一種用于檢測樣品中牛凸隆病毒的熒光RT-PCR引物、探針和試劑盒及檢測方法與流程

本發明屬于體外核酸檢測領域，尤其涉及一種用于檢測樣品中牛凸隆病毒(Porcine Torovirus,PToV)的熒光RT-PCR引物和探針和試劑盒及檢測方法，可用于牛活畜和肉品檢疫時牛凸隆病毒的快速診斷和流行病學研究。

背景技術：

凸隆病毒(Torovirus)作為套式病毒目(Nidovirairs)冠狀病毒科(Coronaviridae)家族的重要成員，包括馬凸隆病毒(Equine Torovirus，EToV，最初稱為伯爾尼病毒)、牛凸隆病毒(Bovine Torovirus，BToV，最初稱為布雷達病毒)、豬凸隆病毒(Porcine Torovirus，PToV)和人凸隆病毒(Human Torovirus，HToV)等四種標準型。凸隆病毒有囊膜病毒，表現為圓形，橢圓形、線形或者腎形，也有呈現桿狀和小圓盤狀的記載，最大直徑為120～140nm，基因組為單股正鏈RNA，全長28,473kb。該病毒感染人和動物，主要引起消化道和呼吸道疾病。自1982年，美國愛荷華州爆發一場由牛凸隆病毒引發的嚴重腹瀉以來，迄今已有30余年的歷史，期間瑞士、英國、德國、南非、巴西、印度、加拿大、荷蘭、澳大利亞、日本、韓國等全球不同國家和地區均有報道由凸隆病毒感染馬、牛、豬、人等引起的腹瀉事件，相關流行病學研究發現，該病毒在世界范圍內流行，在宿主間呈現高水平的陽性率，目前我國還沒有關于牛凸隆病毒相關研究的報道，及時研發出檢測牛凸隆病毒快速、準確的檢測試劑盒對于防止外境相關病毒的侵入具有重大意義。

凸隆病毒是腸道病原體，可以感染各年齡的易感動物，包括豬、牛、馬、人等，主要引起被感染動物的胃腸炎。目前被報道的檢測手段包括抗原捕獲-沒聯免疫吸附試驗、反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和免疫電鏡(IEM)。ELISA方法雖然是一個快速且廉價方法，但是由于目前凸隆病毒不能在細胞中培養，導致在以發病動物的排泄物或腸道內容物作為抗原來源時，實驗產生較高背景，大大降低了ELISA方法的特意性和敏感性。

四川農業大學于2012年申請了專利《一種豬環曲病毒RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法》，申請號：201210398440.8，該專利采用RT-PCR方法，擴增需要采用凝膠電泳技術才能觀察結果，實驗周期長，操作復雜，同時采取開蓋處理容易產生氣溶膠污染，并不適合開發快速，便捷產品。

IEM方法是一個流行病學診斷中非常重要的方法，但是由于其需要高度精密設備和較長的檢測時間，加之檢測成本較高，所以很難做到大范圍推廣和商業化。

實時熒光PCR技術，通過引入特異性探針和熒光信號的動態監測使PCR產物的擴增及分析的全過程可以在單管內封閉完成，并且可以對PCR擴增產物進行實時動態監測及自動分析結果，具有實時、準確、快速、簡便等特點，是一種先進的分子檢測技術。目前還沒有基于實時熒光PCR技術建立的牛凸隆病毒核酸檢測方法及試劑盒。

技術實現要素：

本發明目的之一是提供一種用實時熒光RT-PCR技術檢測牛凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針。其是針對于牛凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)基因編碼區的特異保守區域為靶標區域，設計一對特異性引物及熒光探針。

本發明目的之二是提供一種包括上述熒光RT-PCR引物和熒光探針的試劑盒。

本發明的目的之三是提供一種使用上述熒光RT-PCR引物和熒光探針對牛凸隆病毒的檢測方法，該檢測方法可以快速、定性檢測樣本中的牛凸隆病毒。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種用于檢測牛凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針，其特征在于，所述熒光RT-PCR引物和熒光探針為針對牛凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)的保守序列設計的牛凸隆病毒特異性正向、反向引物和熒光探針。

作為本發明的進一步改進，所述牛凸隆病毒正向、反向引物和熒光探針序列分別是：

正向引物：5'-GCAATAAACCAYTAACAGCTGCTC-3'

反向引物：5'-CTTTAGCGGCGCTGGTAGTAG-3'

熒光探針：5'-TGCTGCGTTGCGGATTTGTGTTGG-3'；

所述熒光探針中的3’端標記有熒光淬滅基團，5’端分別標記有不同的熒光報告基團。

上述引物和探針的衍生序列也為本發明的保護范圍，所述衍生序列包括引物序列的互補鏈序列，同時還可以向5'端和3'端方向延伸一至十個堿基或刪減一至十個堿基得到的序列。

在本發明的一個優選實施例中，所述熒光報告基團選自FAM、JOE或ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red；所述熒光淬滅基團選自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa Black^TM RQ或Lowa Black^TM FQ。

一種TaqMan探針法熒光RT-PCR檢測牛凸隆病毒的試劑盒，其包含RT-PCR反應液、酶混合液、內標溶液、陰性質控品、陽性質控品,其中RT-PCR反應液含有dATP、dUTP、dGTP、dCTP四種核苷酸、內標正向、反向引物、內標探針和上述檢測牛凸隆病毒的牛凸隆病毒特異性正向、反向引物和熒光探針、含有鎂離子的緩沖液。

在本發明的一個優選實施例中，所述內標正向、反向引物和內標探針序列分別是：

內標正向引物：5'-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3'

內標反向引物：5'-GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3'

內標探針：5'-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3'；

所述內標探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

在本發明的一個優選實施例中，所述熒光報告基團選自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或Texas Red；所述熒光淬滅基團選自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa Black^TM RQ或Lowa Black^TM FQ。

在本發明的一個優選實施例中，所述的酶混合液為包含有熱啟動的Taq DNA聚合酶、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑(RNasin)的緩沖液。

在本發明的一個優選實施例中，所述的陽性質控品為含有插入牛凸隆病毒特異型保守序列的pUC57載體質粒的無菌TE緩沖液，所述陽性質控品的濃度為1.0×10⁶copies/ml。

在本發明的一個優選實施例中，所述的陽性質控品為含有插入牛凸隆病 毒特異型保守序列的pUC57載體質粒的無菌TE緩沖液是將含有插入牛凸隆病毒特異型保守序列的pUC57載體質粒轉化到大腸桿菌DH5α中增殖后經提取純化用分光光度計測定濃度和純度后用無菌TE緩沖液稀釋后得到。

在本發明的一個優選實施例中，所述牛凸隆病毒特異型保守序列為：

TGCAATAAACCACTAACAGCTGCTCAGGTTGCTGCGTTGCGGATTTGTGTTGGTGGACAATGGTTTGCCTATTCGCGATCAACTACTACCAGCGCCGCTAAAGT。

在本發明的一個優選實施例中，所述的無菌TE緩沖液采用DEPC水配制。

在本發明的一個優選實施例中，所述的內標溶液為含有插入人RNP基因特異型保守序列的pUC57載體質粒質粒。

在本發明的一個優選實施例中，所述的人RNP基因特異型保守序列為：

GAAGTGGGCACATCCATAGAGCACCCCAGGGAGGCAGAGGAGGTAATGGATGCAGGGTGTCAAGAATCGGCAGGGCCTGAGAGGATCACAGACCAGGAGGC。

本試劑盒保存于-20℃，盡量減少反復凍融。

一種用于非診斷、治療目的的檢測牛凸隆病毒的熒光RT-PCR方法，包括以下步驟：

(1)樣本RNA的提取：所述樣本RNA可以采用深圳市易瑞生物技術有限公司生產病毒RNA磁珠提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行提取；

(2)以待檢測樣本RNA為模板，采用上述的RT-PCR反應液、酶混合液、內標溶液與待檢測樣本RNA一起配制RT-PCR反應體系，對RNA模板進行擴增，反應條件為：第一階段：50℃15min，95℃2min，1個循環；第二階段：95℃10s，60℃30s，40個循環；第二階段每個循環結束后收集熒光信號；所述熒光探針和內標探針分別對應兩個熒光檢測通道，分別為目標熒光通道和內標熒光通道；

(3)反應結束后，讀取并記錄檢測通道擴增曲線及擴增循環數Ct，根據擴增曲線和擴增循環數進行檢測結果的判斷：當FAM通道和NEX通道均有擴增曲線，且Ct值均≤37，可判定牛凸隆病毒陽性；當FAM通道無擴增曲線，且Ct值顯示為Undet或No Ct，NEX通道有擴增曲線，且Ct值均≤37時可判定牛凸隆病毒陰性；當FAM通道有擴增曲線，但37＜Ct值≤40，NEX通道有擴增曲線，且Ct值均≤37時建議重復一次實驗，如果結果同上，可判定為陽 性，如果無擴增，可判定為陰性；當FAM通道和NEX通道均無擴增曲線，且Ct值顯示為Undet或No Ct，實驗無效、建議更換一批試劑重新實驗。

在本發明的一個優選實施例中，所述RT-PCR反應體系中，RT-PCR反應液18μl、酶混合液1μl、內標溶液1μl、RNA模板5μl。

在本發明的一個優選實施例中，步驟(3)中的分析條件設置如下：根據分析后圖像調節基線(Baseline)的Start值、Stop值以及閾值(Threshold)的Value值(用戶可根據實際情況自行調整，Start值可以在3-15、end值可以在5-20，調整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線)，使儀器給出正確的結果。

在本發明的一個優選實施例中，步驟(3)中的質量控制條件如下：

1).陰性對照：FAM通道無擴增曲線，NEX通道有擴增曲線，且Ct值均≤32；

2).陽性對照：FAM通道和NEX通道均有擴增曲線，且Ct值均≤32；

以上兩個要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需要重新進行實驗。

Ct值(cycle threshold，Ct)的定義為：每個反應管內熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數。閾值的設定一般是將其設定為恰好可以覆蓋住陰性對照和空白對照的熒光值處，因此可以很好的去除反應管熒光值即背景。

本發明可以實現快速、特異的單管檢測樣本中是否含有牛凸隆病毒，與其它檢測技術相比具有以下優點：

1、全封閉反應，實時監控熒光數據，無需后續處理，避免污染，保證檢測結果的可靠性。

2、快速，操作簡單，全程3個小時即可出診斷結果，大大縮短檢測時間。

3、實現單管雙重檢測，同時引入了內標質控，提高了檢測人員的檢測效率，監控抽提效率和排除抑制劑干擾。

4、探針法熒光定量PCR技術特有的優勢，即特異性更強、靈敏度更高，完全滿足牛凸隆病毒流行病學診斷和疫情監控，為降低病死率以及控制疫情爭取時間。

附圖說明

圖1為牛凸隆病毒檢測試劑盒的FAM通道線性實驗數據。圖中S1-S7表示濃度為1.0×10⁹copies/ml、1.0×10⁸copies/ml、1.0×10⁷copies/ml、1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁵copies/ml、1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml的陽性質控品擴增曲線，各3個重復數據，CK為陰性質控品，橫坐標cycle表示擴增循環數，縱坐標△Rn表示熒光強度。通過該圖可以說明該試劑盒的在1.0×10⁹copies/ml至1.0×10³copies/ml之間具有很好的線性關系。

圖2為牛凸隆病毒核酸檢測試劑盒的FAM通道標準曲線示意圖。該試劑盒擬合的線性方程為：Y＝-3.4412x+44.938，相關系數R2＝0.99991，其中Y代表Ct值，x代表陽性參考品的對數值

圖3為牛凸隆病毒檢測試劑盒的檢出限實驗示意圖。其中S6-S8分別為1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml、1.0×10²copies/ml，各20次重復數據，該圖說明該試劑盒的檢測限達到5copies/反應。

圖4為牛凸隆病毒檢測試劑盒的精密度實驗示意圖。其中S4和S6分別為1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁴copies/ml，各10次重復數據。

圖5為牛凸隆病毒檢測試劑盒的特異性實驗數據。圖中橫坐標cycle表示擴增循環數，縱坐標△Rn表示熒光強度，CK代表陰性質控品，A代表BToV陽性質控品FAM通道擴增曲線，B代表內標陽性質控品NEX通道擴增曲線，特異性參考品分別為牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛細小病毒、布魯氏桿菌、牛結核分支桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、糞腸球菌。這8種特異性參考品均未有典型的“S”型擴增曲線，說明該試劑盒特異性良好。

具體實施方式

本發明具有用于檢測牛凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針的試劑盒及檢測方法采用Taqman探針法熒光PCR檢測技術，快速檢測樣品中牛凸隆病毒特有序列，從而判斷樣品中是否存在牛凸隆病毒。下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特色將會隨著描述而更加清楚。這些實施例僅是示范性，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該 理解的是，凡是利用本發明內容所做的等效結構或等效流程變換，直接或間接運用于其他相關技術領域，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。試劑盒在檢測牛凸隆病毒的使用方法即檢測方法，下面以試劑盒為例進行線性實驗、最低檢出限實驗、精密度實驗和特異性實驗。

實施例1試劑盒的線性實驗

目標靶標探針標記為FAM熒光基團，該試劑盒的FAM通道的線性參比品，由含有牛凸隆病毒目的片段的質粒組成，采用TE緩沖液將陽性質粒進行10倍的梯度稀釋得到下列梯度溶液(S1：1.0×10⁹copies/ml、S2：1.0×10⁸copies/ml、S3：1.0×10⁷copies/ml、S4：1.0×10⁶copies/ml、S5：1.0×10⁵copies/ml、S6：1.0×10⁴copies/ml、S7：1.0×10³copies/ml)作為的線性參比品，通過該實驗表明該試劑盒的在1.0×10⁹copies/ml至1.0×10³copies/ml之間具有很好的線性關系，同時該試劑盒擬合的線性方程為：Y＝-3.4412x+44.938，相關系數R2＝0.99991，其中Y代表Ct值，x代表陽性參考品的對數值。實驗結果參考圖1，標準曲線參考圖2。

實施例2試劑盒的最低檢出限實驗

該實驗驗證試劑盒的最低檢出限，采用線性參比品中的S6：1.0×10⁴copies/ml、S7：1.0×10³copies/ml、S8：1.0×10²copies/ml等濃度的陽性質粒作為檢出限參比品，每個濃度進行20個重復樣品，其中檢出限參比品S6和S7全部表現為擴增曲線，為陽性數據，S8參比品僅有9個樣品擴增出S型曲線，不滿足要求，因此通過該實驗表明該試劑盒的檢出限為1.0×10³copies/ml，即達到5copies/反應，實驗結果參考圖3。

實施例3試劑盒的精密度實驗

該實驗驗證試劑盒的批內精密度，采用線性參比品中的S4：1.0×10⁶copies/ml、S6：1.0×10⁴copies/ml等兩個高低濃度的陽性質粒作為精密度參比品，各做10個重復樣本，結果兩個濃度數據變異系數均小于5％，實驗結果參考圖4。

實施例4試劑盒的特異性實驗

該實驗選擇與牛凸隆病毒具有相同感染感染部位的常見病原體作為特異性參考品，采用的是滅活陽性樣本。特異性參考品分別為牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛細小病毒、布魯氏桿菌、牛結核分支桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、糞腸球菌。利用深圳市易瑞生物技術有限公司研發的通用性病毒DNA/RNA提取試劑盒提取以上滅活樣本中的RNA作為模板進行實驗，實驗數據表明這8種特異性參考品均未有典型的“S”型擴增曲線，說明該試劑盒特異性良好，實驗結果參考圖5。