一種重組人凝血酶在動物細胞內的高效表達和生產方法

專利名稱：一種重組人凝血酶在動物細胞內的高效表達和生產方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。具體地涉及一種重組人凝血酶在動物細胞內的高效表達和生產方法。
背景技術：
凝血酶是機體凝血系統中的關鍵酶，生成于損傷處血管內皮細胞，參與凝血過程各個反應環節。凝血酶是由凝血酶原活化變成的一種專一性很強的絲氨酸蛋白類水解酶，由308個氨基酸殘基組成，分子質量為36KD。凝血酶是一種雙鏈分子含有A鏈和B鏈，兩鏈間由二硫鍵連接。其中A鏈含49個氨基酸殘基，又稱輕鏈；B鏈由259個氨基酸殘基組成，又稱重鏈(Raimondo De Cristofaro et al. A natural prothrombin mutant revealsan unexpected influence of the A-chain’ s structure on the activity of human a -thrombin. J Biol Chem. 2004，279(13) : 13035- 13043·)。在人體凝血反應過程中，凝血酶直接作用于纖維蛋白原使其轉化為纖維狀的不溶性纖維蛋白，網住外滲的血細胞,最終形成血液凝塊而完成止血過程。由于凝血酶所具有的止血快、無副作用的優點，在臨床上應用廣泛，常以干粉或溶液局部涂于傷口及手術處，控制毛細血管血液滲出。近年來其應用范圍正日漸擴大，由單純的局部外敷發展到外科手術、耳鼻喉、口腔、婦產、泌尿及消化道等部位出血止血，亦可作為多種外用止血藥物的重要原料。傳統的工業生產凝血酶的技術已趨成熟，主要是從動物血漿中及人血漿中制備凝血酶原，再經激活物激活而成為凝血酶。但是，這種生產工藝受到血液資源的限制，隨著市場需求的增大，已經遠遠不能滿足需求。由于血漿中往往含有大量的病原體和病毒,如牛海綿狀腦炎物質、人肝炎病毒和人類免疫缺陷性病毒等，難免會在終產品中產生殘留，增加患者感染的幾率。不僅如此，產自動物的凝血酶會引起抗體的產生，這些抗體可與人血液發生交叉反應，且往往誘導嚴重的出血并發癥。隨著基因工程技術的成熟和發展，利用重組方法大量生產的凝血酶已經成為可能，并且能夠克服傳統工業生產凝血酶的缺點，具有純度高、防污染、可量產等優點。有研究表明，采用原核細胞如大腸桿菌作為表達載體,產生的凝血酶往往形成不可溶的包涵體，很難復性和純化，收率低(K. Soejima, N et al. An efficient refolding method forthe preparation of recombinant human prethrombin-2 and characterization of therecombinant derived alpha-thrombin. J Biol Chemj 200，I 0(2): 269-277·)。更重要的是原核生物不能對蛋白質進行如糖基化、羧基化等的翻譯后修飾，而凝血酶活性的發揮恰恰需要這些修飾作用。由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，直接被分泌到胞外，不存在形成包涵體的問題，而且在活性方面遠勝于原核表達系統及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統，更接近于天然蛋白質。在很多工業生產中，細胞培養過程中不添加動物源性的營養物質，所有成分都已知、可控，避免了病原體或者病毒的殘留。高密度培養工藝是重組蛋白和單克隆抗體等生物技術產品規模化工業生產中的主流工藝技術，具有高細胞密度，高產量，聞效率，廣品質量可控，和容易實現工藝放大等優點。美國FDA于2008年I月批準了 Zymogenetics公司的重組人凝血酶Recothrom上市，Recothrom是第一個被批準上市的無血衆的重組凝血酶，由帶有凝血酶表達載體的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞大規模培養后分泌至培養基中，經過高度純化制成，后者是通過基因修飾用來生產人凝血酶的細胞系。這些細胞不帶有任何已知的病原體，并且產品經過了病毒滅活的程序。基于一項411例病人參加的III期臨床研究結果表明，該產品與牛凝血酶有同等的功效，卻顯著減少抗體產生幾率(Chapman WC et al. A phase
3,randomized, double-blind comparative study of the efficacy and safety oftopical recombinant human thrombin and bovine thrombin in surgical hemostasis.J Am Coll Surg, 2007，205(2) : 256-265·)。
然而，采用CHO細胞進行表達時，其表達效率較低，導致生產成本上升等不利因素。因此，本領域迫切需要開發新的、高效表達和制備重組凝血酶的方法。

發明內容
本發明的一個目的是為了克服重組人凝血酶在動物細胞中表達較低、生產成本高，或動物或人血漿來源的凝血酶可能含有病原污染等弱點，提供一種能提高人凝血酶在動物細胞中表達水平的表達載體和方法。本發明的另一個目的是提供上述在動物細胞中所表達的重組人前凝血酶激活和純化的方法，從而獲得可用于臨床治療的人凝血酶。
在本發明的第一方面，提供了一種融合蛋白，所述的融合蛋白是人蛋白C的信號肽序列與缺失Gla結構域的人凝血酶形成的融合蛋白。在另一優選例中，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。在本發明的第二方面，提供了一種編碼本發明第一方面中所述的融合蛋白的多核苷酸。在另一優選例中，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID N0:5所不。在另一優選例中，所述的多核苷酸的序列是與SEQ ID N0:5簡并的序列或同源性彡80% (較佳地90%，更佳地95%)的同源序列。在本發明的第三方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發明第二方面所述的多核苷酸。在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞攜帶本發明第三方面表達載體，或者所述宿主細胞的染色體或基因組中整合有本發明第二方面中所述的多核苷酸，或者是為所述表達載體或所述多核苷酸所轉化的宿主細胞。在另一優選例中，所述的宿主細胞是中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)。在本發明的第五方面，提供了一種制備人凝血酶的方法，包括步驟
培養本發明第四方面所述的宿主細胞，從而表達所述的融合蛋白，并分泌形成人前凝血酶-2 ；分離或純化出所述的分泌的人前凝血酶-2 ;和
對上一步驟中獲得的人前凝血酶-2進行激活處理，從而形成人凝血酶。在另一優選例中，所述的激活是用伊卡因(ecarin)蛋白進行激活。在另一優選例中，在分離或純化步驟中包括將人前凝血酶-2經過陰離子柱和疏水柱進行純化后，再用重組ecarin蛋白激活。在另一優選例中，還包括對于激活后的重組人凝血酶，通過親和純化和凝膠過濾層析進行純化。在另一優選例中，所述的親和柱是Blue Sepharose 6 Fast Flow柱。在本發明的第六方面，提供了本發明第一方面所述的融合蛋白或第二方面中所述的編碼融合蛋白的多核苷酸的用途，它們被用于制備人凝血酶。在本發明的第七方面，提供了一種表達和生產重組人凝血酶的序列和方法，包括步驟
①將含有人蛋白C的信號肽序列與Gla結構域缺失的人凝血酶基因融合，形成表達融合蛋白(人蛋白C-凝血酶2融合蛋白，pc-PT2)的編碼基因；
②將上述編碼基因插入包含有效的啟動子(CMVpromotor)、牛生長因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)、雞 beta-肌動蛋白啟動子、DHFR 基因、SV40polyA信號序列的表達載體pGN的多克隆位點,形成重組的表達載體；
③將重組表達載體轉染動物細胞，并選出表達所述融合蛋白的宿主細胞；
④培養上一步驟中獲得的宿主細胞，從而表達人前凝血酶-2;和
⑤分離純化所述的人前凝血酶-2;和
⑥激活人前凝血酶_2，從而獲得人凝血酶。在另一優選例中，所述方法包括經過陰離子柱和疏水柱純化后，采用純化的重組ecarin激活，再經親和純化和凝膠過濾層析后，高產率地獲得高比活性的重組人凝血酶。在另一優選例中，在步驟③中，所述的細胞是dhfr基因缺陷的中國倉鼠卵巢細胞(CHO-dhfr-)，并且通過MTX加壓選出表達融合蛋白的宿主細胞，所述宿主細胞可高表達編碼蛋白質(人前凝血酶_2)。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了 pc-PT2和th_PT2電泳圖譜。其中，各泳道如下1，2分別為pc_PT2和th-PT2 PCR電泳結果，3為分子量標準。圖2顯示了 pGN/pc_PT2和pGN/th_PT2質粒酶切電泳圖譜。其中，各泳道如下1，2分別為pGN/pc-PT2和pGN/th-PT2酶切電泳結果，3為分子量標準。圖3 顯示了 pGN/pc_PT2 和 pGN/th_PT2 質粒構建圖譜。其中，“pUC19 backbone”表示pUC19骨架；“promoter”表示啟動子。圖4顯示了不同篩選壓力下兩種前凝血酶表達細胞株表達情況比較。圖5顯示了 SDS-PAGE電泳檢測5 L細胞反應器培養上清中重組人前凝血酶2隨時間變化的累積量。其中，各泳道如下1.培養5天上清；2.培養6天上清；3.培養7天上清；4.培養8天上清；5.培養9天上清；6.培養10天上清；7.培養11天上清；8.培養12天上清；9.對照品。圖6顯示了 ELISA檢測5 L細胞反應器培養上清中重組人前凝血酶2隨時間變化
的累積量。圖7顯示了 pGN/ecarin的質粒圖譜。圖8顯示了 dot-blot檢測900 nM ecarin蛋白的表達。+為陽性對照品(300ng)，-為陰性對照(Excell-302培養基)。圖9顯示了 ecarin的中試電泳圖。其中，各泳道如下2_9分別為伊卡因生物反應器生產第1、7、8到13天樣品。
圖10顯示了伊卡因的純化結果。其中，泳道I為分子量標準，泳道2為Ecarin。圖11顯示了重組人前凝血酶-2活化圖譜。各泳道如下1，2分別為活化前和活化后的人前凝血酶-2; 3為分子量標準。圖12顯示了凝血酶的活性檢測-酶切含有凝血酶酶切位點的目的蛋白。各泳道如下1為使用牛凝血酶，2為使用與牛凝血酶相同活性單位的ecarin活化重組人凝血酶(其活性單位由實例13中檢測方法確定)。3為未酶切前的目標蛋白，該蛋白含有凝血酶識別位點。圖13顯示了純化終產品SDS-PAGE圖譜。各泳道如下1.凝血酶(還原型，5微克)；2.分子量標準；3.凝血酶(非還原型，5微克)。圖14顯示了 SEC-HPLC檢測凝血酶純化、激活終產品純度大于95%。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，本發明采用基因工程技術，將人蛋白C信號肽與prethrombin-2嵌合基因在pGN高效表達載體系統和CHO細胞中，其表達水平顯著提高了約3倍。此外，還采用優化的生產純化和激活工藝，提高了重組人凝血酶最終得率。在此基礎上完成了本發明。本發明方法制備的重組人凝血酶可成為用于臨床治療，成為安全有效的藥品。此外，本發明還提供了被該表達載體轉化的動物細胞；提供了一種利用該轉化后所產生的表達重組人凝血酶的細胞株；以及提供了生產、活化和純化人凝血酶的工藝。
在本發明中，編碼重組人凝血酶的融合基因以及其他元件(如啟動子、標記基因、polyA序列、間隔序列)的核苷酸全長序列通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。以融合基因為例，對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列片段。然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、酵母質粒、植物細胞病毒、或其他載體。只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。通常，將獲得的用于構成本發明表達盒的各元件，按正確的順序連接在一起，就可形成本發明的表達盒。然后，將本發明的表達盒插入常規的或市售的表達載體，即可形成本發明的表達載體。本發明的適合在動物細胞中高效表達人重組人凝血酶的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞宜為動物細胞等。優選的宿主細胞是腎細胞、CH0，更佳地，宿主細胞是CHO細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下 進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。哺乳動物細胞系的合適培養液和培養方法是本領域熟知的，例如可見US5, 633, 162中的描述。用于實驗室燒瓶培養或低密度細胞培養可滿足特定類型細胞需要的標準細胞培養液的例子包括但不限于Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培養液(Morre, G, The journal of the American Medical Association, 199:519，1967)、L-15 培養液(Leibovitz, A 等,Amer. J. of Hygiene, 78:173, 1963) >Dulbecco 改良 Eagle 培養液、Eagle 最簡單基礎培養液(Eagle，s minimal essential medium, MEM)、Ham F12 培養液(Ham, R等，Proc. Natl. Acad. Sc. 53:288, 1965)或缺少白蛋白、運鐵蛋白和卵磷脂的Iscoves 改良 DMEM(Iscoves 等，J. Exp. med. 1:923, 1978)。例如，Ham FlO 或Fl2 培養液是專門為CHO細胞培養設計的。特別適合于CHO細胞培養的其它培養液見EP-481 791中所述。已知此類培養液中可增添胎牛血清(FBS，也稱為胎小牛血清FCS)，后者提供了天然來源的豐富激素和生長因子。目前哺乳動物細胞的培養是常規操作，在科學教科書和手冊中有全面的描述，細節可參見R. Ian Fresney,《動物細胞的培養》(Culture of Animal cells),手冊，第 4 版，ffiley-Liss/N. Y.，2000。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
口 ο本發明的主要優點包括本發明的融合基因可高效地在動物細胞中表達重組人前凝血酶，用于構建和獲得高表達重組人凝血酶的動物細胞株。另外，通過優化的純化工藝，可以獲得高比活的人凝血酶。所獲得的活化凝血酶具有與商業產平同等或更高的生物活性，因此，可用于多種臨床疾病的治療。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I :人前凝血酶-2基因的制備
步驟一、
以抽提的人肝細胞mRNA為模板，以Oligo-dT為引物，采用逆轉錄的方式合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，用高保真DNA聚合酶進行PCR反應。其引物序列如下
弓I物 I : tgctgcggatccgcaaacgtcgtaccgccaccagtgagta (SEQ ID NO: 11)；
弓I物 2 : atatgcggccgcctactctccaaactgatcaatga ； (SEQ ID NO: 12)
弓I物 3 tgctccagcgggtccggcgaaccgccaccagtgagtacca (SEQ ID NO: 13)
引物I含有人蛋白C信號肽C端序列和人前凝血酶-2 N端編碼序列，引物2含有人前凝血酶-2 C端編碼序列并引入Not I酶切位點，其產物為含有人蛋白C信號肽部分序列和人前凝血酶-2完整編碼區的嵌合基因，其序列如SEQ ID NO: I
引物3含有人凝血酶原信號肽c端和人前凝血酶-2 N端編碼序列，引物2和引物3的擴增其產物為含有人凝血酶原信號肽和人前凝血酶-2完整編碼區的嵌合基因，其序列見SEQ ID NO:2。步驟二、
以人肝細胞cDNA為模板，以下列序列為引物合成人蛋白C信號肽 弓I物 4: ataggtaccgccgccaccatgtggcagctcacaagcct (SEQ ID NO: 14)
弓丨物 5 : tactcactggtggcggtacgacgtttgcggatccgcagca (SEQ ID NO: 15)
引物 6 atggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagc (SEQ ID NO: 16)
弓丨物 7 tggtactcactggtggcggt tcgccggacccgctggagca (SEQ ID NO: 17)
引物4和引物5為人蛋白C信號擴增引物，引物4引入Kpn I酶切位點，引物5含有人前凝血酶-2 N端序列，其產物為人蛋白C信號肽和人前凝血酶-2 N端序列的嵌合基因，其序列如 SEQ ID NO:3。引物6和引物7為人凝血酶原信號肽擴增引物，引物6為含有人凝血酶原信號肽N端序列并在5’端引入Kpn I酶切位點，引物7含有人前凝血酶-2 N端序列，其產物為人凝血酶原信號肽和人前凝血酶-2 N端序列的嵌合基因，其序列見SEQ ID N0:4。步驟三、
以上述步驟一和步驟二的產物為模板，以引物3和引物2進行PCR，其產物序列如SEQID NO: 5所述，在其兩端分別引入Kpn I和Not I酶切位點，其電泳結果可參見圖I和圖2。表達的PC-PT2融合蛋白的序列見SEQ ID N0:6。以上述步驟I和步驟2的產物為模板，以引物5和引物2進行PCR，其產物序列如SEQ ID NO:7所述，在其兩端分別引入Kpn I和Not I酶切位點，其電泳結果可參見圖I和圖2。其表達的th-PT2融合蛋白序列見SEQ ID NO:8。實施例2 :人前凝血酶-2表達質粒的構建擴增產物和PGN載體(見中國專利200910052576. I)分別以Kpn I和Not I雙酶切，純化酶切產物后，以T4 DNA連接酶按連接擴增產物pGN載體(摩爾比3 :1)，連接成環。構建表達質粒pGN/pc-PT2和pGN/th-PT2，其質粒圖譜見圖3。實施例3 :利用動物細胞表達人前凝血酶-2
使用實施例2所述的表達質粒轉染常規的DHFR缺陷型的中國倉鼠卵巢細胞CHODG44(G Urlaub 等，somatic 細胞，Mol. Genet. , 12，p555_556, 1986，以下稱 CH0)。該細胞采用商業無血清Excell-302培養基(Sigma公司)加入次黃嘌呤和胸腺嘧啶(HT)正常培養，轉染采用電轉染的方法，其過程如下所述對數生長期的CHO細胞，在轉染前24小時離心換液，用新鮮培養基重懸并吹打成單細胞懸液；轉染時將細胞離心并按照IO7細胞每毫升的密度重懸，取O. 8 mL放入O. 4 cm的電擊杯中；加入200微克的表達質粒pGN/pc-PT2或pGN/th-PT2，輕輕混勻，避免氣泡產生；冰浴10分鐘；電轉染條件為電壓300伏、電容975微法拉、電阻1000歐。電擊結束后室溫靜置10分鐘，轉入含302培養基的培 養瓶中，孵育箱培養。轉染后的細胞在連續培養12-14天后，用含20 nM的氨甲喋呤(MTX)的302培養基稀釋和接種入96孔板。細胞生長到11-13天的時候，用間接ELISA的方法檢測人前凝血酶-2的表達。取表達較高的克隆株，進行進一步加壓篩選。其流程為將高表達的克隆株移到已經含有更高濃度MTX的96孔板孔中進行加壓。用間接ELISA的方法檢測人前凝血酶_2的表達。重復這一步驟，逐漸提高MTX濃度。使用的MTX濃度為20、40、60、90、130、200、300、450,600,900 nM MTX0通過MTX濃度上升選出抗MTX的細胞株，用有限稀釋法進行亞克隆制備，采用間接ELISA方法進行表達量檢測。實施例4 =CHO細胞產生前凝血酶-2的水平
表達人前凝血酶-2的CHO細胞亞克隆株，包括pGN/pc-PT2質粒轉染的細胞株和pGN/th-PT2質粒轉染的細胞株，在市售的Excell-302培養基(Sigma公司)條件下，以2X IO5/mL密度接種于直徑10 cm的一次性培養皿，37度，5%C02,95%相對濕度進行培養。24小時計數細胞密度，取上清，離心用于ELISA檢測。ELISA采用間接ELISA方法，其過程如下
人α -凝血酶標準品按照I μ g/mL為起始濃度，倍比稀釋后每孔50 μ L的量包被在酶標板；取培養上清分別用PBS以不同稀釋倍數稀釋，按每孔50 μ L的量包被；包被采用ρΗ9. 6的O. I M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液4度包被過夜；
棄去液體，用封閉液(含O. 5%BSA的PBST)洗滌3次，然后加入用封閉液1:2000稀釋的抗人α凝血酶單抗溶液100 μ L，37度孵育I小時；
棄去液體，用封閉液(含O. 5%BSA的PBST)洗滌3次，然后加入用封閉液1:5000稀釋的HRP標記的抗鼠IgG 二抗溶液100 μ L，37度孵育I小時；
棄去液體，用封閉液(含O. 5%BSA的PBST)洗滌3次，加入50 μ LTMB液體，顯色15分鐘，450 nm波長檢測表達。通過實驗檢測不同篩選濃度下的兩種表達細胞株的人前凝血酶表達水平，其表達量結果見圖4。其中，20到135 nM兩個細胞均選取20株克隆進行比較；200到900 nM各選取10株克隆進行表達比較。可見采用蛋白C信號肽的pGN/pc-PT2質粒轉染的細胞株比采用凝血酶自身信號肽的pGN/th-PT2質粒轉染的細胞株表達明顯增加。經亞克隆后測定單細胞表達量，pGN/pc-PT2細胞株比pGN/th_PT2細胞株平均高2-3倍。其中前者表達較高的細胞株，pC-PT2 F3-C3細胞株的前凝血酶-2表達量為75 pg/c/d。這表明，利用蛋白C信號肽替代凝血酶自身信號肽可大大提高人前凝血酶-2在CHO細胞中的表達量.
實施例5 :重組人前凝血酶CHO細胞的生物反應器培養
將高表達人前凝血酶-2的細胞株(F3-C2)細胞株在250mL轉瓶中培養，其工作體積為50 mL ;當細胞密度達到IXlO6以后，擴大培養到2 L轉瓶，其工作體積為500mL。當細胞 密度達到I X 106/mL、細胞活度高于95%的情況下，將細胞接種入5 L WAVE袋中。WAVE系統采用GE的20/50系統，初始接種密度為4X IO5細胞/mL、初始體積I升，其溫度為37度、轉速為12轉、角度為6度、通氣量為O. 15 Lpm、溶氧設定60%、5%C02 ；按照fed-batch工藝，逐步增加培養基的量；一般情況下，每次增加上次培養基總體積的30-50%，在這個過程中調整角度、轉速和通氣量以維持溶氧，適當補堿以維持pH值，適當補糖以維持葡萄糖濃度。當細胞密度達到IXlO6AiL以上時開始補加補料培養基，每升培養基每天補加10 mL補料培養基。當細胞密度達到3 X IO6AiL以上開始降溫。細胞活率低于85%時停止生長，收集表達上清。上清離心后采用間接ELISA方法檢測表達量。結果采用此工藝下，每升培養液可含有約300毫克的人前凝血酶_2。其電泳結果見圖5，間接ELISA結果見圖6。實施例6 :蛇毒伊卡因(ecarin)基因的制備
以文獻(S. Nishida 等，Biochemistry , 34, 1771-1778)報道的方法，以伊卡因 cDNA為模板，通過特異性引物進行PCR擴增，并在兩端分別引入EcoR I和Not I，獲得編碼序列于報道完全相同的目的基因。其序列見SEQ ID NO: 10。實施例7 :伊卡因表達質粒的構建
將上一實施例中獲得的伊卡因擴增產物和PGN載體(見中國專利200910052576. I)分別以EcoR I和Not I雙酶切，純化酶切產物后，以T4 DNA連接酶按連接擴增產物pGN載體摩爾比3 1比例連接成環。構建表達質粒pGN/ecarin,質粒圖譜見圖7。實施例8 :利用動物細胞表達伊卡因
使用實施例7所述的表達質粒pGN/ecarin轉染CHO DG44。轉染采用電轉染的方法，其過程如下所述對數生長期的CHO細胞，在轉染前24小時離心換液，用新鮮培養基重懸并吹打成單細胞懸液；轉染時將細胞離心并按照IO7細胞每毫升的密度重懸，取O. 8 mL放入O. 4cm的電擊杯中；加入200微克的表達質粒pGN/ecarin，輕輕混勻，避免氣泡產生；冰浴10分鐘；電轉染條件為電壓300伏、電容975微法拉、電阻1000歐。電擊結束后室溫靜置10分鐘，轉入含新鮮培養基的培養瓶中，孵育箱培養。轉染后的細胞在氨甲喋呤(MTX)的302培養基中加壓篩選。逐漸提高MTX篩選濃度。使用的篩選濃度為20、40、60、90、130、200、300、450、600、900 nM MTX0篩選最終濃度所得的細胞株，用有限稀釋法進行亞克隆制備，采用dot-blot方法進行表達量檢測。結果獲得了多株表達伊卡因的細胞株，其如圖8所示。采用dot-blot檢測900nM ecarin蛋白的表達,+為陽性對照品(300ng),-為陰性對照(Excell-302培養基)。每一縱列均為一個細胞株，可見第2、4、6列細胞表達量較高。
實施例9 CH0細胞產生伊卡因的績效
表達伊卡因的CHO細胞亞克隆株(2F8-C8)，在Excel 1-302培養基條件下，以2 X 105/mL密度接種于10 cm 一次性培養皿，37度，5%C02，95%相對濕度進行培養。24小時計數細胞密度，取上清，離心用于伊卡因酶學活性檢測。其酶學活性檢測方法見實施例13，檢測可見其表達量為4. 5yU/c/d。實施例10 :重組伊卡因在生物反應器中的生產
將高表達伊卡因的細胞株擴大培養，培養基采用EX-cell302培養基。起始在250 mL轉瓶中培/養，其工作體積為50 mL ;當細胞密度達到IXlO6AiL以后，擴大培養到2 L轉瓶，其工作體積為500 mL。當細胞密度達到I X 106/mL、細胞活度高于95%的情況下，將細胞接種入5升WAVE袋子中。WAVE系統采用GE的20/50系統，初始接種密度為4X 105cellS/mL、初始體積I升， 其溫度為37度、轉速為12轉、角度為6度、通氣量為O. 15升每分、溶氧設定60%、5%C02 ；按照fed-batch工藝，逐步增加培養基的量；一般情況下，每次增加上次培養基總體積的30-50%，在這個過程中調整角度、轉速和通氣量以維持溶氧，適當補堿以維持pH值，適當補糖以維持葡萄糖濃度。當細胞密度達到IXlO6以上時開始補加補料培養基，每升培養基每天補加10 mL補料培養基。當細胞密度達到3 X 106/mL以上開始降溫。細胞活率低于85%時停止生長，收集表達上清。上清離心后檢測其酶學活性，發現在此工藝下，每升含有伊卡因20U/mL。其電泳結果見圖9。實施例11 :重組伊卡因的純化 純化方法如下
收集含有伊卡因的細胞培養上清，10000 rpm離心20min，取上清；
用10 mM Tris-HCl pH8. O緩沖液平衡DEAE-sepharose,將離心培養上清按照120 cm/h上樣，當基線沖洗至平穩時；按照O至I M NaCl，10 mM Tris-HCl pH8. 0,10個柱體積條件梯度洗脫(120 cm/h)，收集含有伊卡因的樣品；
用 50% 飽和度硫酸銨的 10 mM Tris-HCl ρΗ8· O 溶液平衡 phenyl-sepharose,將 DEAE收集樣品加入50%飽和度硫酸銨，完后按照120 cm/h上樣，用50%飽和度硫酸銨的10 mMTris-HCl pH8. O溶液沖洗至基線平穩后；按照50%至0% 10 mM Tris-HCl pH8. 0，10個柱體積條件梯度洗脫(120 cm/h)，收集含有伊卡因的樣品。結果獲得的高純度的伊卡因，其電泳結果見圖10。實施例12 :重組凝血酶的純化和激活 方法如下
收集含有重組凝血酶的細胞培養上清，10000 rpm離心20min，取上清；
用10 mM Tris-HCl pH8. O緩沖液平衡DEAE-sepharose,將離心培養上清按照120 cm/h上樣，當基線沖洗至平穩時；按照O至I M NaCl，10 mM Tris-HCl pH8. 0,10個柱體積條件梯度洗脫(120 cm/h)，收集含有重組人前凝血酶-2的樣品；
用50%飽和度硫酸銨的10 mM Tris-HCl ρΗ8· O溶液平衡Phenyl-s印harose，將DEAE收集樣品加入50%飽和度硫酸銨，完后按照120 cm/h上樣，用50%飽和度硫酸銨的10 mMTris-HCl pH8. O溶液沖洗至基線平穩后；按照50%至0%10 mM Tris-HCl pH8. 0,10個柱體積條件梯度洗脫(120 cm/h)，收集含有重組人前凝血酶-2的樣品；按照6. 5U/mL的比例向重組人前凝血酶-2溶液中加入伊卡因，于37°C孵育16小時；用O. 15 M NaCiaO mM PB pH 8. O溶液平衡Blue-s印harose，將孵育激活后樣品按照120 cm/h上樣；當基線沖洗至平穩時，按照0%至70%乙二醇，O. 5 M NaCl,10 mM PB pH 8.0，10個柱體積條件梯度洗脫(120 cm/h)，收集含有重組凝血酶的樣品；
用O. 2 M NaCiaO mM PB pH 8. O溶液平衡s印hacryl S-200，將Blue洗脫樣品按照24 cm/h上樣后洗脫，收集含有重組凝血酶的樣品。結果
Ecarin活化人前凝血酶-2的電泳結果見圖11。活化后的重組人凝血酶，用實施例13的方法檢測其凝血酶活性，并酶切本公司自產的含有凝血酶酶切位點的目的蛋白以驗證其酶切活性(圖12)。最后純化的樣品經SDS-PAGE電泳、HPLC分析可見其純度大于95%，結果如圖 13-14。純化的重組人凝血酶經序列測定，其氨基酸序列同天然人α-凝血酶相同。其蛋白序列見SEQ ID NO: 18。實施例13 :重組α -凝血酶酶學特性
上述實施例中的凝血酶和伊卡因活性檢測方法如下
①凝血酶活性檢測
采用纖維蛋白原凝固法檢測人重組凝血酶活性。所用標準品為凝血酶國家標準品，上海生物制品研究所制備。取不同稀釋度的標準品或樣品O. lmL，置測定杯中，37度孵育2分鐘；加入3 mg/mL的纖維蛋白原O. 4 mL,記錄凝固時間。用4，4平行線法計算效價。經測定得Ecarin完全活化后的人凝血酶比活性為3200 U/mg。②伊卡因活性檢測
在純化后的人前凝血酶-2中,加入相同體積、不同濃度的Ecarin (sigma公司)和待測樣品，37度酶切4 h。加入EDTA終止反應。取終止反應后的樣品，按照步驟(I)的方法進行凝血酶活性測定。用標定的標準Ecarin定量樣品蛋白活性。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.ー種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是人蛋白C的信號肽序列與缺失Gla結構域的人凝血酶形成的融合蛋白。
2.如權利要求I所述融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0:6所示。
3.ー種編碼權利要求I所述的融合蛋白的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列如SEQID NO:5所示。
5.—種載體，其特征在于，所述的載體含有權利要求3所述的多核苷酸。
6.ー種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞攜帶權利要求5中所述的表達載體，或者所述宿主細胞的基因組中整合有權利要求2所述的的多核苷酸。
7.一種制備人凝血酶的方法，其特征在于，包括步驟 培養權利要求6所述的宿主細胞，從而表達所述的融合蛋白，并分泌形成人前凝血酶-2 ； 分離或純化出所述的分泌的人前凝血酶_2 ;和 對上一歩驟中獲得的人前凝血酶_2進行激活處理，從而形成人凝血酶。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，在分離或純化步驟中包括將人前凝血酶_2經過陰離子柱和疏水柱進行純化后，再用重組ecarin蛋白激活。
9.如權利要求I所述的融合蛋白或權利要求3所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制備人凝血酶。
10.一種表達和生產重組人凝血酶的序列和方法，其特征在于，包括步驟 ①將含有人蛋白C的信號肽序列與Gla結構域缺失的人凝血酶基因融合，形成表達融合蛋白(人蛋白C-凝血酶2融合蛋白，pc-PT2)的編碼基因； ②將上述編碼基因插入包含有效的啟動子(CMVpromotor)、牛生長因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)、雞 beta-肌動蛋白啟動子、DHFR 基因、SV40polyA信號序列的表達載體pGN的多克隆位點,形成重組的表達載體； ③將重組表達載體轉染動物細胞，并選出表達所述融合蛋白的宿主細胞； ④培養上一步驟中獲得的宿主細胞，從而表達人前凝血酶_2;和 ⑤分離純化所述的人前凝血酶_2;和 ⑥激活人前凝血酶_2，從而獲得人凝血酶。
全文摘要
本發明提供了一種重組人凝血酶在動物細胞內的高效表達和生產方法。具體地，本發明提供了一種融合基因及其編碼的融合蛋白。該基因含有人蛋白C的信號肽序列和Gla等結構域缺失人前凝血酶基因序列，可提高人前凝血酶-2的表達水平。本發明還公開了采用包含上述核苷酸序列的重組表達載體在動物細胞中表達和生產人前凝血酶的方法；本發明還公開了經過純化和激活生產重組人凝血酶的方法。本發明所生產的重組人凝血酶具有可以滿足治療臨床相關疾病的生物學活性。
文檔編號C12N15/63GK102690803SQ20111007177
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月24日 優先權日2011年3月24日
發明者張濱, 徐志剛, 盛澤林 申請人:蘇州澤璟生物制藥有限公司