專利名稱：釀酒酵母展示亞油酸異構酶催化合成共軛亞油酸的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種釀酒酵母展示亞油酸異構酶催化合成共軛亞油酸的方法。
背景技術：
共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，以下簡稱CLA)是含有順式或反式共軛雙鍵的十八碳二烯酸，是必需脂肪酸亞油酸(Linoleic acid，以下簡稱LA)衍生而成的一組位置和構象異構體的總稱。許多微生物能利用自身的亞油酸異構酶將亞油酸轉化成共軛亞油酸。但目前應用的亞油酸異構酶主要存在以下問題酶的重組表達方式一般是細胞內表達和分泌表達，細胞內表達時由于酶不能與細胞外底物接觸，從而極大地影響酶的催化效率，而且酶分子集聚在細胞內形成反饋抑制，也影響表達效率；分泌表達的主要缺點是表達效率不高，而且也不能實現完全分泌表達，總有相當一部分表達產物滯留于細胞內，從而也不能實現酶與細胞外底物的完全接觸。這兩種表達方式都導致酶的催化效率不高。
發明內容
本發明提供一種用釀酒酵母展示亞油酸異構酶催化合成共軛亞油酸的方法，將亞油酸異構酶展示在細胞壁上，可以直接接觸到底物，進而提高共軛亞油酸的轉化效率。一種釀酒酵母展示亞油酸異構酶催化合成共軛亞油酸的方法，包括將釀酒酵母展示亞油酸異構酶加入到含有亞油酸的緩沖液中，振蕩反應；所述的釀酒酵母展示亞油酸異構酶通過如下方法制備將攜帶重組質粒的釀酒酵母K601，接種到YPG培養基中，誘導培養，離心收集菌體，洗滌，得到釀酒酵母展示亞油酸異構酶；所述的重組質粒包括原始載體pYES2和插入原始載體PYES2的目的基因，所述目的基因由依次連接的Mf α 1信號肽基因、亞油酸異構酶基因、釀酒酵母α-凝集素基因C端錨定區基因組成，所述的Mf α 1信號肽基因插入到原始載體pYES2中GALl啟動子的下游。所述的亞油酸異構酶基因Iai來源于植物乳桿菌(LactcAacillusplantarum) 1ρ15-2-1，其保藏號為CGMCC No. 3782，該菌株的分離、純化及鑒定方法已在中國專利申請 201010251108. X 中公開，GenBank 號為 HQ831447，堿基序列如 SEQ ID NO 1 所示；Mf α 1 酵母信號肽基因來自釀酒酵母，GenBank號為YPL187，堿基序列如SEQ ID NO 3 ；酵母α -凝集素C端錨定區基因sag的GenBank號為YJR004C，堿基序列如SEQ IDNO 2所示。所述的釀酒酵母K601為標準試驗菌株，它可以商業購買或從保藏機構獲得。所述的緩沖液為磷酸緩沖液。所述的緩沖液中亞油酸的濃度為3mg/ml。所述的振蕩反應溫度為28 32°C。所述的振蕩反應時間為6 80h。本發明通過將亞油酸異構酶基因插入到載體pYES2中，導入到釀酒酵母K601中，攜帶重組質粒的釀酒酵母K601經誘導培養后，亞油酸異構酶通過Mf α 1酵母信號肽分泌到細胞外，并利用亞油酸異構酶下游的凝集素錨定蛋白錨定在釀酒酵母細胞壁上，使亞油酸異構酶展示表達在釀酒酵母細胞外表面，直接與底物亞油酸接觸，提高共軛亞油酸的轉化效率，降低生成成本。
圖1是酵母細胞壁展示表達載體的結構示意圖。圖2是PCR鑒定酵母轉化子的電泳結果圖。圖3是酵母細胞表面展示亞油酸異構酶酶活測定圖。圖4酵母細胞表面展示亞油酸異構酶轉化合成CLA的氣相色譜圖；A 陰性對照菌株(轉有空載體pYES》轉化產物的氣相色譜圖；B:重組酵母菌菌株轉化產物的氣相色譜圖；C :LA和CLA甲酯標樣的氣相色譜圖，其中1為LA ;2為c9tlI-CLA ；3為tl0cl2_CLA。
具體實施例方式實施例1酵母展示重組質粒的構建分別以植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) 1ρ15_2_1和釀酒酵母K601基因組DNA為模板，利用表1中的引物，進行PCR擴增，PCR反應體系為10XPCR buffer(含 Mg2+)5y L，dNTPs(25mM)4y L，引物 1 禾口弓丨物 2 (10 μ Μ)各 1 μ L，基因組 DNA 1 μ g，ExTaqDNA 聚合酶1U，加無菌超純水至終體積50 μ L ；PCR反應條件為94°C預變性5min ；94°C變性 30s，48°C退火30s (基因mf α 1) /50°C退火40s (亞油酸異構酶基因Iai和酵母α -凝集素 C端含321aa的錨定區基因sag)，72°C延伸lmin，反應30個循環；72°C延伸5min。得到信號肽基因mf al (SEQ ID NO :3)、亞油酸異構酶基因Iai (SEQ ID NO=D和酵母α -凝集素 C端含321氨基酸的錨定區基因sag (SEQ ID NO 2)。表1所用引物序列
j丨物引物序列(下劃線部分為酶切位點)引物用途及酶切位點
MFa 1-5'CGAAGCTTATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC擴增酵母信號肽 (/Λ>ζ(1ΙΙΙ )
MFa 1-3'CGGAATTCAGCTTCAGCCTCTCTTTTATCC擴增酵母信號肽 (EcoR I )SAGl-5，CGCTCGAGAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC擴增酵母凝集素基因 sag (Λ7ζο I ) SAG 1-3'CGTCTAGATTAGAATAGCAGGTACGACAAAAGCAG擴增酵母凝集素基因 sag (J a I ) LAI-5，CGGAATTCATGGTTAAAAGTAAAGCAATTATGATTG擴增/α,·基因(￡coRI )
LAI-3 ‘ CGCTCGAGGTCAAACATCTTCTTAGTTG_擴增 fa,·基因(Ζ/ζο I )_將PCR產物與克隆載體pMD 18_T simple (pMDS)連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，得到質粒pMDS-lai、pMDS-mf a 1和pMDS-sag。首先用HindIII和EcoR I雙酶切質粒pMDS-mf α 1和空載體pYES2，回收基因片段mf α 1和載體pYES2并連接，構建 pYES2-mf α 1 (ρYM)載體；再用EcoR I和Xho I雙酶切質粒pMDS-lai和ρYM,回收Iai基因片段并將之插入載體PYM中，構建pYES2-mf α 1-lai (pYML)載體；最后用Β ο I和)(baI 雙酶切質粒pMDS-sag和pYML，回收基因片段sag和載體pYML并連接，構建酵母展示表達載體pYES2-mf α 1-lai-sag (pYMLS)。結果如圖1所示，從N端到C端為GALl啟動子 +mf α l+lsii+sEig。實施例2重組酵母的獲得及篩選SD(尿嘧啶缺失型)固體篩選培養基(g/L) :SD+2%瓊脂粉
SD培養基成分(g/L) :16. 8g酵母氮源；0. 77g尿嘧啶缺失型氨基酸；2g半乳糖。載體pYES2上有URA基因，重組酵母菌能夠在缺失尿嘧啶的培養基上生長，因此選用SD固體篩選培養基篩選轉化子。將上述重組質粒通過電擊法轉化到釀酒酵母細胞K601中，用Bio-Rad的基因電擊轉化儀(BTX)，將電擊杯轉入電擊座中，進行電擊轉化，條件為電壓為1.5KV;電容25yF; 電阻200 Ω ；電擊時間k ；然后在SD固體篩選培養基上倒置培養，30°C、培養48h，篩選得到轉化子；最后對獲得的轉化子進行亞油酸異構酶基因的PCR擴增鑒定，結果如圖2所示，與陰性對照菌株(CK)相比，重組酵母菌菌株均能擴增出約1700bp的條帶，說明質粒pYMLS已經成功轉入到釀酒酵母K601中。實施例3重組酵母酶活測定及轉化產物分析YPG誘導培養基成分(g/L) :10g蛋白胨；5g酵母膏；IOg半乳糖。將上述獲得的重組酵母菌接種到YPG誘導培養基中，30°C培養4 后，離心 (3000r/min, IOmin,)收集菌體細胞，將收集的菌體細胞經生理鹽水(0.9% ν/ν)洗滌兩次后，加入到含有3mg/ml亞油酸的磷酸緩沖液中(0. lmol/1, pH7. 0) ；30°C，180rpm條件下進行轉化反應，每隔6小時取樣測定亞油酸異構酶的酶活，以攜帶空載體PYES2的酵母菌菌體細胞的轉化產物為對照，結果如圖3所示，由圖可知隨著培養時間的增加，重組酵母菌菌體細胞的酶活逐漸增加，在20h時達到最大，為40. 5U/ml，之后逐漸下降；而攜帶空載體pYES2 的酵母菌體細胞基本檢測不到亞油酸異構酶酶活。將上述重組酵母菌的轉化20h時產物經兩倍體積正己烷提取后，用氣相色譜檢測，如圖4所示，圖中A:陰性對照菌株(轉有空載體pYES2)轉化產物的氣相色譜圖；B:重組酵母菌菌株轉化產物的氣相色譜圖；C =LA和CLA甲酯標樣的氣相色譜圖，其中1為LA ;2 為 c9tIl-CLA ；3 為 tl0cl2-CLA。LA和CLA甲酯標樣的檢測表明LA的出峰時間為30. 46min，而CLA中的兩種異構體c9t 11-CLA和t IOc 12-CLA得到了較好的分離，其保留時間分別為32. 62min和 32. 83min (圖4C)；利用氣相色譜分析法分別對對照菌株和重組酵母菌菌株細胞合成的CLA 產物進行分析，結果如圖4中A和B。通過與圖4C中LA和CLA甲酯標樣的保留時間比對， 轉有空載體PYES2的陰性對照菌株培養液催化LA后其產物中并沒有明顯的CLA產生(圖 4A)；而含有酵母展示表達載體pYMLS的釀酒酵母工程菌株培養液催化LA后產物在保留時間為30. 28和32. 45min時出現典型峰(圖4B)，比對圖4C中LA和CLA甲酯標樣的保留時間得知，二者分別為LA和c9tlI-CLA0且剩余LA的峰面積為15682. 3，c9tIl-CLA的峰面積為5800. 3，不考慮產物提取及甲酯化過程中的LA損失，則約有27. 0%的LA轉化合成了 c9tll-CLA。
權利要求
1.一種釀酒酵母展示亞油酸異構酶催化合成共軛亞油酸的方法，包括將釀酒酵母展示亞油酸異構酶加入到含有亞油酸的pH6. 0-7. 0的緩沖液中，振蕩反應；所述的釀酒酵母展示亞油酸異構酶通過如下方法制備將攜帶重組質粒的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) K601，接種到YPG培養基中， 誘導培養，離心收集菌體，洗滌，得到釀酒酵母展示亞油酸異構酶；所述的重組質粒包括原始載體PYES2和插入原始載體pYES2的目的基因，所述目的基因由依次連接的Mf α 1信號肽基因、亞油酸異構酶基因、酵母α -凝集素C端錨定區基因組成，所述的Mfa 1信號肽基因插入到原始載體PYES2中GALl啟動子的下游。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的亞油酸異構酶基因堿基序列如SEQ ID NO 1 所示。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的酵母α-凝集素C端錨定區基因堿基序列如SEQ ID NO 2所示。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的Mfα 1信號肽基因堿基序列如SEQ ID NO 3 所示。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的緩沖液為磷酸緩沖液。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的緩沖液中亞油酸的濃度為:3mg/ml。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的振蕩反應的溫度為^_32°C。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的振蕩反應時間為6 80h。
全文摘要
本發明公開了一種釀酒酵母展示亞油酸異構酶催化合成共軛亞油酸的方法，將含有重組質粒的釀酒酵母K601，接種到YPG培養基中，誘導培養，收集菌體，洗滌，得到釀酒酵母展示亞油酸異構酶催；然后將得到的釀酒酵母展示亞油酸異構酶加入到含有亞油酸的緩沖液中，振蕩反應。本發明將亞油酸異構酶展示表達在釀酒酵母細胞外表面，直接與底物亞油酸接觸，提高共軛亞油酸的轉化效率，降低生成成本。
文檔編號C12R1/865GK102206688SQ201110106809
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者何國慶, 劉佩, 周倩, 阮暉 申請人:浙江大學