針對her-3的抗體及其用途的制作方法

專利名稱：針對her-3的抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及結合蛋白，包括結合于HER-3的抗體及其結合片段以及編碼它們的多核苷酸序列。本發明也提供了用于生產本發明結合蛋白的表達載體和包含該表達載體的宿主細胞。此外，本發明還提供了用于診斷和治療與HER-3介導的信號轉導和/或其配體調蛋白(heregulin)相關疾病的組合物和方法。
背景技術：
人類表皮生長因子受體3 (HER-3，也稱為ErbB!3)是一種受體蛋白酪氨酸激酶，屬于受體蛋白酪氨酸激酶的表皮生長因子受體(EGFR)亞家族，該家族還包括HER-1(也稱為 EGFR)、HER-2 和 HER-4 (Plowman 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 87 (1990)，4905-4909 ； Kraus 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 (1989)，9193-9197 ；以及 Kraus 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 (1993)，2900-2904)。與典型的表皮生長因子受體一樣，跨膜受體 HER-3由+胞外配體結合結構域(ECD)、ECD內的二聚體結構域、跨膜結構域，胞內蛋白酪氨酸激酶結構域(TKD)和C端磷酸化結構域組成。配體調蛋白(HRG)與HER-3的胞外結構域結合，并且通過促進其與其他人類表皮生長因子受體(HER)家族成員的二聚化，并且使HER-3的跨膜結構域磷酸化，從而激活受體介導的信號通路。HER家族成員間的二聚體放大了 HER-3的信號電位，它既是信號多樣化的方式也是信號放大的方式。例如，在HER家族成員中，HER-2/HER-3的異源二聚體誘導了最重要的促有絲分裂信號中的一個。HER-3已被發現在一些類型的癌癥如乳腺癌、胃腸癌和胰腺癌中過表達。有趣的是，已有研究表明HER-2/HER-3的表達和癌癥從非侵襲階段發展到侵襲階段有相關性 (Alimandi 等人的 Oncogene 10,1813-1821 ；deFazio 等人的 Cancer 87，487-498 ;Naidu 等人的Br. J. Cancer 78，1385-1390)。因此，干擾HER-3介導的信號轉導的制劑是令人期望的。已經報道了鼠源或嵌合型HER-3抗體，比如在專利US596851UUS5480968和W003013602 中。最近研究表明，一種針對HER-2的人源化單克隆抗體赫賽Hercept in ) ，干擾了 HER-2介導的信號轉導，對人類癌癥有治療效果(Fendly等人的Hybridoma 6， 359-370 ；Hudziak 等人的 MoI. Cell. Biol. 9，1165-1172 ；Stebbing 等人的 Cancer Treat. Rev. 26,287-290)。已表明赫賽打 可以通過兩種不同的機制起作用，也就是免疫系統的效應細胞的參與和直接的細胞毒及凋亡誘導作用。但是，只有那些高表達HER-2的患者對赫賽彡丁 的治療反應顯著，因此，限制了適合治療的患者數目。而且，耐藥性的發展或是腫瘤細胞中HER-2表達或其表位序列的改變可能會使那些有希望被治療的患者不能與抗體反應從而消除了其治療作用。因此，需要有更多的靶向治療藥物涉及HER家族的其它成員，如HER-3。附圖簡要說明

圖1表示了 HER-3在一系列人類癌細胞系中的表達程度，表明HER-3在多種人類癌癥均表達。圖2表示了 FACS分析HER-3抗體與穩定表達HER家族不同成員的Rati細胞或僅含有空載體的Rati細胞的結合情況。圖3表示的是抗體競爭bins定位于HER3結構域。圖4表示的是利用本發明的抗HER-3抗體進行間接的FACSkatchard抗體親和分析的結果。分析表明本發明的抗HER-3抗體對表達于細胞表面的HER-3具有高親和力和高
結合常數。圖5表示的是本發明的抗HER-3抗體加速了 HER-3的內吞作用。圖6a_e表示的是利用本發明的抗HER-3抗體進行的配體競爭分析的結果。這些結果表明，本發明的抗體特異地降低了 [1251]4-服6/[1251]-3-服6與表達內源冊1 -3的細胞的結合。圖7a表示的是利用本發明的抗HER-3抗體進行HER-3磷酸酪氨酸酶聯免疫吸附實驗(ELISA)的結果。本發明的抗體能夠抑制β-HRG介導的HER-3活化，表現為受體酪氨酸磷酸化程度增加。圖7b表示了利用滴定過的抗體進行本實驗的代表性結果。圖8表示的是利用本發明的抗HER-3抗體與p42/p44MAP激酶進行酶聯免疫吸附實驗的結果。本發明的抗體能夠降低β -HRG介導的ρ42/ρ44ΜΑΡ-激酶活化，表現為MAP-激酶磷酸化程度增加。圖9表示的是利用本發明的抗HER-3抗體與磷酸AKT進行酶聯免疫吸附實驗的結果。本發明的抗體能夠降低β-HRG介導的AKT活化，表現為AKT的磷酸化。圖10表示的是本發明的人抗HER-3抗體抑制了 MCF7細胞增值。本發明的抗體抑制了人類癌細胞中HRG誘導的細胞增值。圖11表示的是本發明的人抗HER-3抗體抑制了 MCF7細胞的轉移。圖lh-i表示的是本發明的人抗HER-3抗體抑制了非貼壁依賴性細胞的生長。圖13表示的是本發明的人抗HER-3抗體對T47D人類乳腺癌細胞的異種移植生長的抑制。圖14表示的是通過對小鼠施用抗Her3(Ul_59 and U1-53)或抗EGFR(愛必妥) 抗體，減少了小鼠中BxPC3人類胰腺癌細胞數量。圖15表示的是本發明的人類抗HER-3抗體以及與抗EGFR(愛必妥)的抗體的聯合，降低了人類胰腺癌細胞BxPC3的異種移植生長。圖16表明本發明的抗體延緩了黑色素瘤細胞(HT144)在nu/nu小鼠中的生長。圖17表示的是本發明的人類HER-3抗體(U1_53，U1_59 and U1-7)降低了人類結腸癌細胞HT-29的異種移植生長。圖18表示的是本發明的人類抗HER-3抗體(Ul-59，Ul-53 andUl-7)降低了人類肺癌細胞Calu-3的異種移植生長。圖19表示的是本發明的人類抗HER-3抗體(Ul-7，Ul-59 andUl-53)降低了人類胰腺癌細胞BxPC3的異種移植生長。
圖20表明本發明的抗體(U1-59)導致HER-3在BxPC3人類胰腺癌異種移植中受到抑制。發明_既述本發明的首要方面涉及一種結合于HER-3的分離的結合蛋白。在本發明的一個實施方案中，本發明的一種分離的結合蛋白包括重鏈氨基酸序列，其包含至少一個互補決定區(CDR)，該CDR選自以下序列組成的群組(a)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRHl ；(b)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的⑶RH2 ；以及(c)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRH3 ；和/或輕鏈氨基酸序列，其包含至少一個互補決定區(⑶R)，所述⑶R選自以下序列組成的群組(d)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRLl ；(e)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRL2 ；以及(f)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRL3。在本發明的另一個實施方案中，本發明的一種分離的結合蛋白包括重鏈氨基酸序列，其選自以下序列組成的群組SEQ ID Nos :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230 ；和/或
輕鏈氨基酸序列，其選自以下序列組成的群組SEQ ID Nos :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、 90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、 172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232。在本發明的另一個實施方案中，本發明分離的結合蛋白包括如下所示的重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列SEQ ID NOs :2和4、6和8、10和 12、14 和 16、18 和 20,22 和 24,26 和 28,30 和 32,36 和 38,42 和 44,46 和 48,50 和 52,54 和 56,60 和 58,62 和 64,66 和 68,70 和 72,74 和 76,78 和 82,80 和 82,84 和 86,88 和 90、 92 和 94,96 和 98,100 和 102,104 和 106,108 和 110、112 和 114、116 和 118、122 和 124,126 和 128、130 禾口 132、134 禾口 136，138 禾口 140、142 禾口 144、146 禾口 148、150 禾口 152、154 禾口 156、 158 和 160、162 和 164、166 和 168、170 和 172、174 和 176、178 和 180、182 和 184、186 和 188,190 和 192,194 和 196,198 和 200,202 和 204,206 和 208,210 和 212,214 和 216,218 和 220,222 和 224,226 和 228,230 和 232 ；或者SEQ ID NOs :34、40、60、62或120所示的重鏈氨基酸序列；或者SEQ ID NOs 58或64所示的輕鏈氨基酸序列。根據本發明，能與HER-3結合的分離的結合蛋白與HER-3胞外部分的至少一個表位相互作用。這些表位優選定位于Ll結構域(第19-184位氨基酸)、S1 (第185-327位氨基酸)和S2結構域(第500-632位氨基酸)或L2結構域(第3觀_499位氨基酸)，其中Ll 結構域是氨基端結構域，Sl和S2結構域是兩個富含半胱氨酸的結構域，L2位于兩個富含半胱氨酸的結構域的兩側。這些表位也可定位于這些結構域的組合區域，但并不限于Ll和 Sl部分組成的表位。更加優選的是這樣一種分離的結合蛋白，它能夠結合于成熟的HER-3、 特別成熟的人類HER-3蛋白的1-160，161-358，359-575，1-358和/或359-604位氨基酸殘基形成的三維結構。優選的，本發明的一種分離結合蛋白是一種支架蛋白，具有抗體樣的結合活性或是一種抗體，如抗HER-3的抗體。尤其是，抗HER-3的抗體選自下列抗體組成的群組Ul-I抗體、U1-2抗體、U1-3抗體、U1-4抗體、U1-5抗體、U1-6抗體、U1-7抗體、 U1-8 抗體、U1-9 抗體、U1-10 抗體、Ul-Il 抗體、U1-12 抗體、U1-13 抗體、U1-14 抗體、U1-15 抗體、U1-16抗體、U1-17抗體、U1-18抗體、U1-19抗體、U1-20抗體、U1-21抗體、U1-22抗體、U1-23抗體、U1-24抗體、U1-25抗體、U1-26抗體、U1-27抗體、U1-28抗體、U1-29抗體、 U1-30 抗體、U1-31 抗體、U1-32 抗體、U1-33 抗體、U1-34 抗體、U1-35 抗體、U1-36 抗體、U1-37 抗體、U1-38抗體、U1-39抗體、U1-40抗體、U1-41抗體、U1-42抗體、U1-43抗體、U1-44抗體、U1-45抗體、U1-46抗體、U1-47抗體、U1-48抗體、U1-49抗體、U1-50抗體、U1-51抗體、 U1-52 抗體、U1-53 抗體、Ul-55. 1 抗體、U1-55 抗體、Ul-57. 1 抗體、U1-57 抗體、U1-58 抗體、 U1-59抗體、Ul-61. 1抗體、U1-61抗體、U1-62抗體或者具有其中一種所述抗體的至少一條重鏈或輕鏈的抗體。特別優選的是U1-49抗體(SEQ IDNO :42/44)、U1_53抗體(SEQ ID NO M/56)和U1-59抗體(SEQ ID NO :70/7 抗體或是具有其中一種所述抗體的至少一條重鏈或輕鏈的抗體。此外，本發明的另外實施方案提供了偶聯上一個標記基團或是效應基團的分離的結合蛋白。優選的，這種結合蛋白對治療過增殖性疾病有用，特別是腫瘤疾病，例如乳腺癌、胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、涎腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、睪丸癌、軟組織肉瘤、頭頸部癌、其他表達或過表達HER-3的癌癥以及腫瘤轉移的形成。本發明的其他方面涉及編碼本發明結合蛋白的分離的核酸分子、含有編碼本發明結合蛋白的分離的核酸分子的載體和一種宿主細胞，例如用所述的核酸分子或載體轉化 CHO細胞和NS/0骨髓瘤細胞。本發明的另一方面涉及一種生產本發明結合蛋白的方法，該方法從分泌結合蛋白的宿主細胞來制備所述的結合蛋白。優選的，本發明的結合蛋白制備自分泌該結合蛋白的雜交瘤細胞株或是用編碼本發明結合蛋白的核酸分子轉化的CHO細胞或其他細胞類型。本發明的另一方面涉及一種生產本發明結合蛋白的方法，該方法從針對編碼本發明結合蛋白的一種或多種核酸分子的轉基因動物、轉基因植物或真菌的組織、產物或分泌物來制備所述的結合蛋白。優選的，本發明的結合蛋白制備自轉基因動物如奶牛、綿羊、兔、 雞或者其他哺乳動物或禽類的組織、產物或分泌物，轉基因植物如玉米、煙草或其他植物， 或者轉基因真菌如曲霉、畢赤酵母或其他真菌種類。本發明的另一方面涉及一種藥物組合物，其包括作為活性劑的本發明的至少一種結合蛋白與藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑混合成的一種活性劑。在本發明的另一個優選實施方案中，本發明的藥物組合物另外包括至少一種其他活性劑，例如至少一種抗腫瘤劑。本發明的其他方面還涉及本發明的至少一種結合蛋白，任選的至少一種其他活性劑，例如至少一種抗腫瘤劑與藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑混合在制備藥物組合物的種的用途。這種藥物組合物適用于診斷、預防或治療一種過增殖性疾病，特別是腫瘤疾病，如乳腺癌、胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、涎腺癌、肺癌、 腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、或其他表達或過表達 HER-3的癌癥以及腫瘤轉移形成。此外，本發明另一方面涉及診斷與HER-3表達相關的疾病或狀況的一種方法，其中包括將含有至少一種本發明的結合蛋白與樣品接觸，并檢測HER-3的存在。優選的疾病或狀況包括上面提及的過增殖性疾病。本發明的另一方面是在有需要的患者身上預防或治療與HER-3表達相關的疾病或狀態的一種方法，其中包括對患者施用有效量的本發明的至少一種結合蛋白，和任選的至少一種其他活性劑，例如至少一種抗腫瘤劑。優選的患者是哺乳動物患者，更優選的是人類患者。優選的HER-3表達相關的疾病或狀況是上面提及的過增殖性疾病。本發明的另一個方面涉及診斷、預防或治療與HER-3表達相關的疾病或狀況的一種試劑盒，其中包括至少一個本發明的結合蛋白和/或核酸分子和/或載體。任選的是， 本發明的試劑盒可進一步包含至少一種其他活性劑，例如至少一種抗腫瘤劑。優選的，與 HER-3表達相關的疾病或狀況是上面提及的過增殖性疾病。詳細說明本發明的首要方面涉及一種結合至HER-3的分離的結合蛋白。在本發明的一個實施方案中，本發明的分離的結合蛋白包括重鏈氨基酸序列，其包含至少一個互補決定區(CDR)，該CDR選自以下序列組成的群組
(a)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRHl ；(b)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRH2 ；以及(c)SEQ ID NOs :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRH3 ；和/或輕鏈氨基酸序列，其包含至少一個互補決定區(CDR)，該CDR選自以下序列組成的群組(d)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRLl ；(e)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRL2 ；以及(f)SEQ ID NOs :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、 86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、 168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRL3。在本發明的另一個實施方案中，本發明的分離的結合蛋白包括重鏈氨基酸序列，其選自以下序列組成的群組SEQ ID Nos :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、 74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230 ；和/或一條輕鏈氨基酸序列，選自以下序列組成的群組SEQ ID Nos :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、 90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、 172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232。在本發明的另一個實施方案中，本發明分離的結合蛋白包括如下所示的重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列SEQ ID NOs :2 和 4、6 和 8、10 和 12、14 和 16、18 和 20、22 和 24J6 和 28、30 和 32、36 和 38,42 和 44,46 和 48,50 和 52,54 和 56,60 和 58,62 和 64,66 和 68,70 和 72,74 和 76,78 和 82,80 和 82,84 和 86,88 和 90,92 和 94,96 和 98、100 和 102、104 和 106、108 和 110、112 和 114、116 和 118、122 和 124、126 和 128、130 和 132、134 和 136，138 和 140、142 和 144、146 和 148、150 和 152、154 和 156、158 和 160、162 和 164、166 和 168、170 和 172、174 和 176、178 和 180、182 和 184、186 和 188、190 和 192、194 和 196、198 和 200,202 和 204、 206 和 208,210 和 212,214 和 216,218 和 220,222 和 224,226 和 228,230 和 232 ；或者SEQ ID NOs :34、40、60、62或120所示的重鏈氨基酸序列；或者SEQ ID NOs 58或64所示的輕鏈氨基酸序列。根據本發明，應當理解的是本發明的結合蛋白的氨基酸并不僅限于20種常見氨基酸(見 Immunology-Α Synthesis (第二版，E. S. Golub 禾口 D. R. Gren, Eds. , Sinauer Associates, Sunderland,Mass. (1991))，其通過引用被納入本文)。例如，氨基酸分子可能包括20種常規氨基酸的立體異構體(如D-型氨基酸)、非天然氨基酸如α _，α -雙取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸以及其他非常見氨基酸。非常見氨基酸也可作為本發明結合蛋白的合適組分，其實例包括4-羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、 ε -N-乙酰基賴氨酸、0-磷酸絲氨酸、N-乙酰基絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、 5-羥基賴氨酸、σ -N-甲基精氨酸和其他類似氨基酸基亞氨基酸，如4-羥基脯氨酸。此外，根據本發明，如果變異維持在SEQ ID NOs :1_232所示的氨基酸序列中的至少75%，較優選為至少80%、90%、95%，最優選為99%，那么SEQ ID NOs 1-232所示的氨基酸序列中的少量變異預期也包含在本發明中。這些變異可能發生在框架區(也就是在互補決定區外)、互補決定區內、或者同時在框架區和互補決定區內。SEQ IDNOs :1-232所示的氨基酸序列中的優選變異，也就是刪除、插入和/或替代至少一個氨基酸，發生在靠近功能結構域的邊界。結構和功能結構域可以通過核酸和/或氨基酸數據與公共或專有序列數據庫比對來鑒定。計算機比對方法可以用來判別序列基序或預測出現在其他已知結構和 /或功能的結合蛋白的蛋白構象結構域。判別折疊成已知三維結構的蛋白序列的方法是已知的。參考 Bowie 等人的 Science 253,164 (1991) ^Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed. , W. H. Freeman 禾口 Company, New York (1984))、Introduction to Protein Structure (C. Branden 禾口 J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))、和Thornton等人的Nature 354，105 (1991)，其通過引用被納入本文。因此， 根據本發明，本領域技術人員能夠識別序列基序和結構構象，它們可能用于定義結構和功能結構域。SEQ ID NOs :1_174和1-232所示的氨基酸序列中特別優選的變異是那些能夠導致結合蛋白降低對蛋白水解或氧化敏感性、改變糖基化形式或者改變結合親和力或者賦予或修飾其他物化或功能特性。尤其是，保守氨基酸的替代也是預期的。保守的替代是發生在與側鏈相關的氨基酸的家族內。優選的氨基酸家族如下酸性家族=天冬氨酸、谷氨酸； 堿性家族=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；非極性家族=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及無電荷極性氨基酸家族=甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。較優選的氨基酸家族是脂肪羥基家族=絲氨酸和蘇氨酸；含酰胺家族=天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族家族=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；以及芳香族氨基酸=苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，可以合理的預測，亮氨酸用異亮氨酸或纈氨酸、冬氨酸用谷氨酸、蘇氨酸用絲氨酸的單獨的替代；或者一種氨基酸用一種結構相關的氨基酸的相似的替代不會對結合蛋白的結合或特性產生主要影響，特別是當替代不包括框架區位點的氨基酸。但是，所有其他所有可能的氨基酸替代也預期屬于本發明。一種氨基酸的改變是否產生一種有功能的結合蛋白，也就是說，產生的結合蛋白能夠與 HER-3結合并降低HER家族成員的信號轉導，可以很容易用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)或 FACS分析產生的蛋白結合HER-3的特異活性或者體內或體外功能分析來確定。根據本發明，本發明的結合蛋白至少與HER-3胞外部分的至少一個表位相互作用。這些表位優選定位于Ll結構域(第19-184位氨基酸)，Sl (第185-327位氨基酸)和 S2結構域(第500-632位氨基酸)或L2結構域(第3觀_499位氨基酸)，或位于HER-3結構域的組合，其中Ll結構域是氨基端結構域，Sl和S2結構域是兩個富含半胱氨酸的結構域，它們位于L2結構域的兩側。這些表位也可定位于這些結構域的組合區域，但并不限于 Ll和Sl部分組成的表位。此外，本發明的結合蛋白的進一步特征是其能結合于HER-3并降低了 HER-3介導的信號轉導。根據本發明，HER-3介導的信號轉導的降低可能，例如會由于 HER-3的下調所致，從而導致至少HER-3分子從細胞表面的部分消失；或者由于HER-3基本上以一種非活性形式穩定在細胞表面，也就是與非穩定形式相比表現出較低信號轉導的一種形式。或者，HER-3介導的信號轉導的降低可能也是由于影響(例如降低或者抑制)了配體或HER家族的另一成員與HER-3的結合以及GRB2與HER-2或SHC的結合，其通過抑制受體酪氨酸磷酸化、AKT磷酸化、Ρ (2酪氨酸磷酸化或ERK2磷酸化，或者通過降低腫瘤的侵襲性來實現。或者，HER-3介導的信號轉導的降低可能也是由于影響(例如降低或者抑制) 了 HER-3與其他HER家族成員形成二聚體。其他實施例中的一個實施例可以是降低或抑制了 HER-3-EGFR蛋白復合物的形成。優選的，本發明的結合蛋白是一種支架蛋白，具有抗體樣結合活性或是一種抗體， 也就是抗HER-3的抗體。本發明文本中所使用的術語“支架蛋白”是指含有暴露的表面區域的一條多肽鏈或蛋白，其對氨基端插入、替代或缺失高度耐受。根據本發明可以使用的支架蛋白的實例是金黃色葡萄球菌的A蛋白、大菜粉蝶的膽素結合蛋白、或者其他lipocalins、錨蛋白重復蛋白及人纖連蛋白(見綜述Binz and Pluckthun, Curr Opin Biotechnol，16，459-69)。支架蛋白的工程化可視為移植或整合親和功能到穩定折疊蛋白的結構框架表面或內部。根據本發明，親和功能是指蛋白結合親和力。支架可以結構上獨立于賦予結合特性的氨基酸序列。一般說來，顯現出適合發展這種人工親和試劑的蛋白可通過合理的、或最常見的、組合蛋白工程技術如針對HER-3篩選，采用純化的蛋白或展示在細胞表面的蛋白，作為結合試劑用于人工支架庫體外展示，這些技術是本領域熟知的(Skerra，J. Mol. Recog.，2000 ；Binz and Plilckthim，2005)。此外，具有抗體一樣結合活性的支架蛋白可以來源于含有該支架結構域的受體多肽，其可以用受體多肽的結合結構域移植并賦予包含這種支架結構域的受體多肽具有供體多肽的結合特性。所述的插入結合域可以是，例如，抗體的互補決定區(CDR)， 特別是抗HER-3抗體的CDR。插入可以是通過各種本領域抑制的方法實現，例如，多肽合成、 編碼氨基酸的核酸合成以及通過本領域技術人員熟知的各種重組方法。此外，本文中所使用術語“抗體”或“抗HER-3抗體”指一種單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、人源化抗體(Jones等人，Nature321 (1986)，522-525 ；Riechmann等人，Nature 332 (1988)，323-329 ；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992)，593-596)、嵌合抗體(Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 81 (1984)，6851-6855)、由至少兩個抗體組成的多特異抗體(例如雙特異抗體)或其抗體片段。術語“抗體片段”包括上述提及的抗體的任意部分，優選的是它們的抗原結合或可變區。抗體片段的范例包括Fab 片段、Fab'片段、F(ab' )2 片段、Fv 片段、雙抗體(Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 (1993)，6444-6448)、單鏈抗體分子(PlUckthun in :The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS,Springer Verlag, N. Y. (1994), 269-315)和其他片段，只要表現出所需的結合HER-3能力。此外，本文中所使用術語“抗體”或“抗HER-3抗體”可以包含抗體樣分子包括工程化抗體亞結構域或天然發生的抗體變異體。這些抗體樣分子可以是單結構域抗體如單一的 VH或VL結構域，其或者是天然來源如camel ids (Muyldermans等人，Reviews in Molecular Biotechnology 74，277-302)，或者通過人類、camelids或其他物種體外展示庫獲得(Holt 等人，Trends Biotechnol.，21，484-90)。根據本發明，“Fv片段”是包含完整的抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。 這一區域由一條重鏈或輕鏈通過緊密的非共價結合形成的二聚體組成。正是在這種構造中每個可變區的三個互補決定區相互作用確定了二聚體的表面抗原結合位點。總的說來，這六個互補決定區賦予了抗體的抗原結合特性。但是，即使單獨一個可變結構域(或者包含僅三個抗原特異的互補決定區的半個Fv片段)也具有識別和結合抗原的能力，盡管通常親和力要比完整結合位點低。“Fab片段”也包括輕鏈的恒定區和重鏈的第一恒定區 (CHl)。“Fab片段”不同于與“Fab'片段”，其在重鏈CHl結構域的羧基端添加了一些殘基， 包括來源于抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。“F(ab' )2”最初產生于一對“Fab'片段”， 其中間含有鉸鏈半胱氨酸。制備這些抗體片段的方法如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，都是本領域技術人員所熟知的。在本發明的一個優選實施方案中，本發明的抗HER-3抗體是IgA-、IgD-, IgE-, IgG-或IgM-類型，優選的是IgG-或IgM-類型，包括(但不限于)IgGl-、IgG2_、IgG3_、 IgG4-、IgMl-和IgM2類型。在最優選實施例中，抗體是IgGl-、IgG2_、或IgG4_類型。在本發明的另一個優選實施方案中，本發明抗HER-3的抗體是針對HER-3胞外結構域(EOT)產生的抗HER-3抗體。在某些方面，例如與作為治療候選物的抗HER-3抗體的產生有關，理想的是本發明的抗HER-3抗體能夠固定補體并參與補體依賴的細胞毒作用(CDC)。許多抗體同種型能夠相同，包括(但不限于)下列鼠IgM,鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgM、人IgGl、人lgG3 和人IgA。應當了解，產生的抗體最初不需要具有這種同種型，相反，產生的抗體可以具有任意同種型，這種抗體可以是轉變的同種型，其通過在合適的表達載體中，用本領域熟悉的傳統生物學技術，將分子克隆的V區域基因或cDNA附加到分子克隆的恒定區基因或cDNA分子中，然后通過本領域熟知的技術在宿主細胞中表達該抗體。這種同種型轉變的抗體也可具有Fc區域，其已經通過分子工程來實現具有比自然發生的變異體更好的補體依賴的細胞毒作用(Idusogie等，JImmunol.，166，2571-2575)，并可通過本領域熟知的技術在宿主細胞中重組表達。這些技術包括直接重組技術的使用(見美國專利No. 4，816，397)、細胞融合技術(見美國專利No s. 5，916，771和6，207，418)等等。在細胞融合技術中，制備了具有任何想要的同種型重鏈的骨髓瘤或其他細胞株如CH0，制備了具有的輕鏈的其他骨髓瘤細胞或其他細胞株例如CH0。這些細胞然后可以被融合，表達完整抗體細胞株就可以被分離到。作為一個例子，一種人抗-HER-3 IgG4抗體，具有想要的結合于HER-3抗原的能力，可以通過簡單的同種型轉變來產生人IgM、人IgGl或IgG3同種型，同時仍具有相同的可變區 (其定義了抗體的特異性和一些親和性)。這樣的分子然后可能能夠固定補體和參與補體依賴的細胞毒。此外，也比較理想的是，本發明的抗HER-3抗體能夠結合于效應細胞(如單核細胞和自然殺傷細胞(NK))的Fc受體，并參與抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)。有許多抗體的同種型能夠有同樣的功能，包括(但不限于)下列鼠源IgGh、鼠源IgG2b、鼠源IgG3、 人IgGl和人IgG3。應當了解的是，產生的抗體最初不需要具有這種同種型，相反，產生的抗體可以具有任意同種型，這種抗體可以是轉變的同種型，其通過在合適的表達載體中，用本領域熟悉的傳統生物學技術，將分子克隆的V區域基因或cDNA附加到分子克隆的恒定區基因或cDNA分子中，然后通過本領域熟知的技術在宿主細胞中表達該抗體來實現。這種同種型轉變的抗體也可具有Fc區域，其已經通過分子工程使具有比自然發生的變異體更好的抗體依賴的細胞毒作用(Shields等人，J Biol Chem.，276，6591-6604)，并可通過本領域熟知的技術在宿主細胞中重組表達。這些技術包括直接重組技術的使用(見美國專利 No. 4，816，397)、細胞融合技術(見美國專利No s. 5，916，771和6，207，418)等等。在細胞融合技術中，制備了具有任何想要的同種型重鏈的骨髓瘤或其他細胞株如CH0，制備了具有的輕鏈的其他骨髓瘤細胞或其他細胞株例如CH0。這些細胞然后可以被融合，表達完整抗體細胞株就可以被分離到。作為一個例子，一種人抗-HER-3 IgG4抗體，具有想要的結合于 HER-3抗原的能力，其可以通過簡單的同種型轉變來產生人IgGl或IgG3同種型，同時仍具有相同的可變區(其定義了抗體的特異性和一些親和性)。這樣的分子然后可能能夠與效應細胞的Fc γ R結合并能夠參與抗體依賴的細胞毒作用。此外，根據本發明，應當了解的是，本發明的抗HER-3抗體是一種全人或人源化抗體。人類抗體避免了異種抗體(例如，具有鼠源或大鼠來源的可變區和/或恒定區的抗體) 引起的某些問題。異種來源的蛋白如鼠源或大鼠來源的蛋白可導致患者針對抗體產生免疫應答，接著通過抗體中和以及/或嚴重的、甚至威脅生命的變態反應，導致抗體的快速清除、失去治療效果。優選的，本發明的抗HER-3抗體選自以下抗體組成的群組Ul-I抗體、U1-2抗體、U1-3抗體、U1-4抗體、U1-5抗體、U1-6抗體、U1-7抗體、 U1-8 抗體、U1-9 抗體、U1-10 抗體、Ul-Il 抗體、U1-12 抗體、U1-13 抗體、U1-14 抗體、U1-15 抗體、U1-16抗體、U1-17抗體、U1-18抗體、U1-19抗體、U1-20抗體、U1-21抗體、U1-22抗體、U1-23抗體、U1-24抗體、U1-25抗體、U1-26抗體、U1-27抗體、U1-28抗體、U1-29抗體、 U1-30 抗體、U1-31 抗體、U1-32 抗體、U1-33 抗體、U1-34 抗體、U1-35 抗體、U1-36 抗體、U1-37 抗體、U1-38抗體、U1-39抗體、U1-40抗體、U1-41抗體、U1-42抗體、U1-43抗體、U1-44抗體、U1-45抗體、U1-46抗體、U1-47抗體、U1-48抗體、U1-49抗體、U1-50抗體、U1-51抗體、 U1-52 抗體、U1-53 抗體、Ul-55. 1 抗體、U1-55 抗體、Ul-57. 1 抗體、U1-57 抗體、U1-58 抗體、 U1-59 抗體、Ul-61. 1 抗體、U1-61 抗體、U1-62 抗體。在本發明的一個優選實施方案中，本發明的結合蛋白偶聯上了一個標記基團。這種結合蛋白特別適合于診斷應用。本文中所使用的術語“標記基團”是指一種可檢測的標記，例如放射性標記的氨基酸或生物素化部分，其可以通過標記的抗生物素蛋白來檢測 (例如結合上熒光標記的鏈霉親和素或可使用光學或比色方法來檢測的酶活性)。用來標記多肽或糖蛋白如抗體的本領域技術人員熟知的各種方法，可以用于完成本發明。適合的標記基團的實例包括(但不限于)下列放射性同位素或放射性核素(如M、14C、15N，、35S、 9°Y、99TC、mIn、125I、mI)、熒光基團(例如FITC、羅丹明、鑭系無機發光材料)、酶基團(例如辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶、熒光酶、堿性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團、 或者可由第二報告體識別的預定多肽表位(例如亮氨酸拉鏈型配對序列、第二抗體的結合位置、金屬結合結構域、表位標簽)。在某些實施方案中，可能想到的是，標記基團是利用不同長度的間隔臂連接的，以降低潛在的空間位阻。可選的，在本發明的另一個優選方案中，本發明的結合蛋白可以偶聯到一個效應基團上。這種結合蛋白特別適合于治療應用。本文中所使用的術語“效應基團”系指細胞毒基團如放射性同位素或放射性核素、毒素、治療基團或本領域熟知的其他效應基團。合適的效應基團的實例是放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N，、35S、9°Y、99TC、mIn、125I、mI)、 加里剎霉素、海兔毒素類似物如auristatins、以及化療試劑如geldanamycin和美登素衍生物，包括DM1。在某些實施方案中，可能想到的是，效應基團是利用不同長度的間隔臂連接的，以降低潛在的空間位阻。本發明的一個次要方面涉及制備本發明分離的結合蛋白的過程，包括從分泌本結合蛋白的宿主細胞中制備本結合蛋白的步驟。根據本發明，可使用的宿主細胞是雜交瘤細胞；真核細胞如哺乳動物細胞，例如倉鼠、兔、大鼠、豬、小鼠或其他動物細胞；植物細胞； 真菌細胞，例如釀酒酵母、畢赤酵母；原核細胞如大腸桿菌；或者本領域熟知的其他細胞， 用來生產結合蛋白。從宿主細胞中用于制備和分離結合蛋白(如支架蛋白或者抗體)的各種方法是本領域熟知的，可用來實施本發明。此外，用于制備結合蛋白片段(如支架蛋白片段或抗體片段)的方法，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化、現代克隆技術、單鏈抗體
( Pluckthun :The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore,EDS,Springer Verlag,N. Y. (1994)，269-315)和雙抗體(Hoilinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (1993)，6444-6448)，這些方法是本領域技術人員熟知的，可用來實施本發明。在本發明的一個優選實施方案中，本發明的結合蛋白制備于分泌該結合蛋白的雜交瘤細胞。見 Kdhler 等人的 Nature 256 (1975), 495.在本發明的一個較優選的實施方案中，本發明的結合蛋白通過重組制備，其中在宿主細胞中優化或/和放大表達結合蛋白、并從所述的細胞中分離該結合蛋白。為了這個目的，在合適的條件下宿主細胞用編碼結合蛋白的DNA或含有編碼結合蛋白DNA的載體轉化或轉染，以產生本發明的結合蛋白。參見如美國專利No. 4，816，567。優選的宿主細胞可以是CHO細胞、NS/0雜交瘤細胞、人胚腎293細胞、大腸桿菌和釀酒酵母。關于那些是抗體的結合蛋白，這些抗體可以從遺傳工程化的動物產生全人抗體或者從噬菌體、酵母、核糖體或大腸桿菌抗體展示庫中制備。參見例如=Clacks0n等人， Nature 352 (1991)，624-628，Marks 等人，J. Mol. Biol. 222 (1991)，581-597，Feldhaus and Siegel J Immunol Methods. 290,69-80, Groves and Osbourn, Expert Opin Biol Ther.,
145,125-135 and Jostock and Dubel, Comb Chem High Throughput Screen.8，127—133。人類抗體避免和具有鼠源或大鼠可變和/或恒定區的抗體相關的問題。存在這些鼠源或大鼠來源的蛋白會導致這些抗體被患者快速清除或導致患者針對這種抗體產生免疫反應。為了避免使用鼠源或大鼠來源的抗體，全人抗體可經由導入有功能的人類抗體座位到嚙齒類動物、其他哺乳動物或動物產生，以使該嚙齒類動物、其他哺乳動物或動物產生全人抗體。產生完整人類抗體的方法是通過使用XEN0M0USE 株小鼠，其已被工程化含有人類重鏈座位和K -輕鏈座位的2451Λ和1901Λ大小的種系構型片段。其他XenoMouse 株小鼠含有人類重鏈座位和κ-輕鏈座位的9801Λ和8001Λ大小的種系構型片段。還有其他XenoMouse株小鼠含有人類重鏈座位和κ -輕鏈座位的9801Λ和8001Λ大小的種系構型片段加上7401Λ大小種系構型的完整的人類λ -輕鏈座位。見Mendez等人的Nature Genetics 15:146-156(1997)和 Green 和 Jakobovits J. Exp. Med. 188 :483-495(1998)。 XENOMOUSE 株小鼠可從 Abgenix，Inc. (Fremont, CA)獲得。XENOMOUSE 小鼠的生產深入討論和說明于下列美國專利申請序列號 07/466，008，申請于 1990 年 1 月 12 日、07/610，515，申請于 1990 年 11 月 8 日、07/919，297， 申請于1992年7月24日、07/922，649，申請于1992年7月30日、08/031，801，申請于1993 年3月15日、08/112，848，申請于1993年8月27日、08/234，145，申請于1994年4月28日、 08/376，279，申請于 1995 年 1 月 20 日,08/430, 938，申請于 1995 年 4 月 27 日,08/464, 584， 申請于1995年6月5日、08/464，582，申請于1995年6月5日、08/463，191，申請于1995 年6月5日、08/462，837，申請于1995年6月5日、08/486，853，申請于1995年6月5日、 08/486，857，申請于 1995 年 6 月 5 日、08/486，859，申請于 1995 年 6 月 5 日、08/462，513， 申請于1995年6月5日、08/724，752，申請于1996年10月2日、和08/759,620，申請于 1996年12月3日；美國專利
發明者B·拉丁斯基, D·弗里曼, E·伯吉斯, M·特里德, M·羅瑟, S·哈特曼 申請人:U3制藥有限公司, 安進公司