專利名稱：木糖渣或糠醛渣預處理菌劑及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業微生物技術領域，特別涉及一種木糖渣或糠醛渣預處理菌劑及其制備方法及其用途。
背景技術：
隨著我國經濟快速發展，能源需求逐年增長，能源短缺問題也日益突出。目前我國大力發展包括沼氣在內的可再生能源以應對化石能源的短缺，實現我國經濟的可持續發展。在沼氣原料方面，除了畜禽糞便，最為人矚目的是利用農作物秸稈生產沼氣。然而秸稈本身難以充分降解，嚴重影響了其產氣效率和使用范圍，至今尚處于研究開發階段。木糖渣是木糖醇生產過程中產生的副產品。近年來，隨著我國食品及化學工業對木糖醇的需求量逐年增加，我國生產木糖醇的廠家和產量也在上升。通常生產1噸木糖醇會產生含水量70%-80%的木糖渣26-28噸。這些廢渣占用大量場地存放，且在春夏季節對周邊環境的植物生長造成嚴重影響，對環境造成嚴重污染。目前生產木糖醇的原料為玉米芯、棉籽殼及甘蔗渣等，故木糖渣中纖維原料含量豐富，其含量通常在50%-60%，且經過酸處理后已經變成粉末狀，便于微生物作用，不易結殼，是一種生產沼氣的良好原料。我國是糠醛的主要生產國和出口國之一，在其生產過程中能夠產生大量糠醛廢渣。每噸糠醛產品伴隨著10噸以上殘渣排放。我國每年排放糠醛廢渣近三千萬噸。由于木糖渣或糠醛渣中纖維素、半纖維素和木質素含量較高，難以降解，故其產氣效率受到一定影響。針對木糖渣及糠醛渣自身特性，開發相應的微生物處理菌劑，可以提高木糖渣或糠醛渣生產沼氣的效率，并有利于保證在冬季低溫條件下保證沼氣工程正常運行。中國專利文件200510077792. 3公開了一種復合菌劑預處理秸稈的發酵方法，其菌劑組成為木霉菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。秸稈經粉碎、潤濕后加入復合菌劑和碳酸氫銨進行堆慪后進行沼氣發酵。經預處理后的秸稈發酵速度和產氣速度均有提高，且產氣時間縮短。其所開發的菌劑可用于玉米秸稈、稻草、麥稈等農業廢棄物預處理，使用范圍廣泛。中國專利文件200810140400. 7公開了一種沼氣池用復合微生物菌劑及其制備方法。 該發明提出了一種沼氣池用復合微生物菌劑，是由熒光假單胞菌、蠟質芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和環狀芽孢桿菌四種微生物組成。該菌劑不僅能夠促進冬季沼氣池正常產氣，且可以利用秸稈作為主要原料制取沼氣。萬楚筠等.微生物預處理油菜秸稈堆提高沼氣產量的影響[J].農業工程學報，2010，26: 267-271.)利用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、變色栓菌、黃孢原毛平革菌制備了油菜秸稈的降解混合菌劑。上述三個文件均只針對秸稈開發了相應的微生物菌劑并用于沼氣發酵預處理過程，對其他工業纖維質原料(如木糖渣、糠醛渣)則無涉及。較之秸稈，木糖渣或糠醛渣酸度較高，且含有少量糠醛，對多種微生物(尤其是酵母和細菌)活性均有較強抑制作用。因此，針對性的開發相應的預處理菌劑對于提高其發酵速度和產氣效率極為重要。
發明內容
本發明目的是提供一種用于木糖渣或糠醛渣預處理的菌劑，該菌劑針對木糖渣或糠醛渣的自身特點，可以大幅提高木糖渣或糠醛渣發酵速度，保證低溫條件下木糖渣或糠醛渣生產沼氣。此外，該菌劑在秸稈預處理方面也有良好的效果。本發明技術方案如下一種木糖渣或糠醛渣預處理菌劑，是由綠色木霉、黃孢原毛平革菌、黑曲霉、米曲霉、變色栓菌五種菌經液態發酵后得到的菌液混合制成，其按重量份如下綠色木霉菌液0. 20-0. 40，黃孢原毛平革菌菌液0. 10-0. 15，黑曲霉菌液0. 05-0. 10， 米曲霉菌液0. 08-0. 16，變色栓菌菌液0. 05-0. 10 ；上述發酵菌絲重量(干重)為20g/L以上。木糖渣或糠醛渣預處理菌劑及其制備方法，它包括如下步驟①將綠色木霉、黃孢原毛平革菌、黑曲霉、米曲霉和變色栓菌這五種菌分別按照斜面菌種活化、搖瓶發酵、種子罐液態發酵、生產發酵罐液態發酵生產五個步驟進行分別得到綠色木霉菌液、黃孢原毛平革菌菌液、黑曲霉菌液、米曲霉菌液、變色栓菌菌液；
②菌液復配，將上述五種菌菌液按上述比例進行混合制成液體劑型。木糖渣或糠醛渣預處理菌劑及其制備方法，其特征是將綠色木霉菌液、黃孢原毛平革菌菌液、黑曲霉菌液、米曲霉菌液、變色栓菌菌液按比例混合后的菌液中加入固體填料制成固體劑型。所述固體填料為木糖渣、糠醛渣、草炭、硅藻土中的一種或幾種混合，其總用量為混合后菌液總重量的4-10倍。木糖渣或糠醛渣預處理菌劑的用途，其特征是將所述的木糖渣或糠醛渣預處理菌劑用于木糖渣或糠醛渣在進行沼氣發酵前的預處理。為了方便實現本發明，本發明記載下述培養基及培養方法，但菌種培養基及培養方法不限于此，采用其它常規方法對所用菌種進行發酵也可以得到本發明提及的綠色木霉菌液、黃孢原毛平革菌菌液、黑曲霉菌液、米曲霉菌液、變色栓菌菌液。所述綠色木霉、黃孢原毛平革菌、黑曲霉、米曲霉和變色栓菌的菌種活化培養基包括土豆提取液200克，葡萄糖20克，自來水1000毫升，瓊脂20克，PH 5.0。其中土豆提取液是指，土豆200克，切塊煮沸30分鐘后用細紗布(80-150目)過濾后所得澄清提取液。1)所述綠色木霉的液態發酵培養條件是酵母膏15克，葡萄糖20克，微晶纖維素Mg，玉米漿10克，麩皮20克，磷酸二氫鉀1. 8克，硫酸鎂0. 9克，硫酸銨6克，硫酸亞鐵 0. 05克，氯化鈷0. 4克，氯化鈣0. 5克，消泡劑0. 1毫升，自來水1000毫升，ρΗ5· 0。綠色木霉孢子懸液(IO7個/毫升)接種量5%_10% (ν/ν)，培養溫度^_32°C，轉速 200轉/分鐘，通氣量1:1 (通氣體積比，以發酵罐裝液量為基準)培養1-3天到對數生長期獲得液體種子。2)黃孢原毛平革菌菌液的液態發酵培養條件葡萄糖15克，磷酸二氫鉀3. 6克，硫酸銨2. 4克，玉米漿10克，麩皮5克，硫酸鎂0. 3克，氯化鈣0. 6克，硫酸亞鐵5. 2毫克，硫酸錳1. 8毫克，硫酸鋅2. 2毫克，硫酸銅0. 8毫克，自來水1000毫升，消泡劑0. lml，pH6. 0。黃孢原毛平革菌孢子懸液(IO6個/毫升)接種量5%_10%( v/v)，培養溫度25-28°C， 轉速150轉/分，通氣量1:1 (通氣體積比，以裝液量為基準)培養時間2-5天到對數生長期獲得液體種子。3)變色栓菌菌液液態發酵培養條件葡萄糖15克，磷酸二氫鉀3. 8克，硫酸銨2. 2克，玉米漿12克，麩皮10克，硫酸鎂0. 3克，氯化鈣0. 6克，硫酸亞鐵4. 6毫克，硫酸錳2. 2 毫克，硫酸鋅2. 6毫克，硫酸銅1. 3毫克，自來水1000毫升，消泡劑0. Iml, ρΗ6· 0。孢子懸液(IO6個/毫升)接種量5%-10%(ν/ν)，培養溫度25_28°C，轉速150轉/分， 通氣量1 1 (通氣體積比，以裝液量為基準)培養時間2-5天到對數生長期獲得液體種子。4)黑曲霉的液態發酵培養條件，葡萄糖20克，豆粕30克，麩皮20克，磷酸二氫鉀1. 8克，硫酸鎂0. 9克，硝酸銨1. 5克，消泡劑0. 1毫升，自來水1000毫升，pH 5. 0。黑曲霉菌孢子懸液(IO7個/毫升)接種量5%_10% (ν/ν)，培養溫度28-32°C，轉速 200轉/分鐘，通氣量1:1 (通氣體積比，以發酵罐裝液量為基準)培養1-3天到對數生長期獲得液體種子 。5)米曲霉的液態發酵培養條件，葡萄糖10克，淀粉40，豆粕30克，麩皮20克， 磷酸二氫鉀1. 5克，硫酸鎂0. 2克，硫酸銨0. 4克，氯化鈣0. 6g，氯化鉀0. 4g，消泡劑0. 1毫升，自來水1000毫升，pH 5.0。米曲霉孢子懸液(IO7個/毫升)接種量5%-10% (v/v)，培養溫度28-32°C，轉速200轉/分鐘，通氣量1:1 (通氣體積比，以發酵罐裝液量為基準)培養 1-3天到對數生長期獲得液體種子。上述說明中所述及的孢子懸液是指，利用無菌水(自來水在121°C下滅菌30分鐘， 含體積分數為0. 1%吐溫80)對綠色木霉菌、黑曲霉菌、米曲霉菌、變色栓菌和黃孢原毛平革菌斜面沖洗后稀釋一定倍數所得的含有一定孢子數量的懸浮溶液。上述微生物菌劑的指標方法中未明確限定的均可依照現有技術進行。本發明所述復合微生物菌劑使用溫度在15°C以上，發酵原料為木糖渣、糠醛渣二者或二者之一與碳酸氫銨、氨水二者或其中之一的混合物。本發明采用五種真菌進行復配，其中的黃孢原毛平革菌和變色栓菌可以降解木糖渣或糠醛渣中的糠醛組分，以及其中的纖維素、木質素和半纖維素；木霉、黑曲霉和米曲霉可以在酸性條件下(PH3-6)降解木糖渣或糠醛渣中的纖維素和半纖維素。此外，該真菌菌劑還可以通過菌絲的機械穿透力破壞木糖渣或糠醛渣的物理結構，使其變得更容易降解。通過該復合真菌菌劑處理的木糖渣或糠醛渣用于沼氣發酵中，可以加快沼氣啟動時間，比未處理的木糖渣或糠醛渣，其啟動時間通常可以提前3-10天，且產氣效率提高30%-60%。尤其在冬季，經復合真菌菌劑處理的木糖渣或糠醛渣作為沼氣發酵主要原料可以保證在低溫 (15°C _18°C)條件下持續產氣，而對照組采用未經處理的木糖渣或糠醛渣幾乎不產沼氣。
具體實施例方式以下實施例對本發明做進一步說明，但本發明并不只限于此。如無特殊說明，原料用量為重量份。各實施例中木糖渣、糠醛渣、草炭、硅藻土可以通過購買獲得。原料需過60 目篩，含水量10%以下。實施例1
M^y^M (Trichoderma Firiofe )、黃抱原毛平革菌{Phanerochae te chrysosporium ) > 黑曲 M ^Aspergillus niger)、米曲毒(Aspergillus oryzae)> 變色栓鬼、Trametes versicolor)均可在中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)獲得，綠色木霉為CGMCC 3. 5455，3. 3711，3. 4005，3. 4264，3. 2941，3. 2942,3. 2876,3. 1913 其中之一；黃孢原毛平革菌CGMCC編號為5. 776，變色栓菌CGMCC編號為5. 48或5. 161，黑曲霉菌CGMCC編號為 3. 6479，3. 6478，3. 6477，3. 6476，3. 6475，3. 6329 其中之一；米曲霉為 3. 5232，3. 4437， 3. 4383，3. 4382，3. 4259，3. 2140其中之一。經常規液態純種發酵后獲得五種菌液。其菌體干重均達到20克/升。具體實施方法如下
1)將上述五種微生物采用各自活化斜面培養基進行活化，在30°C條件下培養8天。2)將上述活化好的菌種孢子懸液接種到各自液態培養基。綠色木霉培養酵母膏15克，葡萄糖20克，玉米漿10克，麩皮20克，磷酸二氫鉀
1.8克，硫酸鎂0. 9克，硫酸銨6克，硫酸亞鐵0. 05克，氯化鈷0. 4克，氯化鈣0. 5克，消泡劑0. 1毫升，自來水1000毫升，pH5.0。孢子懸液(IO7個/毫升)接種量5% (v/v)，培養溫度^°C，轉速200轉/分鐘，培養2天到對數生長期獲得液體種子。黃孢原毛平革菌培養葡萄糖15克，磷酸二氫鉀3. 6克，硫酸銨2. 4克，玉米漿10 克，麩皮5克，硫酸鎂0. 3克，氯化鈣0. 6克，硫酸亞鐵5. 2毫克，硫酸錳1. 8毫克，硫酸鋅
2.2毫克，硫酸銅0.8毫克，自來水1000毫升，pH 6.0。孢子懸液(106個/毫升)接種量 5% (v/v)，培養溫度^°C，轉速150轉/分，培養3天到對數生長期獲得液體種子。變色栓菌培養葡萄糖15克，磷酸二氫鉀3. 8克，硫酸銨2. 2克，玉米漿12克，麩皮10克，硫酸鎂0. 3克，氯化鈣0. 6克，硫酸亞鐵4. 6毫克，硫酸錳2. 2毫克，硫酸鋅2. 6毫克，硫酸銅1.3毫克，自來水1000毫升，消泡劑0. lml，pH6.0。孢子懸液(106個/毫升)， 接種量5% (v/v)，培養溫度28°C，轉速200轉/分鐘，通氣量1:1 (通氣體積比，以發酵罐裝液量為基準)培養2天到對數生長期獲得液體種子。米曲霉培養葡萄糖10克，淀粉40，豆粕30克，麩皮20克，磷酸二氫鉀1. 5克，硫酸鎂0. 2克，硫酸銨0. 4克，氯化鈣0. 6g，氯化鉀0. 4g，消泡劑0. 1毫升，自來水1000毫升， PH 5.0。孢子懸液(107個/毫升)接種量10% (v/v)，培養溫度30°C，轉速200轉/分鐘， 通氣量1 1 (通氣體積比，以發酵罐裝液量為基準)培養2天到對數生長期獲得液體種子。3)種子罐300L，裝液量200L，按照上述五種微生物培養基配方分別投料，并按比例加入前文所述消泡劑，滅菌后按照5%接種量接入搖瓶液體種子液，綠色木霉菌、黑曲霉菌及米曲霉菌培養時間36小時，培養溫度32°C，轉速均為250轉/分；變色栓菌和黃孢原毛平革菌培養溫度，轉速200轉/分，培養時間3天，培養溫度，轉速200轉/分。 上述發酵過程中通氣量均為1:1 (體積比)。4)生產發酵罐2000升，裝液量1400升，按照上述五種微生物培養基配方分別投料，按比例加入消泡劑滅菌后按照10%接種量接入達到對數生長期液體種子。綠色木霉菌、 黑曲霉菌和米曲霉菌培養時間32小時，培養溫度32°C，轉速均為300轉/分；黃孢原毛平革菌和變色栓菌培養時間3天，培養溫度，轉速200轉/分。上述發酵過程中通氣量均為1:1 (體積比)。發酵完畢后獲得菌液。上述菌液按照如下比例進行混合綠色木霉菌液0.40，黃孢原毛平革菌菌液 0. 15，黑曲霉菌液0. 05，米曲霉菌液0. 08，變色栓菌菌液0. 10，即得微生物菌劑。實施例2
五種菌的菌液制備方法如實施例1所述。木糖渣3份，硅藻土 1份，草炭1份。將木糖渣、硅藻土和草炭滅菌后混合均勻后加入微生物菌劑(綠色木霉菌液0. 30，黃孢原毛平革菌菌液0. 10，黑曲霉菌液0. 06，米曲霉菌液0. 16，變色栓菌菌液0. 05。)，混合均勻后即得復合固體菌劑。
實施例3
五種菌的菌液制備如實施例1所述。糠醛渣1份，草炭2份，硅藻土 2份，滅菌后加入混合器加入微生物菌劑(綠色木霉菌液0. 20，黃孢原毛平革菌菌液0. 15，黑曲霉菌液0. 05，米曲霉菌液0. 10，變色栓菌菌液 0.10。)，混合均勻后即得復合固體菌劑。實施例4
將實施例1中所獲得的液體菌劑接種到木糖渣中(PH 3，含水量50%)，接種量按重量份計9份木糖渣接入1份液體菌劑，混勻后于25°C條件下處理15天后作為主要原料進行厭氧發酵產沼氣實驗(預處理的木糖渣100份，尿素0. 1份)，對照組為未處理的木糖渣100份， 尿素0. 1份。在35°C培養條件下，沼氣發酵啟動時間比對照組縮短6天，產氣率提高45%。實施例5
將實施例2中所獲得的固體菌劑接入糠醛渣中(pH 4，含水量20%)并調節含水量為70% (w/w)，于18°C條件下處理20天后作為主要原料進行沼氣發酵實驗(預處理的糠醛渣100 份，尿素0. 1份)，對照組為未處理的糠醛渣100份，尿素0. 1份。在20°C培養條件下，沼氣發酵啟動時間比對照組縮短10天，產氣率提高60%。
權利要求
1.一種木糖渣或糠醛渣預處理菌劑，是由綠色木霉、黃孢原毛平革菌、黑曲霉、米曲霉、變色栓菌五種菌經液態發酵后得到的菌液混合制成，其按重量份如下綠色木霉菌液0. 20-0. 40，黃孢原毛平革菌菌液0. 10-0. 15，黑曲霉菌液0. 05-0. 10，米曲霉菌液 0. 08-0. 16，變色栓菌菌液0. 05-0. 10 ；上述發酵菌絲重量干重為20g/L以上。
2.根據權利要求1所述的木糖渣或糠醛渣預處理菌劑，其特征是所述五種菌的菌液的重量份為綠色木霉菌液0. 40，黃孢原毛平革菌菌液0. 15，黑曲霉菌液0. 05，米曲霉菌液 0. 08，變色栓菌菌液0. 10。
3.—種如權利要求1所述的木糖渣或糠醛渣預處理菌劑的制備方法，它包括如下步驟①將綠色木霉、黃孢原毛平革菌、黑曲霉、米曲霉和變色栓菌這五種菌分別按照斜面菌種活化、搖瓶發酵、種子罐液態發酵、大罐液態發酵生產五個步驟進行分別得到綠色木霉菌液、黃孢原毛平革菌菌液、黑曲霉菌液、米曲霉菌液、變色栓菌菌液；②菌液復配，將上述五種菌菌液按比例進行混合制成液體劑型。
4.一種根據權利要求3所述的木糖渣或糠醛渣預處理菌劑的制備方法，其特征是將綠色木霉菌液、黃孢原毛平革菌菌液、黑曲霉菌液、米曲霉菌液、變色栓菌菌液按比例混合后的菌液中加入固體填料制成固體劑型。
5.根據權利要求4所述的木糖渣或糠醛渣預處理菌劑的制備方法，其特征是所述固體填料為木糖渣、糠醛渣、草炭、硅藻土中的一種或幾種混合，其總用量為混合后菌液總重量的4-10倍。
6.一種木糖渣或糠醛渣預處理菌劑的用途，其特征是將權利要求1所述的木糖渣或糠醛渣預處理菌劑用于木糖渣或糠醛渣在進行沼氣發酵前的預處理。
全文摘要
一種木糖渣或糠醛渣預處理菌劑及其制備方法和用途，屬于農業微生物技術領域，涉及到一種特別用于促進木糖渣或糠醛渣降解、提高沼氣生產效率的微生物復合菌劑。本發明首先采用液體發酵工藝對微生物菌劑各組分進行純種發酵后進行復配而成。該菌劑配制方法為綠色木霉菌液0.20-0.40重量份，黃孢原毛平革菌菌液0.10-0.15重量份，黑曲霉菌液0.05-0.10重量份，米曲霉菌液0.08-0.16重量份，變色栓菌菌液0.05-0.10重量份。上述發酵菌絲重量干重為20g/L以上。該復合菌劑可以提高木糖渣或糠醛渣的降解速度及其產沼氣效率，產氣率提高30%-60%，縮短發酵時間，啟動期縮短3-10天；對粉碎后秸稈預處理及產沼氣也收到良好的效果。
文檔編號C12R1/69GK102154108SQ20111002121
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月19日 優先權日2011年1月19日
發明者華棟梁, 張曉東, 張 杰, 李巖, 梁曉輝, 許海朋 申請人:山東省科學院能源研究所