一種新型重組抗菌多肽藥物的制備方法

專利名稱：一種新型重組抗菌多肽藥物的制備方法
技術領域：
本發明涉及抗生素藥物生產工藝，特別是一種新型重組抗菌多肽藥物的制備方法。
背景技術：
人們一直致力于開發新型的抗菌素，在細菌胞膜上直接形成離子通道而致細菌死亡是比較有前途的抗菌素開發方向之一。自然界中，為數不少的細菌毒素就是以這種機制來殺死細菌的，其模式標本就是大腸桿菌(Escherichia coli)分泌一種毒素蛋白-大腸菌素(colicin)。早在 1946 年，青霉素的發明者 H. Florey (British J. of Experimental Pathology. 1946(27)，378 390.)等就已對大腸菌素的抗菌活性以及安全性、毒理等進行了詳盡的評價，他們發現大腸菌素抗菌活性極強，提取物被稀釋至數百萬倍仍有非常有效的抗菌效果。但抗菌譜非常特異，只能針對大腸桿菌和親緣相近的某些革蘭氏陰性菌。1953年Jacob等發現大腸菌素Ia,在pH 6-7時殺菌功能強大。1978年Finkelstein等發現可形成離子通道的大腸菌素K，可以在人工脂質雙分子膜上形成電壓依賴性離子通道，從而在根本上揭示了這一類細菌毒素的抗菌機制，即在靶細胞膜上形成致死性離子通道。1996年Qiu和Finkelstein等揭示了大腸菌素Ia在人工脂質雙分子膜上形成的離子通道開放和關閉時的跨膜立體結構，為在分子水平上設計和制備新型的抗菌素奠定了理論基礎。2001年Qiu應用大腸菌素融合金黃色葡萄球菌信息素構建和制備得到抗耐藥性金黃色葡萄球菌的抗菌工程多肽藥物，體內與體外實驗證實該多肽具有殺菌活性和殺菌選擇性，依據同樣方法，Qiu構建了分別針對耐萬古霉素腸球菌和耐青霉素肺炎鏈球菌的抗菌工程多肽，在體內和體外實驗中，這些多肽對這些現有抗菌素難以對付的致病菌都表現出了特異、穩定、快速的殺菌效應，其藥效勝過萬古霉素、苯唑西林、青霉素等現用抗菌素數十倍至上千倍。相應研究結果以論文形式發表在Nature Biotechnology (21 (12) : 1480-85, 2003)、Antimicrobial Agents and Chemotherapy (49 (3) :1184-1189, 2005)等國際學術期刊。在本項目中，我們提出了利用大腸菌素融合致病菌抗原的抗體模擬物構建抗菌工程多肽的全新研究思路及技術路線，并已經成功制備抗菌工程多肽一廣譜抗菌信息菌素藥物。在抗菌多肽藥物領域有獨特的思路和理論創新，已申報專利，同時建立了人工構建小型抗體模擬物方法，相關研究結果已發表在Nature biotechnology (25 (8) :921-929,2007)。本項目研發的新型高效廣譜抗菌信息菌素藥物，因其殺菌機制特殊，對耐藥菌有良好的殺菌效果，對多重耐藥綠膿桿菌(MDRPA)、耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)等耐藥菌都表現出比現有抗生素更強的抗菌效力。該藥物的研發和制備，對于解決日益嚴重的因耐藥菌株而導致的一系列治療問題，保障人民身體健康有重要作用。本項目所研究的廣譜抗菌信息菌素藥物與目前國內外研究的小肽類抗生素(人穿孔素、家蠶抗菌肽)是完全不同的兩類物質。其區別在于(I)該抗菌工程多肽與其原型大腸菌素一樣，是以單體(monomer)構象工作的，即一個分子就能組成一個完整的工作單位，而小肽類抗生素是以多體(polymer)構象工作的，即需要數十個分子才能組成一個完整的工作單位；(2)該抗菌工程多肽與其原型大腸菌素一樣，可以在血循環和體內工作，而小肽類抗生素不能；(3)該抗菌工程多肽與其原型大腸菌素一樣，在靶細胞膜上形成的是電壓依賴性離子通道，其殺傷機制和效率遠遠高于小肽類抗生素在靶細胞膜上形成的孔道。根據檢索至2010年本領域文獻，在進行動物體內實驗時，上述小肽類抗生素幾乎都存在著一個致命的缺陷會被動物體內蛋白酶降解。因此尚沒有一個自小肽類抗生素開發出來的藥物前體通過了臨床測試。而本項目研發和生產的抗菌工程多肽新藥的原型本身就是共生在動物和人類消化道細菌所產生的、結構和作用機理與上述小分子多肽完全不同的細菌素，在長達8年的體內外測試中始終表現出強大的殺菌活性；而且在大動物(奶牛、奶山羊等)疾病模型試驗中，無論是局部注射和靜脈注射均有良好的殺菌效果和治療作用，因此本抗菌工程多肽新藥不存在上述小分子多肽難以在體內使用的局限。經過文獻查閱發現，目前國外對大腸菌素、細菌信號傳導多肽、抗體改造等分別進行了相應研究，但尚無任何實驗室曾進行過類似本項目研究思路和技術路線的研究，也未見任何類似文章發表。2010年6月經查詢美國國家醫學圖書館(www.ncbi.nlm.nih.gov), 目前已登錄的關于大腸菌素(Colicin)的文獻有2600余篇,關于信息素(Pheromone)的文獻有7300余篇,關于抗體改造(Antibody reconstitution)的文獻有2100余篇,關于免疫毒素(Immunotoxin)的文獻有3800余篇,關于抗菌素耐藥性(antibiotic resistance)的研究文獻94000余篇，在這些信息來源中均未見到任何類似本項目的科學構思、設計理念和研究實踐見諸報導。在2010年6月，委托教育部查新工作站(No. I)進行的查新表明，除本項目組人員的報道外，國內外未見利用大腸菌素結合靶細菌信息素或人工設計的靶細菌抗體模擬物，構建針對靶細菌的抗菌工程多肽藥物的報道。國內外未見基于本項目的靶向工程抗菌多肽構建方法，生產的抗感染性細菌的人用、獸用藥物及農藥的報道。我們已將此廣譜抗菌信息菌素藥物按照實際需要，分別進行動物藥物(治療奶牛乳房炎的藥物)和人用藥物(抗菌素)的開發。體內外抗菌測試表明，該信息菌素呈現出很強的抗菌作用，尤其是其體內抗菌效力明顯優于體外抗菌效力。2010年5月委托農業部獸藥安全監督檢驗測試中心進行該藥物的安全性評價，證明其無毒、無致突變、無致畸作用。已經完成的藥物安全評估結果如下①大、小鼠急性毒性試驗結論為該藥物屬實際無毒類(報告編號WTPJ20100003)；②鼠傷寒沙門氏菌回復突變(Ames)試驗結果為陰性，表明該藥物無致突變性(報告編號 WTPJ20100003(2))；③小鼠骨髓細胞微核試驗結果為陰性，無致突變作用(報告編號WTPJ20100003(3))；④小鼠精子畸形試驗結果為陰性，無致小鼠精子畸形作用(報告編號WTPJ20100003(4))。⑤重組抗菌多肽藥物對奶牛乳房炎分離病原菌的體外抑殺試驗，試驗結果證明A重組抗菌多肽藥物具廣譜抗菌作用，在體外對各種奶牛乳房炎病原菌具有良好的抑殺效應。B重組抗菌多肽藥物(發明申請名稱一種新型抗生素及其核苷酸序列、制備方法與應用，申請號200910157564. 5)對葡萄球菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌)的抑殺作用最好，MIC50可達0. 125 u g/mL, MBC50可達0. 25 y g/mL。與對照之頭孢噻吩(2ug/ml)、苯唑西林(4ug/ml)、青霉素、氨芐青霉素、林可霉素、慶大霉素(均為8ug/ml以上)有極顯著差異。按藥物分子量進行標化，多肽(MW 70, 000)對所試葡萄球菌的抑殺作用是頭孢噻吩(MW 523)作用的2，100倍；是苯唑西林(MW 423)作用的5，300 倍。C重組抗菌多肽藥物對鏈球菌、化膿隱秘桿菌、大腸桿菌等腸桿菌科細菌的抑殺作用基本相當，對鏈球菌(無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、牛鏈球菌)的MIC5tl為
l.Ou g/mL, MBC50 為 2. 0 y g/mL ;對化膿隱秘桿菌的 MIC50 為 0. 25 y g/mL, MBC50 為 I. 0 y g/mL ;對大腸桿菌等腸桿菌科細菌的MIC5tl為I. 0 ii g/mL, MBC50為I. 0 ii g/mL。D重組抗菌多肽藥物對細菌敏感株和耐藥株的抑殺作用無明顯差異，能高效抑殺具各種耐藥表型的葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌。在前期的大動物治療試驗(奶牛乳房炎實驗性治療試驗)中，治愈112頭，治愈率達到95%。經過國家獸藥安全評價中心檢測，本藥物屬實際無毒類藥物，不會對動物產生毒 性和不良影響，同時該類藥物屬可降解信息菌素物質，避免了常規抗菌素在畜禽疾病治療后產生藥物殘留的弊病，經北京市乳品質量監督檢驗站檢測，應用該藥物治療后的奶牛所產牛奶中均無抗生素殘留(檢測報告編號A2009-249)。但是上述重組抗菌素的生產，如發明人前期的申請號為200910157564. 5，名稱為“一種新型抗生素及其核苷酸序列、制備方法與應用”發明申請說明書實施例I中公開了該抗菌肽的完整制備工藝，在獲得重組制粒并轉化感受態細胞之后的增菌誘導表達重組蛋白的步驟中，采用了較常規的增菌工藝，由于在實驗階段，對生產效率和制備量沒有高要求，但隨著這些重組抗生素經臨床試驗、動物試驗及安全評估，證明這些重組抗菌肽醫用價值之后，采用上述發明申請中的制備工藝，成本太高，且很難獲得大量的高純度重組蛋白表達物，因此，如何進行有效的規模化開發和生產成了上述藥物走向實際應用過程中一個必須解決的問題。

發明內容
本發明針對上述領域的空白及急切需求，提供上述重組抗菌多肽的制備方法。一種新型重組抗菌多肽藥物的制備方法，包括如下步驟(I)制備含有重組質粒的大腸桿菌菌種，冷凍保存，(2)采用液體生產培養基對菌種進行擴大培養，(3)誘導菌種表達重組抗菌多肽；其特征在于，所述液體生產培養基的配方如下各組分在終溶液中的質量體積比為磷酸氫二鈉0.4% -0.7%，磷酸二氫鉀0. 1% -0.6%，氯化銨0. 05% -0. 2%，氯化鈣
0.0005% -0. 001%，硫酸鎂 0.5% -2.5%，蛋白胨 1% —3%，酵母粉 0.5% _1%，葡萄糖
0.1% -0. 5%，氯化鈉0. 2% —0. 8%其余為水所述液體生產培養基的配方如下各組分在終溶液中的質量體積比為磷酸氫二鈉0. 68 %，磷酸二氫鉀0. 3 %，氯化銨0. I %，氯化鈣0. 001 %，硫酸鎂0. 02 %，蛋白胨
2.5%，酵母粉0. 75%，葡萄糖0. 2%，氯化鈉0.6%，其余為水。所述對菌種進行擴大培養分為三級擴大培養，各級擴大培養的參數為220rpm、37°C>3-8 小時。
所述誘導表達重組抗菌多肽指對步驟(2)得到的菌液做如下處理攪拌速度220rpm，最大通氧量，30°C，2 4小時；42°C,0. 5小時；37°C，I 2小時，達到42°C時加入終濃度為0. 5mM的IPTG。所述步驟(2)之前，菌種進行如下處理(I)菌種4°C解凍，在加有終濃度為50 u g/ml AMP的LB液體培養基中，220rpm、37°C培養過夜復蘇菌種，然后涂布于LB固體培養基上培育單菌落，
(2)挑取單菌落于I. 5mlLB液體培養基中，220rpm、37°C培養5-8小時；然后轉至IOOmlLB液體培養基中，220rpm、37°C培養5-8小時；所述LB培養基的組分及各組分質量體積比為氯化鈉1%，蛋白胨1% g，酵母
0.5%，瓊脂0.8 1%，其余為水。所述大腸桿菌指含有重組質粒pBHC-SAl、pBHC-SA2、pBHC-SA3、pBHC-SA4、pBHC-SE或pBHC-PA的BL-21工程菌。基于發明人前期獲得的一系列重組抗菌多肽，本發明提供一種制備重組抗菌素的方法，專門用于大量制備高純度的重組抗菌肽。現有方法不適宜大規模生產，在大規模生產情況下純度或產量不理想等缺陷，是將發明人前期獲得的重組抗菌多肽推向臨床應用過程中必須克服的難題。本發明通過對培養基成分的選擇和優化組合，提供了一種最適合大腸桿菌表達外源基因的培養基配方，通過選擇最適合的擴大培養參數，使整個制備過程環環相扣，兼顧大規模生產的情況下制備重組抗菌多肽的純度與產量的矛盾。為發明人前期獲得重組抗菌多肽的規模化、工業化生產奠定了基礎。


圖I本發明的方法制備的抗菌肽與AMP的對比結果從左到右C0N :3小時開始渾池；AMP :4小時開始渾池；實施例I制備得到的樣品194批次蛋白與198批次蛋白第27個小時澄清。圖2不同批次抗菌工程多肽純度測試條帶I為對照Marker，條帶2為120批次，條帶3為122批次，條帶4為126批次，條帶5為246批次，條帶6為247批次，條帶7為248批次，條帶8為250批次，條帶9為252批次。其中120，122，126批次的生產方法為現有方法，246，247，249，250，252批次為本
發明的新方法生產。圖3.不同生產規模下的差率比較從左到右為搖瓶、42L發酵罐、200L發酵罐連續生產10批次的產率。
具體實施例方式以下以一些具體的重組抗菌肽說明本發明的制備工藝，但本發明不限于制備以下重組抗菌肽。實施例I.抗大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、綠膿桿菌抗菌肽的制備工藝本發明用到的培養基(I) LB液體培養基
IOOml氯化鈉Ig,蛋白胨lg，酵母0. 5g,將各種試劑稱好后放入250ml燒瓶中,力口A IOOml自來水，使其溶解，在高壓滅菌鍋內120°C 8min滅菌(2) LB固體培養基IOOml氯化鈉0. 5 I. 5g,蛋白胨0. 5 2g,酵母0. 3 Ig,瓊脂0. 8 3g, LB固體培養基用于菌種復蘇后劃平板培養單克隆菌落用。將各種試劑稱好后放入250ml燒瓶中，加入IOOml自來水，使其溶解，在高壓滅菌鍋內120°C 8min滅菌(3)生產專用培養基(7OOml 20L 100L 200L)各成分在終溶液中的質量體積比為磷酸氫二鈉0.4% _0.7%，磷酸二氫鉀
0.1% -0. 6%，氯化銨 0. 05% -0. 2%，氯化鈣 0. 0005% -0. 001%，硫酸鎂 0.5% -2.5%, 白胨1% —3%，酵母粉0. 5% _1%，葡萄糖0. 1% -0. 5%，氯化鈉0. 2% —0.8%其余為水。 本發明優選配方如表I :
權利要求
1.一種新型重組抗菌多肽藥物的制備方法，包括如下步驟 (1)制備含有重組質粒的大腸桿菌菌種，冷凍保存， (2)采用液體生產培養基中對菌種進行擴大培養， (3)誘導表達重組抗菌多肽，分離純化重組抗菌多肽； 其特征在于，所述液體生產培養基的配方如下各組分在終溶液中的質量體積比為磷酸氫二鈉0.4% -0.7%，磷酸二氫鉀0. 1% -0.6%，氯化銨0. 05% -0. 2%，氯化鈣0. 0005% -0. 001%，硫酸鎂 0.5% -2.5%，蛋白胨 1% -3 %，酵母粉 0.5% _1%，葡萄糖0. 1% -0. 5%，氯化鈉0. 2% —0. 8%其余為水。
2.根據權利要求I所述的制備方法，所述液體生產培養基的配方如下各組分在終溶液中的質量體積比為磷酸氫二鈉0. 68%，磷酸二氫鉀0. 3%，氯化銨0. I %，氯化鈣0. 001%，硫酸鎂0. 02%，蛋白胨2. 5%，酵母粉0. 75%，葡萄糖0. 2%，氯化鈉0. 6%，其余為水。
3.根據權利要求I所述的制備方法，所述對菌種進行擴大培養分為三級擴大培養，各級擴大培養的參數為220rpm、37°C、3-8小時。
4.根據權利要求I所述的制備方法，所述誘導表達重組多肽指對步驟(2)得到的菌液做如下處理攪拌速度220rpm，最大通氧量，30°C 2 4小時；42°C 0. 5小時；37°C I 2小時，達到42°C時加入終濃度為0. 5mM的IPTG。
5.根據權利要求I所述的制備方法，所述步驟(2)擴大培養前，對冷凍保存的菌種進行如下處理 (1)菌種4°C解凍，在加有終濃度為50iig/mlAMP的LB液體培養基中，220rpm、37°C培養過夜復蘇菌種，然后涂布于LB固體培養基上培育單菌落， (2)挑取單菌落于1.5mlLB液體培養基中，220rpm、37°C培養5-8小時；然后轉至IOOmlLB液體培養基中，220rpm、37°C培養5-8小時； 所述LB固體培養基的組分及各組分質量體積比為氯化鈉I %，蛋白胨1% g，酵母0.5%，瓊脂0.8 1%，其余為水。
6.根據權利要求I所述的制備方法，所述大腸桿菌指含有重組質粒pBHC-SAl、PBHC-SA2、pBHC-SA3、pBHC_SA4、pBHC-SE 或 pBHC-PA 的 BL-21 工程菌。
全文摘要
本發明提供的一種新型重組抗菌多肽藥物的制備方法，涉及重組抗生素藥物生產技術。包括如下步驟(1)制備含有重組質粒的大腸桿菌菌種，冷凍保存，(2)采用液體生產培養基中對菌種進行擴大培養，(3)誘導表達重組抗菌多肽，分離純化重組抗菌多肽；其特征在于，所述液體生產培養基的配方如下各組分在終溶液中的質量體積比為磷酸氫二鈉0.4％-0.7％，磷酸二氫鉀0.1％-0.6％，氯化銨0.05％-0.2％，氯化鈣0.0005％-0.001％，硫酸鎂0.5％-2.5％，蛋白胨1％-3％，酵母粉0.5％-1％，葡萄糖0.1％-0.5％，氯化鈉0.2％--0.8％其余為水。本發明還進一步在擴大培養參數方面對該方法進行了優化，適合于大規模生產抗菌肽且其制備得到的抗菌多肽純度高。
文檔編號C12P21/00GK102653779SQ201110052238
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月4日 優先權日2011年3月4日
發明者丘小慶, 張向利, 張小鳳, 李榮旗, 王東芹 申請人:北京科潤三聯生物技術有限責任公司