專利名稱：檢測肺炎支原體的靶序列、引物和探針及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及用于檢測肺炎支原體的靶序列、熒光定量PCR引物和探針，本發明還涉及利用該靶序列進行肺炎支原體檢測的方法和試劑盒。
背景技術：
肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)是引起呼吸道感染的重要致病菌之一， 10% 40%的社區獲得性肺炎是由肺炎支原體感染引起的。目前國內臨床對于肺炎支原體的檢測技術有限，造成了抗生素的濫用，增加了醫療負擔。由于肺炎支原體分離培養技術復雜且耗時，其檢測技術主要依靠血清學檢測和核酸檢測。近些年出現的熒光PCR檢測技術憑借其快捷，高靈敏度和特異度的優勢，越來越廣泛的應用于臨床肺炎支原體感染檢測。 國外已報道多種肺炎支原體熒光PCR檢測體系，檢測靈敏度和特異度均已經超過血清學檢測技術，熒光PCR檢測技術逐漸成為臨床肺炎支原體檢測的“金標準”。針對肺炎支原體檢測的熒光PCR技術主要以TaqMan探針檢測體系為主，方法靈敏度高，特異度好。目前報道的檢測肺炎支原體的熒光PCR檢測的基因主要有AIPase operon gene, R印MPl和CARDS toxin gene，其檢測靈敏度在幾十CFU到幾個CFU之間。(參考文獻①Daxboeck，F.，G. Khanakah,C. Bauer,M. Stadler,H. Hofmann,and G. Stanek. 2005. Detection of Mycoplasma pneumoniae in serum specimens from patients with mycoplasma pneumonia by PCR. Int. J. Med. Microbiol. 295 :279-285 ；② Dumke, R. , N. Schurwanz, Μ. Lenz, Μ. Schuppler, C. Luck, and Ε. Jacobs. 2007. Sensitive detection of Mycoplasma pneumoniae in human respiratory tract samples by optimized real-time PCR approach. J. Clin. Microbiol. 45 :2726-2730 ；③ Winchell，J. M.，K. A. Thurman, S. L. Mitchell, W. L. Thacker, and B.S.Fields. 2008. Evaluation of three real-time PCR assays for detection ofMycoplasma pneumoniae in an outbreak investigation. J. Clin. Microbiol.46 3116-3118.)雖然肺炎支原體熒光PCR檢測技術非常成熟，但是基本所有檢測方法都是國外學者報道的，其設計探針引物及體系驗證均使用的國外菌株。由于NCBI數據庫中還沒有國內菌株Pl基因序列，所以這些方法雖然國內也在使用，但對于中國肺炎支原體菌株檢測的靈敏度和特異性缺乏真正意義上的比較。
發明內容
本發明的目的在于提供用于檢測肺炎支原體的特異性靶序列；本發明的還在于提供上述靶序列的用途，以提高對中國國內肺炎支原體菌株的檢測能力。為實現上述目的，通過對本實驗室分離到的60株國內肺炎支原體pi基因和NCBI 數據庫已報道的Pl基因序列比對，通過BLAST軟件進行序列同源性分析，找到特異性的保守靶序列，發現了核苷酸完全保守區域^2bp:nt 1676-nt 1937 (相對于肺炎支原體標準菌株MU9)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，該靶序列是檢測肺炎支原體的遺傳標記物。此外，本領域技術人員應當理解，該序列的特異性片段也可以作為檢測肺炎支原體的遺傳標記物。進一步，本發明還提供用于特異性擴征上述靶序列的引物，以及與所述引物配合使用的熒光探針。可以使用諸如I^rimer Express Version 3等軟件來設計探針和引物。通常引物長度為15-30個堿基，一條引物序列與本發明提供的遺傳標記物序列相同，另一條引物序列與該遺傳標記物序列互補；通常Taqman探針長度為20_50個堿基，其序列與上述遺傳標記物相同或互補，其5’標記熒光基團FAM，3’標記淬滅基團BHQ1。本發明探針和引物不但適用于已報道的國外肺炎支原體菌株擴增還適用國內肺炎支原體擴增檢測。在本發明的一個實施方式中，優選的引物序列為MpP1-FP 5，-CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3，，MpPl-RP :5，-AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3，；探針序列為 (FAM) 5，-CCACGGATGGCAGTTGCTGG-3，(BHQl)。本發明提供一種肺炎支原體的實時熒光定量PCR檢測方法，包括以樣品總DNA為模板，以上述遺傳標記物為靶序列，利用本發明提供的引物和探針進行實時熒光定量PCR， 同時設立無模板對照和陽性對照，根據擴增曲線判定結果。在對照有效擴增的情況下，樣品檢測結果可信，否者試驗需要重復；在檢測中兩種對照為有效擴增時，樣本結果判斷標準如下Ct值小于等于38的標本為陽性結果；Ct值大于40的標本為陰性性結果；Ct值在38-40之間的標本需要重復，重復試驗如Ct值依然低于40判定為陽性擴增，超過40判定為陰性擴增。本發明的實時熒光定量PCR擴增反應體系，當為25μ 1反應體系時，其優選配置
為
MpPl-FP MpPl-RP
探針
Platium quantitative PCR super Mix UDG MgCl2
Platium Taq
PCR nucleotide Mix (Promega C1141)
Nuclease-Free Water
模板 本發明的實時熒光定量PCR的反應程序為95°C預變性3min，1個循環；95°C變性
25μΜ0.5μ1 25μΜ0.5μ1 25μΜ 0.2μ1 12.5μ1
50πιΜ2.0μ1
0.25μ1
Ι.ΟμΙ
3.05μ1 5.0μ1IOs, 55 65°C退火30s,45個循環。本發明優選的實時熒光定量PCR的反應程序為95°C預變性3min，1個循環；95°C 變性10s，59°C退火30s，45個循環。本發明每次檢測標本時必須設立NTC對照(無模板對照)和POS對照(陽性對照)，兩種對照對于結果判讀起決定性作用有效擴增NTC(_)ANDP0S(+)無效擴增NTC(+)AND POS (+)提示體系污染無效擴增NTC(_)AND POS(-)提示體系錯誤或者試劑失效。只有對照有效擴增情況下的樣品檢測結果才可信，否者試驗需要重復。在檢測中兩種對照為有效擴增時，樣本結果判斷標準如下Ct值小于等于38的標本為陽性結果；Ct值大于40的標本為陰性結果；Ct值在38-40之間的標本需要重復，重復試驗如Ct值依然低于40判定為陽性擴增，超過40判定為陰性擴增。本發明提供了一種用于肺炎支原體檢測的試劑盒，其包括上述遺傳標記物或其特異性片段的特異性引物以及配合引物使用的Taqman探針。本發明試劑盒的引物序列為MpPl-FP CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT,MpPl-RP :AACGAGTTCCCTACCAACGAAC，探針序列為FAM-CCACGGATGGCAGTTGCTGG-BHQ1。本發明提供的試劑盒，還包括熒光定量反應液，陰性模板和陽性模板，所述陰性模板為去核酸水，所述陽性模板為肺炎支原體基因組DNA，例如濃度為1.62ng/ul的肺炎支原體基因組DNA。本發明在實施例6對試劑盒的檢測時間和檢測靈敏度進行了比較實驗發現與現有兩種商品化試劑盒檢測時間相比，本發明試劑盒檢測時間可縮短半小時左右，并且其實際檢測靈敏度比前兩者高一個數量級。可見對于實際標準品的檢測靈敏度本發明的試劑盒優于上述兩種產品化試劑盒。本發明提供了用于檢測肺炎支原體的pi基因保守區域靶序列，以及以該序列為基礎設計的引物和探針，具有較強的特異性，利用該引物和探針進行肺炎支原體的熒光定量PCR檢測方法進一步簡化肺炎支原體的檢測的程序、縮短檢測周期，用于檢測國內的分離肺炎支原體株，可作為檢測臨床標本的手段，提高肺炎支原體檢測的陽性率。本發明提供的檢測試劑盒，其反應體系包含了上述引物、探針和陰性陽性對照，該試劑盒的推廣應用有利于快速、準確地鑒定肺炎支原體的感染情況。
圖1為熒光定量PCR檢測體系優化結果，圖Ia為不同鎂離子濃度體系優化檢測結果；圖Ib為不同退火溫度體系優化檢測結果；圖2為MpPl體系標準曲線圖，其中橫坐標為陽性模板濃度的對數值，縱坐標為 MpPl體系檢測不同濃度陽性模板的Ct值，R2 = 0. 996 ；
圖3. MpPl體系real-time PCR的特異度檢測，除陽性模板對照外，其余表1中所有模板均無擴增。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例160株肺炎支原體臨床分離株Pl基因全長擴增，測序，序列比對和探針、引物設計。普通PCR引物序列為Plprimer-F 5' -ATGCACCAAACCAAAAAAACTGCCT-3‘Plprimer-R 5' -CTAAGCGGGTTTTTTAGGTGGTTGC-3’使用TAKARALA Taq kit(DRR200A)擴增，反應體系
TAKARA LA Taq0.25ul
IOxLA PCR buffer II2. 5ul
dNTP Mixture4ul
primer-F (10 μ M)O.lul
primer-R (10 μ M)O.lul
Nuclease-Free Water 17.05ul 模板Iul擴增條件
94 °C 5min 94 °C Imin
} 30個循環
68 °C 4min 72 °C 5min擴增產物由華大基因公司(BGI)測序及序列拼接，將拼接并經人工校對后的60條 Pl基因序列及NCBI數據庫所有已報道pi基因序列使用Vector NTI Suite 6軟件序列比對，尋找出保守區域。Pl基因是肺炎支原體本身特有的功能性基因序列，通過對60株國內肺炎支原體Pl基因和NCBI數據庫已報道的pi基因序列比對，發現了核苷酸完全保守區域 262bp :nt 1676 nt 1937 (相對于標準菌株MU9)，核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。使用I^rimer Express Version 3軟件在保守序列區域設計探針及引物MpPl-FP 5，-CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3，，MpPl-RP :5，-AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3，；MpPl-探針(FAM)5，-CCACGGATGGCAGTTGCTGG-3，(BHQl)。
雖然引物和探針與靶序列完全互補是優選的，但是本領域技術人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(尤其是引物的5’端)的情況下，也能夠特異性的擴增出所需的片段。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發明的范圍之內，只要該引物擴增出的擴增產物含有本發明的靶序列或其片段。實施例2實時熒光定量PCR實驗參數的優化(1)體系鎂離子濃度優化將體系中MgCl2從0. 5ul依次遞增為如1，每次增幅 0. 5ul，每個濃度梯度做3個平行樣。結果MgCl2添加量為2ul (MgCl2終濃度為4mM)時體系擴增效果最好(圖la)。(2)體系退火溫度優化體系退火溫度從55°C _65°C改變，結果顯示59°C左右體系擴增效果最好(圖lb)
(3) MpPl實時熒光定量PCR擴增體系及擴增條件的優化
MpPl-FP MpPl-RP
探針
Platium quantitative PCR super
Mix UDG
MgCl2
Platium Taq
PCR nucleotide Mix (Promega C1141)
Nuclease-Free Water
板模
25μΜ0.5μ1 25μΜ0.5μ1 25μΜ 0.2μ1 12.5μ1
50πιΜ2.0μ1
0.25μ1
Ι.ΟμΙ
3.05μ1 5.0μ1
擴增條件
95 °C 95 °C 59 °C
3min IOs 30s
IJ
45個循環
實施例3
體系標準曲線的制作
以標準濃度模板的Ig值為橫坐標，以相應的Ct值為縱坐標，繪制MpPl體系的
real-time PCR標準曲線。結果顯示陽性模板量在8. lfg_8. Ing這個范圍內時，其的對數值與Ct值具有非常好的相關性(R2 = 0. 996)。見圖2。實施例4MpPl熒光PCR檢測體系的靈敏度、特異度及檢出限評價1.靈敏度評價
靈敏度，又稱真陽性率，即實際上是肺炎支原體并按照該檢測方法的標準被正確地判為肺炎支原體的百分比。用優化了的肺炎支原體MpPl檢測體系的real-time PCR檢測體系檢測8株ATCC標準株和實驗室保存的100株肺炎支原體臨床分離株DNA。結果，除 NTC對照外，所有108株肺炎支原體MpPl體系檢測結果呈陽性。2.特異度評價特異度，又稱真陰性率，即實際上不是肺炎支原體而按照該檢測方法的標準被正確地判為肺炎支原體的百分比。用優化了的real-time PCR檢測呼吸道常見菌株20種及人類染色體(表1)，以肺炎支原體為陽性對照。結果除陽性對照外，其余21種非肺炎支原體模板均為陰性(圖3)。表1用于檢測MpPl熒光PCR體系特異性模板
權利要求
1.一種用于檢測肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的遺傳標記物，其具有SEQ ID NO. 1所示的序列或其特異性片段。
2.用于擴增權利要求1所述遺傳標記物的特異性引物。
3.根據權利要求2所述的引物，其核苷酸序列為MpPl-FP :5’ -CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3’，MpPl-RP :5’ -AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3’。
4.與權利要求2或3所述引物配合使用的熒光探針。
5.根據權利要求4所述的熒光探針，其核苷酸序列為(FAM)5， -CCACGGATGGCAGTTGCTGG-3， (BHQl)。
6.一種肺炎支原體的檢測方法，其特征在于，以樣品總DNA為模板，以權利要求1所述的遺傳標記物為靶序列，利用權利要求書2或3所述的引物和權利要求4或5所述探針進行實時熒光定量PCR，根據擴增曲線判定結果。
7.如權利要求6所述的肺炎支原體的檢測方法，其特征在于，實時熒光定量PCR的反應體系為
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應程序為95°C預變性3min，1個循環；95°C變性10s，59°C退火30s，45個循環。
9.含有權利要求2或3所述引物和/或權利要求4或5所述探針的試劑盒。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其還包括熒光定量反應液、陰性模板和陽性模板， 所述陰性模板為去核酸水，所述陽性模板為0. 162fg/ul 1. 62ng/ul的肺炎支原體基因組 DNA。
全文摘要
本發明通過對肺炎支原體基因測序和比對，提供了用于檢測肺炎支原體的遺傳標記物、實時熒光定量PCR引物和探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，本發明還提供了對肺炎支原體進行定量檢測的方法和檢測試劑盒。本發明的檢測方法具有檢測準確，靈敏度高、特異性強，簡便快速的優點，具有良好的標本檢測能力。
文檔編號C12N15/11GK102230013SQ20111016759
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月21日 優先權日2011年6月21日
發明者張建中, 趙飛 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所