專利名稱：一種乙醇脫氫酶基因及編碼的多肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物次生物質代謝技術領域。具體的說，本發明涉及一種涉及產麻黃堿的轉基因重組異常漢遜酵母乙醇脫氫酶基因的克隆及編碼的多肽技術領域。
背景技術：
乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，簡稱ADH)是廣泛分布的含鋅金屬酶，NAD+、 NADP+或PQQ為輔酶。ADH廣泛分布于大自然中，在人和哺乳動物的肝臟、植物組織以及微生物細胞中都有發現。ADH具有廣泛的底物特異性，是許多有機體中的主要短鏈醇代謝的關鍵酶，它的生理作用在于可逆的催化氧化短鏈醇、芳香醇等為相應的羧基化合物。在微生物體內，ADH是主要的短鏈醇代謝的關鍵酶，可逆的催化氧化短鏈醇、芳香醇等為相應的羧基化合物，在不同的微生物中，其生理作用有所不同，微生物來源的ADH 中，酵母和一些嗜溫細菌ADH的報道較多，不同微生物來源的ADH分子量、催化特性等有所不同。乙醇脫氫酶參與酵母維生素A代謝、酪氨酸代謝、脂肪酸代謝和葡萄糖代謝多個代謝過程。隨著生物技術和酶工業的發展，ADH的研究已經成為研究熱點，正被廣泛應用于醫學分析、工業生產和科學研究等方面。此外在產麻黃堿重組酵母CGMCC. No. 1499中利用SSH 技術分離的乙醇脫氫酶作為重組菌中高表達基因，對重組菌生物合成麻黃堿的研究和開發具有重要的意義。
發明內容
鑒于采用SSH技術分離獲得多條重組酵母菌合成麻黃堿時差異表達基因片段，其中高表達的乙醇脫氫酶基因參與酵母麻黃堿生物合成代謝途徑的調控。因此，本發明旨在提供一種在產麻黃堿的轉基因重組異常漢遜酵母中高表達的乙醇脫氫酶基因序列和編碼多肽序列，以應用于麻黃堿次生代謝途徑的研究，為麻黃堿代謝途徑基因在異常漢遜酵母中的整合、表達以及調控研究奠定基礎，也為乙醇脫氫酶基因的相關研究領域提供新的基因資源。本發明的技術方案通過利用產麻黃堿的轉基因重組酵母是新疆大學利用離子束介導野生藍麻黃基因組DNA在異常漢遜酵母中的隨機轉化獲得重組酵母菌，相關方法和重組菌種已獲國家發明專利授權(專利號ZL 200610011402.7)。以出發菌株異常漢遜酵母2. 340和重組酵母CGMCC No. 1499為研究材料，采用抑制差減雜交技術(suppression subtraction hybridization, SSH)獲得重組酵母生物合成麻黃堿時差異表達乙醇脫氫酶基因片段，獲得乙醇脫氫酶基因片段長36;3bp，通過美國國立生物技術信息中心序列相似性搜索程序(NCBIBlast)的核酸序列分析，表明與數據庫中已登記的乙醇脫氫酶同源性最高為77%，由此證明從產麻黃堿重組酵母中分離的乙醇脫氫酶基因是一個新的乙醇脫氫酶基因。具體的，本發明提供了一種乙醇脫氫酶基因具有如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，
3全長為ΙΜ^ρ，其編碼由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中375個氨基酸組成的蛋白質。同時，本發明提供了一種乙醇脫氫酶基因的獲得方法，所述的乙醇脫氫酶基因ADH 是來源于產麻黃堿的轉基因重組酵母CGMCC No. 1499，通過SSH和cDNA3'和5'末端快速擴增(RACE)獲得。具體包括如下步驟1、采用低能氬離子(Ar+)注入介導野生藍麻黃(Ephedra glauca L.)基因組DNA 在異常漢遜酵母(Hansenula anomala)中隨機轉化，轉化后的酵母菌通過目標性狀的篩選， 獲得生物合成麻黃堿重組酵母菌株CGMCC No. 1499。2、將步驟1中所獲得轉基因酵母菌和出發菌株進行培養，并分別提取其總RNA，以轉基因酵母為實驗組，出發菌株為驅動組，進行抑制差減雜交實驗，構建了轉基因酵母與出發菌株之間的差減文庫。PCR鑒定重組子進行測序，獲得一段36;3bp的基因片段。測序結果用BLASTn程序在GenBank數據庫中進行序列相似性搜索，確定該基因片段為乙醇脫氫酶基因。3、將步驟2獲得乙醇脫氫酶基因片段分別設計cDNA 3'和5' RACE的嵌套式引物各一對。提取重組酵母CGMCC No. 1499總RNA，利用已設計的3 ‘和5 ‘ RACE引物，對乙醇脫氫酶的3'和5'末端進行擴增。將3'和5' RACE擴增結果進行回收，連接T-載體， 檢測重組子后進行測序，測序獲得乙醇脫氫酶基因3'和5'端序列信息。將獲的乙醇脫氫酶基因片段用GeneTool軟件進行拼接，得到完整的基因核苷酸序列SEQ ID NO. 1。進一步，本發明提供了一種乙醇脫氫酶，該乙醇脫氫酶蛋白質的基因所編碼具有如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，其來源于產麻黃堿的轉基因重組異常漢遜酵母(Hansenula anomala) CGMCC No. 1499。根據本發明所述的乙醇脫氫酶基因全長為ΙΜ^ρ，該序列編碼375個氨基酸。通過NCBI Blast的核酸序列分析，表明與數據庫中已登記的比對得分最高的4種酵母菌乙醇脫氫酶同源性最高為77%，參見附圖1。由此證明從產麻黃堿重組酵母中分離的乙醇脫氫酶基因是一個新的乙醇脫氫酶基因。編碼產物即本發明乙醇脫氫酶的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID N0. 2 所示。如本領域的技術人員所知，本發明乙醇脫氫酶基因也可以是編碼由SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的衍生物，可以是SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列經過取代、 缺失或添加一個或幾個氨基酸殘基且具有相同的乙醇脫氫酶活性的序列2衍生蛋白質，包括在蛋白質C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸。相應地，本發明乙醇脫氫酶基因也可以是編碼這些本發明乙醇脫氫酶衍生物或類似物的氨基酸序列。通過實施本發明具體的發明內容，可以達到以下效果1.本發明提供了一種在產麻黃堿的轉基因重組異常漢遜酵母中高表達的乙醇脫氫酶基因序列和編碼多肽序列，該乙醇脫氫酶基因具有如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，全長為ΙΜ^ρ，其編碼由序列表中SEQID N0. 2所示的氨基酸序列中375個氨基酸組成的蛋白質。2.本發明提供的一種在產麻黃堿的轉基因重組異常漢遜酵母中高表達的乙醇脫氫酶基因及其乙醇脫氫酶應用于麻黃堿次生代謝途徑的研究，為麻黃堿代謝途徑基因在異常漢遜酵母中的整合、表達以及調控研究奠定基礎，也為乙醇脫氫酶基因的相關研究領域
4提供新的基因資源。
圖1所示為獲得乙醇脫氫酶ADH與其它4種酵母同源比對系統進化樹。圖2所示為利用抑制差減雜交技術獲得的差異基因表達片段電泳結果圖，圖中，M 為DNA分子量標準DL2000，1為乙醇脫氫酶片段。圖3所示為獲得的乙醇脫氫酶基因片段設計RACE實驗引物示意圖。圖4所示為利用抑制差減雜交技術獲得的差異基因表達片段電泳結果圖，圖中，M 為λ-EcoTH I digest DNA Marker，1為從出發菌株內擴增出的乙醇脫氫酶片段，2為從轉基因酵母內擴增出的乙醇脫氫酶片段。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。本發明中涉及到的主要原輔材料和設備有主要試劑Takara公司 daq DNA 聚合酶，RNAiso Reagent, 3' -Full RACECore Set Ver 2.0 和 5' -Full RACE Kit，Clontech 公司 PCR-klectTMcDNASubtraction Kit 和 SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit，Axygen 公司膠回收試劑盒，Promega 公司 pGEM_T 克隆載體，主要儀器IBB Device 1多功能離子注入機，Sigma 3-18K離心機，UV-7M分光光度計，TC-512PCR 儀。本發明中選用的所有試劑和儀器都為本領域熟知選用的，但不限制本發明的實施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。實施例一1、采用低能氬離子(Ar+)注入介導野生藍麻黃(Ephedra glauca L.)基因組DNA 在異常漢遜酵母(Hansenula anomala)中隨機轉化，轉化后的酵母菌通過目標性狀的篩選， 獲得生物合成麻黃堿重組酵母菌株CGMCC No. 1499。2、將步驟1中所獲得轉基因酵母菌和出發菌株進行培養，并分別提取其總RNA，以轉基因酵母為實驗組，出發菌株為驅動組，進行抑制差減雜交實驗，構建了轉基因酵母與出發菌株之間的差減文庫。PCR鑒定重組子進行測序，獲得一段363bp的基因片段。測序結果用BLASTn程序在GenBank數據庫中進行序列相似性搜索，確定該基因片段為乙醇脫氫酶基因。3、將步驟2獲得乙醇脫氫酶基因片段分別設計cDNA 3'和5' RACE的嵌套式引物各一對。提取重組酵母CGMCC No. 1499總RNA，利用已設計的3 ‘和5 ‘ RACE引物，對乙醇脫氫酶的3'和5'末端進行擴增。將3'和5' RACE擴增結果進行回收，連接T-載體， 檢測重組子后進行測序，測序獲得乙醇脫氫酶基因3'和5'端序列信息。將獲的乙醇脫氫酶基因片段用GeneTool軟件進行拼接，得到完整的基因核苷酸序列SEQ ID NO. 1。實施例二1、菌株培養和總RNA的提取將出發菌株和轉基因酵母菌CGMCC No. 1499分別從斜面分別轉接入液體培養基，置搖床230r/min、28°C 30°C培養72h，離心分別收集菌體。采用Takara RNAiso Reagent對酵母總RNA進行提取，按試劑盒說明書進行。用的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并用紫外分光光度計估計其純度及濃度。2、采用抑制差減雜交技術(SSH)獲得重組酵母菌中乙醇脫氫酶基因片段以轉基因酵母為實驗組，出發菌株為驅動組，采用Clontech公司的PCR-%Iect cDNA Subtraction Kit和SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit進行抑制差減雜交實驗。根據紫外分光光度計測定值所計算的RNA濃度，分別將提取的轉基因酵母和出發菌株總RNA用 RNA-free water稀釋成1 μ g/μ L，按試劑盒說明書分別合成轉基因酵母和出發菌株單鏈 cDNA。將轉基因酵母和出發菌株單鏈cDNA分別合成為雙鏈cDNA，平行做3個樣品(實驗組和驅動組，另外多做一個樣品)，在進行到15個循環時，取出實驗組和驅動組PCR樣品存放在4°C，并從另外的樣品中取出15 μ L留作檢測，以后每隔3個循環取樣一次，直到M 個循環結束。對取出的樣品進行的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定最佳循環數。將實驗組和驅動組樣品重新放入PCR儀中，補充循環次數到最佳循環數，實驗所得最佳循環數為18。 循環結束后，加入2μ L 0. 5Μ EDTA終止反應。將獲得的雙鏈cDNA用氯仿-異戊醇04 1)純化2次，4M醋酸銨溶液和300 μ L 95%的乙醇沉淀雙鏈cDNA，80%的乙醇洗滌干燥后用于Rsa I酶切。雙鏈cDNA的Rsa I 37°C水浴酶切1. 后，用的瓊脂糖凝膠電泳進行酶切效率的檢測。檢測后對酶切樣品進行苯酚-氯仿-異戊醇05 24 1)純化，80%的乙醇洗滌沉淀后干燥進行接頭連接 (只對實驗組進行接頭的連接)。分別吸取轉基因酵母雙鏈cDNA Rsa I酶切純化產物各 2 μ L，分別加入不同的接頭"Γ4 DNA LigaSel6°C水浴過夜連接，連接產物加入IyL EDTA/ Glycogen終止反應，并72°C水浴5min失活連接酶。向帶有不同接頭經Rsa I酶切轉基因酵母雙鏈cDNA中加入1. 5 μ L驅動組cDNA (經Rsa I酶切)，PCR儀中68°C 8h進行第一次雜交，將第一次雜交的兩個樣品混合，并立即加入從PCR儀中取出的新變性的驅動組cDNA， 離心混勻，68°C過夜進行第二次雜交，雜交結束后加入400 μ L dilutionbuffer，混勻后，于 PCR儀中68°C加熱7min備用。將經過差減雜交的稀釋cDNA進行第一次PCR反應，反應結束后將第一次PCR產物稀釋10倍，作為第二次PCR的模板進行PCR反應，取8 μ L進行2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶呈現彌散狀。按Axygen回收試劑盒說明書對SSH-PCR產物進行回收，回收產物溶解于10 μ L的無菌水中，再按!Iomega公司的pGEM_T Easy載體說明書將回收產物與T-載體16°C連接過夜，連接產物轉大腸桿菌感受態細胞進行藍白斑篩選。對篩選獲得的白斑用堿法提取其質粒DNA進行重組子的PCR鑒定，反應結束后，取5 μ L進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，參見附圖2。將獲得基因片段測序并將序列信息進行Blast同源比對，分別用BLASTn和BLASTx 程序將測序結果片段的堿基序列在GenBank數據庫中進行序列相似性搜索，并根據比對結果進行功能預測，通過NCBI Blast的核酸序列分析，表明與數據庫中已登記的比對得分最高的4種酵母菌乙醇脫氫酶同源性最高為77%，參見附圖1。由此證明從產麻黃堿重組酵母中分離的乙醇脫氫酶基因是一個新的乙醇脫氫酶基因，初步確定該基因片段為乙醇脫氫酶基因。
實施例三1、乙醇脫氫酶基因RACE實驗引物設計
利用獲得乙醇脫氫酶基因片段分別設計cDNA 3'和5'末端快速擴增(RACE)的嵌套式引物各一對，參見附圖3。2、在重組酵母菌中進行乙醇脫氫酶基因的克隆。將轉基因酵母菌置搖床230r/minJ8°C 30°C培養72h，離心收集菌體。采用 Takara RNAiso Reagent對酵母總RNA進行提取，利用已設計的3 ‘和5 ‘ RACE引物，采用 Takara公司的 3' -Full RACE Core Set Ver 2.0 和 5' -Full RACE Kit 試劑盒對乙醇脫氫酶的3'和5'末端進行擴增。3、乙醇脫氫酶基因3' RACE實驗將轉基因酵母總RNA進行反轉錄，反轉錄結束后，對反轉錄產物進行OuterPCR反應，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測無特異性條帶，將Outer PCR反應液稀釋50倍進行Inner PCR反應，反應結束后3'端第二輪PCR擴增結果進行電泳分析，得到400bp左右大小條帶， 將3' RACE擴增結果進行膠回收，回收產物分別與pGEM-T fesy載體連接，連接產物轉大腸桿菌XLlO-Gold感受態細胞，進行藍白斑篩選，PCR鑒定重組子，測序獲得乙醇脫氫酶基因 3'端序列信息。4、乙醇脫氫酶基因5' RACE實驗使用Alkaline Phosphatase (CIAP)對iTotal RNA中裸露的5'磷酸基團進行去磷酸化反應。去磷酸反應后加入3M CH3COONa (pH5. 2)和RNase Free dH20充分混勻，用酚 /氯仿/異戊醇05 24 1)進行純化，異丙醇進行沉淀，70%冷乙醇(RNase Free dH20 配制)漂洗沉淀，棄上清后干燥。干燥后加入7 μ L的RNase Free dH20溶解沉淀，得到 CIAP-treated RNA。去磷酸化總 RNA 用 TobaccoAcid Pyrophosphatase (TAP)去掉 mRNA 的 5'帽子結構，保留一個磷酸基團。處理后的CIAP/TAP-treated RNA與5' RACE Adaptor 進行連接，并用苯酚/氯仿/異戊醇05 24 1)進行純化，獲得Ligated RNA。隨后對 Ligated RNA進行反轉錄反應，Ligated RNA和Random 9 mers的混合物于70°C變性10分鐘后，冰上放置2min，再加入反轉錄反應的其余試劑進行反轉錄反應。反轉錄結束后，對反轉錄產物進行Outer PCR反應，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測無特異性條帶，將Outer PCR反應液稀釋50倍進行^mer PCR反應，反應結束后5 ‘端第二輪 PCR擴增結果進行電泳分析，得到600bp左右大小條帶，將5' RACE擴增結果進行膠回收， 回收產物分別與pGEM-T Easy載體連接，連接產物轉大腸桿菌XLlO-Gold感受態細胞，進行藍白斑篩選，PCR鑒定重組子，測序獲得乙醇脫氫酶基因5'端序列信息。5、乙醇脫氫酶基因的拼接。將獲的乙醇脫氫酶基因片段用GeneTool軟件進行拼接，得到完整的基因核苷酸序列，見SEQ ID N0. 1，該基因編碼蛋白質的氨基酸序列，見SEQ ID N0. 2。實施例四1、菌株液體培養和麻黃堿含量測定將出發菌株和轉基因酵母菌CGMCC No. 1499分別從斜面分別轉接入液體培養基， 置搖床230r/min、28°C 30°C培養72h，離心分別收集菌體以及發酵液。采用反向高效液相對轉基因酵母菌發酵液當中的1-麻黃堿含量進行測定，測定結果為11.87mg/L，出發菌株發酵液中不含ι-麻黃堿。2、采用抑制差減雜交技術(SSH)獲得重組酵母菌中乙醇脫氫酶基因片段采用Takara RNAiso Reagent對出發菌株和轉基因酵母酵母總RNA進行提取，以轉基因酵母總RNA為實驗組，出發菌株總RNA為驅動組，采用Clontech公司的 PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和 SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit 進行抑制差減雜交實驗。根據紫外分光光度計測定值所計算的RNA濃度，分別將提取的轉基因酵母和出發菌株總 RNA 用 RNA-free water 稀釋成 1 μ g/ μ L。按試劑盒說明書分別合成轉基因酵母和出發菌株單鏈cDNA。將轉基因酵母和出發菌株單鏈cDNA分別合成為雙鏈cDNA，實驗所得最佳循環數為18。將獲得的雙鏈cDNA進行純化，用Rsa I進行酶切，酶切后對實驗組進行接頭的連接，向帶有不同接頭經Rsa I酶切轉基因酵母雙鏈cDNA中加入過量驅動組cDNA(經RsaI酶切)進行第一次雜交，第一次雜交后混合帶有不同接頭的兩個樣品，并立即加入過量的新變性驅動組cDNA，進行第二次雜交。將經過差減雜交的稀釋cDNA進行兩次的抑制PCR反應，最后將第二次抑制PCR的產物回收，并與PGEM-T Easy載體連接，構建了轉基因重組酵母菌的質粒差減文庫。由于兩次雜交均加入的是過量驅動組cDNA，因此雜交過后只有轉基因酵母中特異表達基因和高表達基因才可以最大程度的形成帶有不同接頭的雙鏈cDNA，在隨后的抑制 PCR中得以指數級的富集。將獲得基因片段測序并將序列信息進行Blast同源比對，分別用BLASTn和BLASTx 程序將測序結果片段的堿基序列在GenBank數據庫中進行序列相似性搜索，并根據比對結果進行功能預測，初步確定該基因片段為乙醇脫氫酶基因。3、乙醇脫氫酶基因片段的鑒定將出發菌株和轉基因酵母菌CGMCC No. 1499分別從斜面分別轉接入液體培養基， 置搖床230r/min、28°C 30°C培養72h，離心分別收集菌體，采用TakaraRNAiso Reagent對出發菌株和轉基因酵母酵母總RNA進行提取，并用ployA引物進行反轉錄。反轉錄結束后， 用利用該片段設計的特異性引物adh3-Fl和&(&5-1 1進行？0 反應，參見附圖3，1.0(%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，參見附圖4，結果顯示出發菌株和轉基因菌株均擴增出相同大小的片段，表明該片段為出發菌株內源基因，但在轉基因酵母分泌表達麻黃堿時高表達。
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權利要求
1.一種乙醇脫氫酶基因，其特征在于，所述的乙醇脫氫酶基因具有如SEQ IDN0. 1所示的堿基序列，全長為1245bp，其編碼由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中375個氨基酸組成的蛋白質。
2.一種如權利要求1所述的乙醇脫氫酶基因的獲得方法，所述的乙醇脫氫酶基因ADH 是來源于產麻黃堿的轉基因重組酵母CGMCC No. 1499，通過SSi^PcDNA 3'和5'末端快速擴增(RACE)獲得，其特征在于，具體包括如下步驟(1)采用低能氬離子(Ar+)注入介導野生藍麻黃(Ephedraglauca L.)基因組DNA在異常漢遜酵母(Hansenula anomala)中隨機轉化，轉化后的酵母菌通過目標性狀的篩選，獲得生物合成麻黃堿重組酵母菌株CGMCC No. 1499 ；(2)將步驟1中所獲得轉基因酵母菌和出發菌株進行培養，并分別提取其總RNA，以轉基因酵母為實驗組，出發菌株為驅動組，進行抑制差減雜交實驗，構建了轉基因酵母與出發菌株之間的差減文庫；PCR鑒定重組子進行測序，獲得一段36;3bp的基因片段；測序結果用 BLASTn程序在GenBank數據庫中進行序列相似性搜索，確定該基因片段為乙醇脫氫酶基因；(3)將步驟2獲得乙醇脫氫酶基因片段分別設計cDNA3'和5' RACE的嵌套式引物各一對；提取重組酵母CGMCC No. 1499總RNA，利用已設計的3'和5' RACE引物，對乙醇脫氫酶的3'和5'末端進行擴增；將3'和5' RACE擴增結果進行回收，連接T-載體，檢測重組子后進行測序，測序獲得乙醇脫氫酶基因3'和5'端序列信息；將獲的乙醇脫氫酶基因片段用GeneTool軟件進行拼接，得到完整的基因核苷酸序列SEQ ID NO. 1。
3.—種乙醇脫氫酶，其特征在于，該乙醇脫氫酶蛋白質是由權利要求1所述的基因所編碼，具有如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，其來源于產麻黃堿的轉基因重組異常漢遜酵母(Hansenula anomala) CGMCC No. 1499。
4.如權利要求1所述的一種乙醇脫氫酶基因，其特征在于，所述的乙醇脫氫酶基因編碼由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的衍生物，如SEQID NO. 2所示的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸殘基且具有相同的乙醇脫氫酶活性的序列2 衍生蛋白質，包括在蛋白質C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸。
全文摘要
本發明公開一種乙醇脫氫酶基因及編碼的多肽。所述的乙醇脫氫酶基因的堿基序列，全長為1245bp，其氨基酸序列中375個氨基酸組成的蛋白質。本發明以利用低能氬離子(Ar+)注入介導藍麻黃基因組DNA在異常漢遜酵母(Hansenula anomala)2.340中的隨機轉化所獲得的產麻黃堿的轉基因重組異常漢遜酵母CGMCC No.1499為材料，從中分離出的一種可逆催化氧化短鏈醇、芳香醇等為相應的羧基化合物的新乙醇脫氫酶基因，擴大了乙醇脫氫酶基因的資源，同時為轉基因重組酵母生物合成麻黃堿的代謝途徑研究和利用該基因構建基因工程菌提供了依據，具有廣泛的應用領域。
文檔編號C12N15/10GK102154334SQ20111000339
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月10日 優先權日2011年1月10日
發明者呂杰, 毛培宏, 金湘 , 馬媛 申請人:新疆大學