專利名稱：番茄潰瘍病菌分子標準樣品及其制備方法
技術領域：
本發明涉及番茄潰瘍病菌分子標準樣品，另外本發明還涉及其制備方法，屬于植物檢疫技術研究領域。
背景技術：
國內外關于動物病毒及食品微生物標準物質的報道甚多，而植物病原菌的標準物質研究則剛剛起步，很多問題都亟待解決。國內外植物病原菌檢測時多購買美國菌種保藏中心(ATCC)的菌株作為陽性對照，其價格非常昂貴，國內幾乎無法購買到，而植物病原菌分子檢測的分子DNA標準物質鮮見相關研究報道，所以全面深入的研究解決植物病原菌檢測DNA標準樣品的制備技術和穩定性保證技術，積極開展我國植物檢疫性病原菌檢測分子 DNA標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現實意義。
發明內容
本發明的目的是提供番茄潰瘍病菌分子標準樣品，均勻性和穩定性佳，另外本發明還提供其制備方法，工藝簡單，易于操作。本發明番茄潰瘍病菌分子標準樣品，
番茄潰瘍病菌分子標準樣品的制備方法，具體步驟是
(1)番茄潰瘍病菌菌株按常規細菌進行菌株活化、增菌培養，26°c培養24h；
(2)提取番茄潰瘍病菌DNA，采用preman法提取DNA
①取新鮮培養的相應致病菌增菌液ImL于2mL離心管中；
②以13000r/min離心3min，吸棄上清；
③加入100μ L DNA提取液；
④震蕩混勻后(沒有細菌菌塊)沸水浴lOmin，13000r/min離心;3min；
⑤取上清液到1.5mL離心管中保存于-20°C備用。(3)標準樣品的制備
將測定濃度后的DNA按管進行分裝，每種核酸分子標樣分裝150管，然后凍干，即為目的標準品。本發明制得的標準樣品進行定性分析實驗，具體是取制備的核酸標準樣品， 加入50μ1ΤΕ，溶解后作為模板使用，經采用特異性進行PCR并測序，進行定性分析，確認所制備的核酸標準樣品為目的核酸樣品。例
正向弓I物5' -tcattggtcaattctgtctccc-3’ 反向弓I物5，-tactgagatgtttcacttcccc-3， PCR擴增PCR擴增釆用25 μ L體系，如下
權利要求
1.番茄潰瘍病菌分子標準樣品，其特征在于以分離的番茄潰瘍病菌菌株為原料提取高純度DNA，進行分裝、凍干，得到番茄潰瘍病菌的分子標準品，其具有下述的理化性質 (1)形狀純白色粉末狀；(2)每管的含量5士0. 0016Pg ;(3)DNA純度:0D260/280=1. 7 2 ；(4)易溶于水，或TE (Tris-EDTA)緩沖液中。
2.根據權利要求1所述的番茄潰瘍病菌分子標準樣品，其特征在于DNA純度 0D260/280=1.8。
3.番茄潰瘍病菌分子標準樣品及其制備方法，其特征是包括如下步驟(1)番茄潰瘍病菌菌株按常規細菌進行菌株活化、增菌培養，26°C培養24h；(2)提取番茄潰瘍病菌DNA，采用preman法提取DNA；(3)DNA質量及完整性檢測、DNA濃度及純度檢測；(4)標準樣品的制備將測定濃度后的DNA按管進行分裝，然后凍干，即為目的標準品。
4.根據權利要求3所述的番茄潰瘍病菌分子標準樣品及其制備方法，其特征是制備的標準樣品定性鑒定取制備的標準樣品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作為模板使用，經采用特異性引物進行PCR并測序，進行定性分析，確認所制備的核酸標準樣品為目的核酸樣品；正向弓丨物(F) 5' -tcattggtcaattctgtctccc-3，反向弓I物(R) 5' -tactgagatgtttcacttcccc-3，PCR擴增PCR擴增采用25 μ L體系，如下2XPCRMasterMix12. 5μ LPrimers(5 μ Μ)2μ LTemplateIuLddH209. 5μ LTotal25μ LPCR反應參數94 °C預變性3 min，94 °C變性30 s，62. 5 °C退火45 s，72 °C延伸30 s，30個循環，最后72 °C延伸5 min ；按上述條件將該病菌進行特異性引物的PCR擴增，擴增后，可產生片斷250bp左右的片斷，表明該病菌即為番茄潰瘍病菌。
5.根據權利要求3所述的番茄潰瘍病菌分子標準樣品及其制備方法，其特征是所述提取番茄潰瘍病菌DNA，具體步驟是(1)番茄潰瘍病菌菌株按常規細菌進行菌株活化、增菌培養，26°C培養Mh；(2)提取番茄潰瘍病菌DNA，采用preman法提取DNA①取新鮮培養的相應致病菌增菌液ImL于2mL離心管中；②以13000r/min離心3min，吸棄上清；③加入100μ L DNA提取液；④震蕩混勻后(沒有細菌菌塊)沸水浴lOmin，13000r/min離心;3min；⑤取上清液到1.5mL離心管中保存于-20°C備用。
全文摘要
本發明涉及番茄潰瘍病菌分子標準樣品，另外本發明還涉及其制備方法，屬于植物檢疫技術研究領域。番茄潰瘍病菌分子標準樣品，以分離的番茄潰瘍病菌菌株為原料提取高純度DNA，進行分裝、凍干，得到番茄潰瘍病菌的分子標準品，其具有下述的理化性質(1)形狀純白色粉末狀；(2)每管的含量5±0.0016μg；(3)DNA純度OD260/280=1.7～2；(4)易溶于水，或TE(Tris-EDTA)緩沖液中。本發明標準樣品可采用特異性的引物通過PCR方法檢測出，靈敏度達到10-4倍。該標準品可用于進出口檢測中，作為陽性參照物質，提高檢測結果的準確性。
文檔編號C12Q1/68GK102286622SQ20111021969
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月2日 優先權日2011年8月2日
發明者徐鳳敏, 李鑫, 王有福, 蔣維旗 申請人:李鑫, 王有福