專利名稱：一種提取質粒dna的試劑和方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種提取質粒DNA的試劑和方法。
背景技術：
質粒DNA是基因工程常用的載體，可以攜帶外源基因進入細菌、動物細胞或植物體內進行擴增與表達，質粒DNA的提取和純化是分子生物學研究領域中應用最廣泛和最基本的技術，質粒提取的效率和質量對于后續實驗(酶切、PCR擴增和測序等)的成功與否有著直接的關系。目前在國內外，很多生物試劑公司都研制了與提取質粒技術相關的試劑盒， 如普洛麥格、天根生化、生工等。該類試劑盒多以純化柱為主，成本高，價格昂貴，試劑繁雜且耗時較長。若以改良的堿裂解、酚-氯仿抽提方法提取質粒，獲得的質粒DNA產量低，質量不高，不能滿足下游的酶切和測序的要求，同時多種試劑混合應用，無疑加大了實驗的工作量，使得實驗時間顯著延長，影響生物學實驗操作和實驗結果。
發明內容
本發明提供了一種提取質粒DNA的試劑和方法，本發明所用提取質粒的試劑成本低，提取質粒DNA的方法操作簡單，且本發明所述的試劑和方法提取出的質粒產量高、純度高，本發明具有快速、簡易、高效、高質且成本低的優點。為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案一種提取質粒DNA的試劑，其特征在于它包括菌體裂解試劑、蛋白抽提試劑、質粒DNA沉淀試劑和質粒DNA溶解試劑；所述菌體裂解試劑的組分為10mM Tris-HClUmM EDTA, IOOmM氯化鈉和5mg/ml溶菌酶，以超純水為溶劑，所述Tris-HCl的PH值為7. 4-8. 0 ； 所述蛋白抽提試劑的組分為體積比為1 1的酚和氯仿混合物；所述質粒DNA沉淀試劑的組分為PH7. 5的5. 5M醋酸鈉溶液和無水乙醇，所述醋酸鈉溶液和無水乙醇體積比為 1 3 ；所述質粒DNA溶解試劑的組分為含有0. lmg/ml RNase的超純水。其中，所述試劑Tris-HCl的最佳PH值為8. 0。本發明還提供了一種提取質粒DNA的方法，它包括以下步驟(1)搖菌擴增質粒；將攜帶質粒的大腸桿菌接種于LB固體培養基中，挑選單克隆菌落接種于LB液體培養基擴增培養，置于在30-38°C恒溫搖床上以150-250轉/分鐘搖動培養；(2)取培養12-16小時OD6tltl達到0. 6以上的生長狀態良好的細菌菌液1. 5ml于 1. 5ml離心管，20°C -25°C下以13000g離心30秒，棄上清；(3)沉淀中加入50 μ 1所述菌體裂解試劑，充分振蕩混勻；(4)加入50μ 1所述蛋白抽提試劑，置于渦旋振蕩儀上混勻2秒鐘；(5) 200C -250C以13000g離心5分鐘以釋放質粒DNA ；(6)收集上清，切勿觸動蛋白質界面；(7)加入17 μ 1質粒DNA沉淀試劑和250 μ 1的無水乙醇，顛倒混勻；
(8) 20°C -25°C以13000g離心 1分鐘以沉淀質粒DNA ；(9)棄上清，并干燥質粒DNA ；(10)用40 μ 1質粒DNA溶解試劑溶解質粒DNA，_20°C保存備用。與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是本發明的所用試劑采用溶菌酶溶解細菌，通過酚-氯仿一步法去除蛋白質和RNA。用本發明所述提取質粒的方法提取質粒操作時間短，提一種質粒的時間總共不超過10分鐘；本發明所用提取質粒的試劑組成簡單， 均為常見實驗試劑，來源廣泛且價格低，各組分均可以采用國產分析純就可以提取到高產量和純度的質粒，大大降低了實驗經費；獲得的質粒DNA產量高，純度好，無蛋白和RNA的污染，滿足分子生物學相關實驗要求，提取到的質粒DNA可以直接用于下游的酶切、連接、測序、原核轉化和真核轉染等實驗，大大方便了生物實驗操作，節省了實驗時間，提高了實驗效率。
圖1是本發明中應用本發明方法和應用天根柱式純化試劑盒提取的質粒DNA電泳對照圖譜。圖中，M為λ-HindIII消化的DNA分子量標準，1、2為使用本發明方法所提取的質粒DNA圖譜，3、4為使用天根柱式純化盒所提取的相同質粒DNA圖譜。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的技術方案作進一步詳細的說明。實施例1本發明所述的提取質粒DNA的試劑包括四種試劑，分別為菌體裂解試劑Rl ；蛋白抽提試劑R2 ；質粒DNA沉淀試劑R3 ；質粒DNA溶解試劑R4。所述菌體裂解試劑Rl 組分10mMTris-HCl (pH 8.0)；ImM EDTA ；IOOmM 氯化鈉；5mg/ml 溶菌酶。按如下方法配制IOOml的試劑Rl 取超純水75ml0. 5M EDTA (ρΗ8· 0) 0. 2ml5M NaCl2mlIM Tris-HCl(pH 8. 0) Iml用超純水定容至100ml，置于121°C滅菌15分鐘，再加入500mg溶菌酶，于4°C保存。所述蛋白抽提試劑R2 組分取水飽合酚 50ml氯仿50ml混勻后，避光于4°C保存。
所述質粒DNA沉淀試劑R3 組分5· 5M醋酸鈉+無水乙醇。先按如下方法配制IOOml的5. 5M醋酸鈉取醋酸鈉 45g超純水80ml攪拌溶解后，用IOM NaOH調至pH7. 5，用超純水定容至100ml，避光于室溫保存。再將所述5. 5M醋酸鈉和無水乙醇按照體積比為1 3的比例混合，制得所述試劑 R3。所述質粒DNA溶解試劑R4 組分0·lmg/ml RNase 的超純水。按如下方法配制IOOml的試劑R4 稱取IOmg的RNase，WA IOOml超純水定容，4°C保存。本發明用上述配制好的四種試劑按照如下步驟提取質粒DNA (1)按常規搖菌擴增質粒(詳見《分子克隆實驗指南》)，具體步驟如下A、準備LB液體培養基和LB固體培養基稱取胰蛋白胨2克，酵母提取物1克，氯化鈉2克，加入無菌蒸餾水至200毫升，高壓蒸汽滅菌20分鐘，制得LB液體培養基；稱取胰蛋白胨2克，酵母提取物1克，氯化鈉2克，瓊脂3克，加入無菌蒸餾水至 200毫升，高壓蒸汽滅菌20分鐘，制得LB固體培養基；B、挑取LB固體培養基上生長的攜帶質粒的大腸桿菌單克隆菌落，接種于LB液體培養基中，200轉/分鐘，放在37度恒溫搖床上搖動；(2)取常規培養16小時0D_達到0. 6以上的生長狀態良好的細菌菌液1. 5ml于 1. 5ml離心管，室溫下以13000g離心30秒，棄上清；(3)向沉淀中加入50 μ 1試劑Rl，充分振蕩混勻；(4)再加入50 μ 1試劑R2，于渦旋振蕩儀上混勻2秒鐘；(5)室溫下以13000g離心5分鐘以釋放質粒DNA ；(6)用無菌移液槍吸取上清，切勿觸動蛋白質界面；(7)向上清中加入17 μ 1的試劑R3和250 μ 1的無水乙醇，顛倒混勻；(8)室溫下以13000g離心1分鐘以沉淀質粒DNA ；(9)棄上清，并干燥質粒DNA ；(10)用40 μ 1的試劑R4溶解質粒DNA，_20°C保存備用。所提取到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳加以驗證。如圖1所示，含同一質粒DNA的菌體應用本發明方法和應用天根柱式純化試劑盒提取的質粒DNA電泳對照圖譜。 圖1中，M為DL2000分子量標準，1、2為使用本發明方法所提取的質粒DNA，3、4為使用天根柱式純化 盒所提取的相應質粒DNA。從圖中看出用兩種試劑盒所得的質粒DNA，電泳條帶清晰，無RNA污染。說明使用本發明提取的質粒DNa與使用天根柱式純化試劑盒提取的同一質粒DNA比較，在純度和產量上無明顯區別，但本發明所述的提取質粒DNA的試劑相對于天根柱式純化試劑盒成本降低很多，而且操作簡單，操作所用時間短。以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換 ，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
權利要求
1.一種提取質粒DNA的試劑，其特征在于它包括菌體裂解試劑、蛋白抽提試劑、質粒DNA沉淀試劑和質粒DNA溶解試劑；所述菌體裂解試劑的組分為10mM Tris-HClUmM EDTA, IOOmM氯化鈉和5mg/ml溶菌酶，以超純水為溶劑，所述Tris-HCl的PH值為7. 4-8. 0 ； 所述蛋白抽提試劑的組分為體積比為1 1的酚和氯仿混合物；所述質粒DNA沉淀試劑的組分為PH7. 5的5. 5M醋酸鈉溶液和無水乙醇，所述醋酸鈉溶液和無水乙醇體積比為 1 3 ；所述質粒DNA溶解試劑的組分為含有0. lmg/ml RNase的超純水。
2.根據權利要求1所述的一種提取質粒DNA的試劑，其特征在于所述試劑Tris-HCl的最佳PH值為8.0。
3.一種根據權利要求1所述的試劑提取質粒DNA的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)搖菌擴增質粒；將攜帶質粒的大腸桿菌接種于LB固體培養基中，挑選單克隆菌落接種于LB液體培養基擴增培養，置于在30-38°C恒溫搖床上以150-250轉/分鐘搖動培養；(2)取培養12-16小時OD_達到0.6以上的生長狀態良好的細菌菌液1. 5ml于1. 5ml 離心管，20°C -25°C下以13000g離心30秒，棄上清；(3)沉淀中加入50μ 1所述菌體裂解試劑，充分振蕩混勻；(4)加入50μ 1所述蛋白抽提試劑，置于渦旋振蕩儀上混勻2秒鐘；(5)200C -250C以13000g離心5分鐘以釋放質粒DNA ；(6)收集上清，切勿觸動蛋白質界面；(7)加入17μ 1質粒DNA沉淀試劑和250 μ 1的無水乙醇，顛倒混勻；(8)200C -250C以13000g離心1分鐘以沉淀質粒DNA ；(9)棄上清，并干燥質粒DNA;(10)用40μ 1質粒DNA溶解試劑溶解質粒DNA，_20°C保存備用。
全文摘要
本發明提供了一種提取質粒DNA的試劑和方法，它包括菌體裂解試劑、蛋白抽提試劑、質粒DNA沉淀試劑和質粒DNA溶解試劑。用本發明所述提取質粒的方法提取質粒操作時間短，提一種質粒的時間總共不超過10分鐘；本發明所用提取質粒的試劑組成簡單，均為常見實驗試劑，來源廣泛且價格低，各組分均可以采用國產分析純就可以提取到高產量和純度的質粒，大大降低了實驗經費；獲得的質粒DNA產量高，純度好，無蛋白和RNA的污染，提取到的質粒DNA可以直接用于酶切、連接、測序、原核轉化和真核轉染等實驗，大大方便了生物實驗操作，節省了實驗時間，提高了實驗效率。
文檔編號C12R1/19GK102206627SQ20111007475
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月18日 優先權日2011年3月18日
發明者劉世海, 劉相萍, 姚如永, 楊堃, 隋愛華 申請人:青島大學醫學院附屬醫院