專利名稱：一種大豆胞囊線蟲抗性基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種大豆胞囊線蟲抗性基因及其應用，屬于含有編碼蛋白的RNA或 DNA的化合物庫領域。
背景技術：
在我國，尤其是在我國東北地區，由于濫墾、濫牧、濫砍濫伐等現象的日益加劇，使得耕地沙化、干旱及鹽堿地的面積逐年增加。據報道，全國鹽堿地面積逾5億畝，黑龍江省重度鹽堿地面積為1600萬畝(《鹽堿地改造與有機產業發展論壇》，2010)。由于大豆胞囊線蟲喜干旱、堿性的土壤環境(濕度60%，pH 8. 0)，因此土地沙化、干旱及鹽堿地面積的擴大造成了大豆胞囊線蟲危害的日益嚴重。大豆胞囊線蟲是危害世界大豆生產的主要病蟲害之一，也是危害我國大豆生產的主要病蟲害。具有為害面積廣泛、為害程度嚴重，致病性強的特點，土壤一經感染這類病蟲害極難根除，目前選育具有良好適應性的抗性品種是防治大豆胞囊線蟲最經濟有效的措施。而對抗病基因的研究是抗性品種選育的基礎。因此克隆大豆胞囊線蟲抗性基因具有重要意義。目前，已經確定的大豆胞囊線蟲抗性位點約有100多個，但是根據這些位點克隆的基因卻鮮有報道。隨著大豆基因組測序的完成，采用生物信息學的方法進行基因的挖掘已經成為可能，另外，無論是來自單子葉植物的還是雙子葉植物的抗性基因，在結構上都有一些保守性，這為抗病基因的挖掘提供了便利條件。大豆胞囊線蟲對大豆的侵染具有特異性，因此，挖掘到的候選基因無法在擬南芥等模式植物中驗證其抗性，而大豆又是公認的難以轉化的植物，因此，找到一種能夠快速進行抗性候選基因功能驗證的方法迫在眉睫。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種大豆胞囊線蟲抗性基因。所述大豆胞囊線蟲抗性核苷酸序列如以下1)-4)任一所示，1)其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；2)在嚴格條件下與1)限定的核苷酸序列能夠雜交且能夠表達的DNA分子；3)與1)中所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達的mRNA分子；4)與1)中所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達的DNA分子。所述嚴格條件可為在6 X SSC, 0. 5 % SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。含有以上任一所述核苷酸序列的重組載體、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。所述重組載體為將上述編碼基因插入pGFP⑶S獲得的重組載體。擴增以上任一所述核苷酸序列的引物對也屬于本發明的保護范圍。
擴增權利要求1所述核苷酸序列所用的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3及SEQ ID NO. 4 所示。本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種大豆胞囊線蟲抗性基因應用的方法。所述基因片段在不含有此基因的植物組織中的表達應用也是本發明保護的范圍。所述植物組織為根、莖、葉、花或種子。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物為煙草，所述雙子葉植物為擬南芥及任何栽培或者野生大豆。所述表達為過表達。所述表達和/或所述過表達是通過含有大豆胞囊線蟲胞囊、蟲卵、幼蟲的試驗土樣及溶液在溫室條件下進行表達。所述幼蟲為二齡幼蟲，所述土樣為將病土和無菌細沙以3 1的比例均勻混合制備的試驗病土，所述溶液為每毫升至少含有400個蟲卵的懸浮液，所述溫室條件為光照模式day/night = 16h/8h ；溫度模式day/night = 28°C /250C0表達分析結果顯示，該基因在抗病親本中特異表達，而在感病親本中不表達，且在抗病親本的根部的表達量明顯高于葉片中的表達量。將本發明中的基因序列與CaMV 35S啟動子連接在一起后采用發根農桿菌侵染大豆子葉節的方法，誘導感大豆胞囊線蟲的品種產生毛狀根，并在其誘導的過程中將目的基因轉入毛狀根中。將轉基因陽性植株進行接種鑒定。實驗證明，在接種15天后，轉基因陽性根內的雌蟲數明顯少于對照植株根內的雌蟲數；接種30天后，轉基因陽性毛狀根表面的胞囊數目也少于對照，且與對照相比，葉片無明顯的發病癥狀。表明該基因在大豆對胞囊線蟲的抗性中起一定的作用。在我國，尤其是在我國東北地區，由于濫墾、濫牧、濫砍濫伐等現象的日益加劇，使得耕地沙化、干旱及鹽堿地的面積逐年增加。由于大豆胞囊線蟲喜干旱、堿性的土壤環境 (濕度60%，pH 8. 0)，因此土地沙化、干旱及鹽堿地面積的擴大造成了大豆胞囊病害的日益嚴重。因此克隆大豆胞囊線蟲抗性基因具有重要意義，不僅能有效指導常規育種，而且還可以為大豆的轉基因育種事業提供優良的基因資源。因此，將本發明的基因在常規育種工作中導入到感大豆胞囊線蟲的品種中，可獲得對大豆胞囊線蟲具有抗性的大豆新品種，在大豆生產中具有廣闊的應用前景。
圖lGml6上抗病基因簇內基因擴增產物電泳結果示意圖1 =SRC-J-I ；2 :SRC-J-2 ；3 :SRC-J-3 ；4 :SRC-J-4 ；5 :SRC-J-5 ；6 :SRC-J_6 ；M =Marker DL2000圖2SRC-J-6蛋白結構的hterPrc^can分析示意3SRC-J-6半定量RT-PCR結果示意圖1 黑農37葉子2 黑農37根部3 =L-IO葉子4 =L-IO根部圖4SRC-J-6轉基因植株的PCR鑒定示意圖1-8 植株 2、3、5、7、9、10、16、CK ;M1 :DL2000marker
圖5為發狀根品紅染色示意圖a 植株10 ；b 植株16 ；c 陰性對照；d 空白對照
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。DNA片段回收采用博大泰克公司回收試劑盒，并按其說明書進行操作。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上海化學試劑廠，試劑均為國產分析純，引物由上海生工公司合成。Ependorf梯度式PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司。植物材料大豆(Glycine maX(L. )Merrill.)抗胞囊線蟲品種‘L-10’，記載在王梓貞，大豆胞囊線蟲非小種特異性抗性品種的抗性評價與農藝性狀相關分析，[J].大豆科學，2009， (04).中，公眾可從東北農業大學獲得。大豆(Glycine max (L. )Merrill.)感胞囊線蟲品種‘黑農37’，記載在王彬如，高產大豆新品種黑農37選育與推廣，[J].黑龍江農業科學，1993，(01).中。以感病品種黑農37和本實驗室選育的非特異抗性品系L-IO為親本，構建的140 個F2 6和F2 7的重組自交系材料，記載在王梓貞，大豆胞囊線蟲非小種特異性抗性品種的抗性評價與農藝性狀相關分析，[J].大豆科學，2009，(04).中，公眾可從東北農業大學獲得。大豆(Glycine max(L. ) Merri 11.)具有高轉化效率的品種‘東農50’，記載在段瑩瑩，農桿菌介導的大豆子葉節和下胚軸轉化方法的比較及優化，[J]·大豆科學，2010，(04). 中，公眾可從東北農業大學獲得。發根農桿菌K599菌株(保存編號ACCC10060)，由澳大利亞的Allen Kerr分離， 并由中國農業科學院作物科學研究所提供，記載在Cho H J，High efficiencyinduction of soybean hairy roots and progagation of the soybean cyst nematode. Planta,2000, 210 :195-204.中。大豆胞囊線蟲3號生理小種采集自伊春大豆連作地塊。并由教育部大豆生物學重點實驗室分離鑒定。記載在王梓貞，大豆胞囊線蟲非小種特異性抗性品種的抗性評價與農藝性狀相關分析，[J].大豆科學，2009，(04).中，公眾可從東北農業大學獲得NCPPB^559。大豆胞囊線蟲14號生理小種采集自黑龍江省農科院大慶分院實驗病圃，并由教育部大豆生物學重點實驗室分離鑒定。記載在王梓貞，大豆胞囊線蟲非小種特異性抗性品種的抗性評價與農藝性狀相關分析，[J].大豆科學，2009，(04).中，公眾可從東北農業大學獲得。pMD-18T vector,購自 TAKARA 公司。載體 pGFPGUS,記載在 Cho H J, High efficiency induction of soybean hairyroots and progagation ofthe soybean cyst nematode.Planta,2000,210 195-204.中。限制性內切酶和T4DNA連接酶等均購自TAKARA公司。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
實施例1大豆抗胞囊線蟲基因核苷酸序列大豆胞囊線蟲抗性核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或為下1)-3)任一所示，1)在嚴格條件下與SEQ ID NO. 1限定的核苷酸序列能夠雜交且能夠表達的DNA分 子；2)與SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達的mRNA分 子；3)與SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達的DNA分子。所述嚴格條件可為在6XSSC,0. 5% SDS的溶液中，在65で下雜交，然后用2XSSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。擴增以上任一所述DNA片段的引物對也屬于本發明的保護范圍，例如SEQ ID NO. 3 與 SEQ ID NO. 4。SEQ ID NO. 2屬于與SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠 表達的DNA分子。實施例2大豆抗胞囊線蟲基因的獲得1.基因的克隆1)植物總RNA的提取及反轉錄分別取接種線蟲后12h的レ10、黑農37的根部及 葉部組織，提取RNA，總RNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測，18S和^S RNA帶型清晰可辨，紫外分 光光度記檢測0D2e。/0D_比值在1. 9 2. O之間，說明RNA完整性好、純度高。反轉錄反應 參照promega ImProm-II (Promega)反轉錄試劑盒進行操作。2)抗病候選基因全長序列的克隆分別以上述反轉錄的L-10、黑農37的根部及 葉的cDNA為模板，用設計好的基因特異引物(SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4)并采用降落式 PCR的方法克隆目的基因。反應的體系及程序如表1所示。待PCR反應結束后，鋒個樣品各 取Sii L進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖1所示，擴增長度與預期的產物長度一致。表1抗病候選基因PCR反應體系及程序
權利要求
1.一種大豆胞囊線蟲抗性基因，其特征在于核苷酸序列如以下1)-4)任一所示，1)其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；2)在嚴格條件下與1)限定的核苷酸序列能夠雜交且能夠表達的DNA分子；3)與1)中所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達的mRNA分子；4)與1)中所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達的DNA分子。
2.含有權利要求1所述核苷酸序列的重組載體。
3.根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于所述載體為用于克隆的pMDlS-T載體、 用于表達的pGFPGUS、pBI121、pCAMBIA載體或用于RNAi的pJawohl8載體。
4.含有權利要求1所述核苷酸序列的轉基因細胞系或重組菌。
5.擴增權利要求1所述核苷酸序列所用的引物，其核苷酸序列如SEQID NO. 3及SEQ ID NO. 4 所示。
6.權利要求1所述核苷酸序列在植物組織中表達中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述植物組織為根、莖、葉、花或種子。
8.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9.根據權利要求8所述的應用，其特在在于所述單子葉植物為煙草，所述雙子葉植物為擬南芥及任何栽培或者野生大豆。
10.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于所述表達為過表達，通過含有大豆胞囊線蟲胞囊、蟲卵、幼蟲的試驗土樣及溶液在溫室條件下進行表達。
全文摘要
本發明公開了一種大豆胞囊線蟲抗性基因及其應用。本發明提供的cDNA片段(SRC-J-6)，來源于大豆(Glycine max(L.)Merrill.)品種L-10，其核苷酸序列如以下1)-4)任一所示，1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；2)在嚴格條件下與SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列能夠雜交且能夠表達的DNA分子；3)與1)中所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能夠表達的mRNA分子；4)與1)中所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能夠表達的DNA分子。將本發明公開的基因轉化植物組織后，能顯著提高轉基因大豆對胞囊線蟲的抗性。本發明公開的大豆胞囊線蟲抗性基因具有重要意義，不僅能有效指導常規育種，而且還可以為大豆的轉基因育種事業提供優良的基因資源，在大豆生產中具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N5/10GK102206651SQ201110106658
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者常瑋, 李文濱, 韓英鵬 申請人:東北農業大學