省略了過濾步驟(V)。本發明還另外提供了一種用于制備無直徑大于0.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物的方法，其包括下列步驟⑴融化人類FFP;(ii)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。作為選擇，根據下列步驟制備細胞生長培養基的部分(b)的FFP濾出物(i)融化人類FFP;(ii)冷凍融化的人類FFP;(iii)融化來自步驟(ii)的人類FFP;和(iv)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心來自步驟(iii)的融化的FFP。在FFP的制備方法中，在離心步驟(iv)之前可至少再一次冷凍和融化來自步驟(iii)的融化的FFP。該FFP尤其可以在低于或等于-35°C的溫度下冷凍，和另外可以在5°C±3°C的溫度下過夜融化，導致通常引起所培養的MSC凝集的因子的團聚。在本發明的這種方法的另ー種實施方案中，離心步驟可以在4000Xg下進行10分鐘，以便沉淀上述團聚的因子。當使用上述融化和冷凍步驟時，可以省略對得自離心步驟(iv)的液體部分的過濾步驟。在使用經過冷沉淀物去除步驟預處理的FFP制備的培養基中培養的MSC的倍增時間，與經過FFP成分的過濾步驟制備的培養基中培養的MSC的倍增時間相當。本發明還提供了一種用于制備細胞生長培養基的方法，其包括組合下列物質的步驟(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的2%至15%(優選6%)；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的1%至10%(優選5%)；(c)其量足夠產生所述細胞生長培養基的OU/ml至10U/ml(優選lU/ml)的濃度的肝素；(d)其量足夠產生O.5mM至IOmM的濃度的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基，其中所述無血清低葡萄糖培養基構成所述細胞生長培養基的總體積的75%至97%(優選89%)，且所述無血清低葡萄糖培養基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且其中得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力。本發明提供了ー種用于擴增人類CD34—干細胞群的方法，其包括在適當的溫度下在主題細胞生長培養基中培養所述干細胞的步驟。優選地，適當的溫度為36°C至38°C，優選37。。。本發明還提供了一種人類CD34_干細胞，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人類CD34_干細胞群的擴增獲得，其中所述擴增包括在適當的溫度下在主題細胞生長培養基中培養所述干細胞群。最后，本發明提供了人類CD34_干細胞群，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人類CD34_干細胞群的擴增獲得，其中所述擴增包括在適當的溫度下在主題細胞生長培養基中培養所述干細胞群。通過參考以下的試驗細節將更好地理解本發明，但本領域技術人員容易理解，具體的試驗細節只是舉例說明后續權利要求書中更全面地說明的本發明。·試驗細節A.干細胞相關材料的制備和用途新鮮冰凍血漿(藥品)新鮮冰凍血漿是用于輸血或其他分級過程的人類血漿成分，通過全血來制備或者通過由單采血液成分法采集的血漿來制備。FFP包含正常血漿水平的穩定凝血因子、白蛋白和免疫球蛋白。不穩定的凝血因子包括VIIIc因子。經由單采血液成分法采集來達到FFP的純度。HLA和HPA抗體的測試可以對單個供體實施，從而降低同種異體免疫的可能風險。使用ABO相容的血漿(ABRh+作為萬能供血血型或ABO相匹配的)。在培養期間FFP以非常低的濃度用于MSC的擴增。為了進一歩降低病原體傳播的風險，理想的是測試FFP供體的病原體并使供體對こ肝免疫。通過所述措施降低患者的同種異體免疫和病原體傳播的風險。凝血細胞裂解物(來源于血小板藥品)凝血細胞裂解物來源于通過單采血液成分法獲得的血小板，理想的是來自單個供體。所施用的血小板単位無污染的紅細胞，且包含非常少數量的白細胞(<IO5/単位)。血小板裂解物由顯著支持MSC生長和純度的無細胞的裂解物構成。Iml裂解物對應6.5XIO8至2.OXlO9的血小板。通過使用少白細胞的單個供體單采血液成分法產品來降低同種異體免疫的可能風險。盡管血小板單位不包含紅細胞(或只包含非常少量)，但只使用ORh+血小板或相匹配的單位。通過使用單個供體的血小板和測試CMV來降低病原體傳播的可能風險。如果需要的話可以進行對其他病原體例如B19微小病毒、EBV或弓形體病毒的測試。B.Bio-I組合物(即包含血小板裂解物和FFP濾出物的培養基)的研發和測試比較下列條件下MSC的培育(a)MDM+20%FBS作為標準；(b)補充有3%血小板裂解物(=TK)和5%FFP的低葡萄糖DMEM;和(c)補充有6%血小板裂解物(=TK)和5%FFP的低葡萄糖DMHM。MSC增殖諫率在以上三種選定條件下檢驗來自四個供體的MSC的増殖速率。以相同的初始密度培養和傳代MSC，并在每個傳代步驟期間測定増殖速率。根據Td=t*log(2)/log(q2/ql)計算倍增時間，其中Td是倍增時間，ql是初始細胞量，q2是最終細胞量，t是培養持續時間(天)。圖I示出在這三種檢驗條件下MSC—次倍增所需的時間。在含FBS的培養基中培養的MSC的倍增時間(2.86±0.43天)比在DMEM+6%TK和5%FFP中生長的MSC的倍增時間(I.78±0.23天)更長。用較少的血小板裂解物(DMEM+3%TK和5%FFP)培育的MSC的生長速度在兩者之間(2.4±0.32天)。頂011+20%85與01^]+6%1'1(和5%兩者之間的這種差異在統計學上是顯著的，并對所有三種培養基進行比較以評價可再現趨勢。在圖2中示出，相對于含FBS的培養基中的MSC增殖速率歸ー化的在含TK的培養基中MSC的增殖速率。選擇DMEM+6%TK和5%FFP培養基組合物(稱為Bio-Ι)進行進ー步的詳細分析。研究在延長的培育時間段MSC在Bio-I中的擴增。，將骨髓細胞培育在Bio-I(10個供體)中或MDM+20%FBS^f供體)中，得到純的MSC培養物(通過以下示出的測試證實)。細胞生長直至達到75%至85%的飽和度(confluency),在傳代期間計數并以相同的初始密度再次平板接種。以t/Td來計算細胞倍增，其中t是兩次傳代之間培養的持續時間(天)，Td是倍增時間。由于生長速度的大的差異，生長在兩種培養基中的MSC不能同時進行傳代。因此，MSC的生長動力學(圖3)以趨勢線表示，所述趨勢線由代表兩次傳代之間的時間段內達到的細胞倍増量的單個數據點構建。由于接種是以低細胞密度實施的，在培育45天之后因為MSC進入衰老(數據未示出)而沒有分析進ー步的傳代步驟。在不同培養基中MSC特異性表面ホ不志物的表征對在上述條件下生長的MSC的表面標志物表達進行流式細胞儀分析。使用標志物的標準組合，它被描述為MSC表現型的指征和被接受為ISTH準則(Dominici，LeBlanc等人，2006)。已知MSC缺乏造血標志物⑶34和⑶45的表達，而⑶73、⑶90和⑶105是高度表達的。在表3中總結了對5個供體進行比較獲得的數據。表3表面標志物「DIDM+20%FBSBio-1'CD340.62±0.820.20±0.27'CD450.38±0.560.08±0.03'CD7399.06±1.5999.87±0.24'CD9094.17±2.7299.92±0.05'CD10599.28±1.0799.83±0.18'在含Tk和FFP的培養基中培育明顯改善了所得到的培養物的表型特征。觀察到所有被分析的標志物的表達趨勢(見圖4)。細胞活性和細胞形態通過在FACS分析中的7-AAD染色測定培育在Bio-I中的MSC活性。由來自11個供體的MSC分析計算出的平均活性為97.61±I.26%。此外，看起來在Bio-I中生長的MSC表現為在尺寸和顆粒度方面更均勻的細胞種群，與在含FBS的培養基中培育的MSC相比(見圖5)尺寸更小，這被認為是MSC的更富生理機能的狀態。通過顯微鏡分析證實了這種觀察(數據未示出)。在Bio-I中牛長的MSC的功能分析在CFU-F(成纖維細胞克隆形成単位)測試(數據未示出)中證明MSC的克隆發生。可以誘導MSC的分化指向成脂細胞系、成骨細胞系和成軟骨細胞系(lineage)(見圖6)。C.Bio-I組合物的進ー步研發和測試在下面的測試中，進ー步改進兩種Bio-I成分血小板裂解物(TK)和新鮮冰凍血漿(FFP)的制備方法。該改進的目的在干，從培養基中除去所有尺寸大于O.22μπι的顆粒，和獲得不含在包含TK和FFP的培養基中可常見的沉淀物的澄清溶液。如下制備起始成分將血小板濃縮物冷凍(_20°C或-80°C)和融化，在18°C、10000Xg下離心20分鐘和在18°C、4000Xg下離心10分鐘，由此獲得血小板裂解物(TK)。使用得到的上清液。在<-35°C下儲存之后將FFP融化。以下描述的所有試驗中，將該成分添加到濃度為6%TK和5%FFP的低葡萄糖DMEM中，所述DMEM中補充有L-谷氨酰胺和肝素。在第一個測試中，如上所述地制備培養基并使其直接通過O.22μm的過濾器。在經過濾的培養基中以標準方法培育三個供體的MSC。阻止細胞生長，并在培育兩周之后將培養基換成未經過濾的ー種，之后細胞重新開始生長(數據未示出)。在另ー個測試中，起始成分在分別經過離心和過濾步驟之后添加到培養基中。對培養基清晰度進行視覺分析(數據未示出)并監測MSC生長速率。FFP制備的改講保持TK制備方法不變。如下改變FFP的制備I.FFP4000Xg2.FFP4000Xg+100ym3.FFPIOOym4.FFP40μm5.FFP40μm+0.22μm6.FFP40μm+0.45μm制備培養基，并培養MSC12天。培養基樣品4、5和6中生長的細胞在4天后達到85%的飽和度，并再次傳代。在胰蛋白酶消化之后計數MSC并估算其生長速率(圖7-9)。TK制備的改講對在傳統方法制備的TK中和在額外通過O.45μm的過濾器的TK中的MSC生長進行比較。如下面指出的改變FFP的制備。估算在這些培養基中培育的MSC的倍增時間，并進行顯微鏡分析(圖10-12)。測試經由孔較小的過濾器或不同過濾器(8μm、O.8μm和O.2μm)的組合過濾TK的效果。經測試的組合都不顯著改變細胞生長速率(數據未示出)。但是，得到的培養基宏觀上無顆粒并且更透明，特別是使用O.8μm和O.2μm過濾器吋。由于不存在沉積的血小板，與標準培養基相比，在經過過濾的培養基中生長的細胞在胰蛋白酶消化之后的細胞懸浮液中觀察到更少的凝集作用。此外，可以通過對⑶41+細胞使用流式細胞儀來監測過濾的效率。在未經過濾的TK中，殘留的血小板膜具有錨定MSC的能力，由此形成CD41+信號。該信號在使用小孔的過濾步驟中大部分被除去。圖13中示出了上述情況的實例。對TK或FFP或者兩者實施不同的過濾步驟(圖13，A-C)。隨后對得到的培養基進行過濾(圖13，D)。應指出，所有用于研究的培養基變化足夠支持細胞生長(數據未示出)。在所有測試中，以未經過額外過濾步驟制備的標準Bio-I作為對照。通過O.8μm和O.2μm孔對TK進行的過濾，單獨或與FFP過濾步驟組合，導致⑶41+信號的顯著減少(圖13A和C)。此外，這種效果的水平似乎依賴于過濾的效率，因為通過O.8μm和O.2μm孔對TK進行的依次過濾比単獨通過O.2μm孔過濾導致更明顯的⑶41+減少(比較圖13C、2和4)。這通過圖13D示出的結果來支持。通過8μπι孔的過濾沒有引起CD41+信號的顯著減少，僅僅是起到了除去尺寸大的顆粒的作用，并因此使得隨后通過較小孔的過濾更容易。如預期的，FFP的過濾在CD41+信號方面沒有顯示任何差異。講ー步優化改變的FFP制備以下步驟的目的在干，從FFP中除去凝血因子，并防止最后培養基的凝塊和細胞的凝集以及血小板裂解物殘留物的沉淀。為此在<_35°C溫度下冷凍FFP并在5±3°C溫度下過夜融化FFP。將這些步驟再重復一次，隨后在4000Xg離心FFP10分鐘。將上清液(無冷沉淀物的FFP)用于Bio-I制備。圖14示出了對在標準Bio-I和在含有無冷沉淀物的FFP的Bio-I中MSC生長的比較。在這兩種進行研究的培養基改變方案中的細胞實現的倍増時間是相當的，而在無冷沉淀物的FFP中的生長稍微得到改進。該培養基還幾乎無污染的顆粒，從而不需要額外對FFP進行過濾。在FFP中重懸血小板丸粒，隨后制備Bio-I培養基補充物為了實現如上所述的血型抗原和血漿中同族凝集素的最大血型相容性，并排除培養基補充物之間任何最終的不相容性，TK制備中的額外步驟在有些情況下可能是必要的。這在含同族凝集素的自體血漿中采集血小板濃縮物時可能是重要的。必須考慮到關于FFP的同族凝集素和凝血細胞濃縮物的血漿的相容性。為此可以如下采集血小板，即在2000Xg離心10分鐘或在5000Xg離心6分鐘，類似于經洗滌的血小板。收集丸粒和在FFP(標準的、經過濾的或無冷沉淀物的)中重懸并在<-20°C下冷凍。可以如前面對TK所描述的來實施之后的制備步驟。所述補充物可以添加到基礎培養基中(例如DMEM或α-MEM)。根據期望的最終組成可以調節補充物的最終體積和添加到基礎培養基中的量。例如，如果選擇5%的血小板濃縮物和5%的FFP用于最佳細胞生長，可以將其少量離心和重懸在200ml的FFP中之后采集200ml血小板。可以將這樣生產的補充物添加到基礎培養基中得到5%的最終濃度。應注意到下列在本文中指出的關于FFP和TK量的各點。在11的Bio-I中1%的FFP對應8.O至10.Oml凝血活性的人類血漿。關于血小板裂解物，產品中血小板的最終濃度和在Bio-I中血小板的百分數取決于所用的血小板制備方法。(I)來自單釆血液成分法的TK(Apceth):1ml的TK裂解物對應6.5XIO8至4.5XIO9的血小板。相應地，含有I%TK的11的Bio-I包含的裂解物量等于6.5XIO9至4.5XIOici的血小板。用在Bio-I中的血小板裂解物的百分數必須基于本申請中列出的在起始材料中血小板的量和體積％值來計算。(2)來自全血的血小板裂解物在50至60ml懸浮液中存在45至90XIO9的血小板。參考文獻Blande,eta_L,“Adiposetissuemesenchymalstemcellexpansioninanimalserum-freemediumsupplementedwithautologoushumanplateletlysate，，，Transfusion,Vol.49，Dec.2009；2680-2685.Capelli,etal.(2007)“Humanplateletlysateallowsexpansionandclinicalgradeproductionofmesenchymalstromalceilsfromsmallsamplesof·bonemarrowaspiratesormarrowfilterwashouts.nBoneMarrowTransplant.40(8)785-91.Hornetal.(2010).“Impactofindividualplateletlysatesonisolationandgrowthofhumanmesenchymalstromalcells”Cytotherapy，12:888-898.Kocaoemer，etal.,“HumanABserumandthrombin-activatedplatelet-richplasmaaresuitablealternativestofetalcalfserumfortheexpansionofmesenchymalstemcellsfromadiposetissue”，StemCells,Nov.11,2008；1271-1278.LangerandGawaz，“Plateletsinregenerativemedicine，，，BasicResCardiol103:299-307(2008).Muller,etal.(2006).“Animalserum-freecultureconditionsforisolationandexpansionofmultipotentmesenchymalstromalcellsfromhumanBM.”Cytotherapy8(5):437-44.Salvade,etal.，“CharacterizationofPlateletLysateCulturedMesenchymalStromalCellsandTheirPotentialUseinTissue-EngineeredOsteogenicDevicesfortheTreatmentofBoneDefects.，，TissueEngPartCMethods.15，2009:185-196.Schallmoser，etal.(2008)“Rapidlarge-scaleexpansionoffunctionalmesenchymalstemcellsfromunmanipulatedbonemarrowwithoutanimalserum.’’TissueEngPartCMethods.14(3):185-96.StellosandGawaz，“PlateletinteractionwithprogenitorcellsPotentialimplicationsforregenerativemedicine”，ThrombHaemost2007；98922-929.權利要求1.細胞生長培養基，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的2%至15%；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的1%至10%；(c)濃度為所述細胞生長培養基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基，其中所述無血清低葡萄糖培養基構成所述細胞生長培養基的總體積的75%至97%，且所述無血清低葡萄糖培養基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，所得經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力。2.如權利要求I所述的細胞生長培養基，其中根據下列步驟制備部分(a)的血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物，從而使其中的血小板裂解；()融化所得經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(v)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。3.如權利要求2所述的細胞生長培養基，其中如下制備步驟(i)的人類血小板濃縮物離心血小板并由此使其成丸；分離成丸的血小板和液相；并在FFP中重懸得到的血小板。4.如權利要求I3之一所述的細胞生長培養基，其中如下制備部分(b)的FFP濾出液融化人類FFP;以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心所得融化的FFP;和使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μπι的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。5.如權利要求I3之一所述的細胞生長培養基，其中如下制備部分(b)的FFP濾出液⑴融化人類FFP；(ii)冷凍融化的人類FFP;(iii)融化所得的人類FFP;和(iv)以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心所得融化的FFP。6.如權利要求5所述的細胞生長培養基，其中在離心步驟(iv)之前至少再一次冷凍和融化來自步驟(iii)的融化的FFP。7.如權利要求5或6之一所述的細胞生長培養基，其中省略對得自步驟(iv)的液體部分的過濾。8.如權利要求I7之一所述的細胞生長培養基，其中所述細胞生長培養基不含動物血清。9.如權利要求I8之一所述的細胞生長培養基，其中所述血小板裂解物和FFP濾出物與血型抗原ABO和Rh相匹配。10.細胞生長培養基補充物，其包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基補充物的總體積的17%至94%;和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基補充物的總體積的6%至83%;其中在將所述細胞生長培養基補充物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力，所述細胞生長培養基包含(i)3體積％至25體積％的細胞生長培養基補充物；(ii)濃度為OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)濃度為O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺。11.如權利要求10所述的細胞生長培養基補充物，其還包含肝素，其中在將所述細胞生長培養基補充物與含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力，所述細胞生長培養基包含3體積％至25體積％的細胞生長培養基補充物，并且含有OU/ml至10U/ml的肝素。12.如權利要求10和11之一所述的細胞生長培養基補充物，其中根據下列步驟制備部分(a)的血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物，從而使其中的血小板裂解；()融化所得經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(v)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。13.如權利要求1012之一所述的細胞生長培養基補充物，其中根據下列步驟制備部分(b)的FFP濾出物⑴融化人類FFP；()以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μπι的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。14.如權利要求1013之一所述的細胞生長培養基補充物，其中所述細胞生長培養基補充物不含動物血清。15.如權利要求1014之一所述的細胞生長培養基補充物，其中所述血小板裂解物和FFP濾出物與血型抗原ABO和Rh相匹配。16.無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中根據下列步驟制備所述血小板裂解物(i)冷凍人類血小板濃縮物，從而使其中的血小板裂解；()融化所得經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(v)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。17.無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中根據下列步驟制備所述FFP濾出物⑴融化人類FFP；()以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μπι的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。18.用于擴增人類CD34—干細胞的試劑盒，其在分開的區室中包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，和(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中⑴所述裂解物構成(a)和(b)合并體積的17%至94%；(ii)所述FFP濾出物構成(a)和(b)合并體積的6%至83%，和(iii)在將所述裂解物和所述濾出物與肝素和含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得到的經擴增的CD34—干細胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內容物構成所述培養基體積的3%至25%;和(ii)肝素的濃度為OU/ml至IOU/ml019.如權利要求18所述的試劑盒，其在分開的區室中包含(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，和(c)肝素，其中⑴所述裂解物構成(a)-(c)合并體積的17%至94%；(ii)所述FFP濾出物構成(a)-(c)合并體積的6%至83%，和(iii)在將所述裂解物、所述濾出物和肝素與含L-谷氨酰胺的、適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基組合，從而構成細胞生長培養基時，所得到的細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且所得到的經擴增的CD34—干細胞保持分化的能力，其中(i)所述試劑盒的內容物構成所述培養基體積的3%至25%;和(ii)肝素的濃度為OU/ml至IOU/ml020.物質組合物，其包含(a)人類⑶干細胞和(b)如權利要求I9之一所述的細胞生長培養基。21.用于制備無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物的方法，其包括下列步驟(i)冷凍人類血小板濃縮物，從而使其中的血小板裂解；(ii)融化所得經裂解的血小板；(iii)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間離心融化的經裂解的血小板；(iv)以適合使其中的固體物質成丸的速度和持續時間再離心來自步驟(iii)的上清液；和(v)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾來自步驟(iv)的上清液，其中使用具有至少.5μm的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后ー次過濾。22.用于制備無直徑大于0.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物的方法，其包括下列步驟⑴融化人類FFP；()以適合使其液體部分和固體部分分離的速度和持續時間離心融化的FFP;和(iii)使用孔徑漸減的過濾器至少兩次過濾得到的液體部分，其中使用具有至少5μπι的孔的過濾器實施第一次過濾，和使用具有不大于O.22μm的孔的過濾器實施最后一次過濾。23.用于制備細胞生長培養基的方法，其包括組合下列物質的步驟(a)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的2%至15%；(b)無直徑大于O.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的1%至10%；(c)其量足夠產生所述細胞生長培養基的OU/ml至10U/ml的濃度的肝素；(d)其量足夠產生O.5mM至IOmM的濃度的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基，其中所述無血清低葡萄糖培養基構成所述細胞生長培養基的總體積的75%至97%，且所述無血清低葡萄糖培養基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細胞生長培養基允許人類CD34_干細胞的擴增，且其中得到的經擴增的CD34_干細胞保持分化的能力。24.用于擴增人類⑶34—干細胞群的方法，其包括在適當的溫度下在如權利要求I9之一所述的培養基中培養所述干細胞的步驟。25.人類CD34—干細胞，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人類CD34—干細胞群的擴增獲得，其中所述擴增包括在適當的溫度下在如權利要求I9之一所述的培養基中培養所述干細胞群。26.人類CD34—干細胞群，其(i)具有分化的能力，和(ii)由人類CD34—干細胞群的擴增獲得，其中所述擴增包括在適當的溫度下在如權利要求I9之一所述的培養基中培養所述干細胞群。全文摘要本發明提供細胞生長培養基，其包含(a)無直徑大于0.22μm的固體物質的人類血小板裂解物，其中所述裂解物構成所述細胞生長培養基的總體積的2％至15％；(b)無直徑大于0.22μm的固體物質的人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物，其中所述FFP濾出物構成所述細胞生長培養基的總體積的1％至10％；(c)濃度為所述細胞生長培養基的0U/ml至10U/ml的肝素；(d)濃度為0.5mM至10mM的L-谷氨酰胺；和(e)適用于哺乳動物細胞生長的無血清低葡萄糖培養基，其中所述無血清低葡萄糖培養基構成所述細胞生長培養基的總體積的75％至97％，并且可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述細胞生長培養基允許人類CD34”干細胞的擴增，且其中得到的經擴增的CD34”干細胞保持分化的能力。本發明還提供了相關的細胞生長培養基補充物、無菌的人類血小板裂解物和人類新鮮冰凍血漿(FFP)濾出物、試劑盒、含CD34’干細胞的組合物，以及相關的生產和細胞擴增方法。文檔編號C12N5/0775GK102686725SQ201080059394公開日2012年9月19日申請日期2010年12月23日優先權日2009年12月23日發明者克里斯廷·岡瑟,埃琳娜·阿塞瓦申請人:埃普塞斯有限責任兩合公司