專利名稱：甲魚肽的制備方法
技術領域：
本發明涉及甲魚的深加工技術領域，具體涉及一種以甲魚為原料，利用生物復合酶酶解制備甲魚肽的方法。
背景技術：
甲魚又名鱉、團魚，有補血、強骨、抗疲勞、延年益壽之功效，是我國傳統食品，也是開發高級保健食品的良好原料；甲魚的主要營養成分為蛋白質、脂肪、鐵、鈣、動物膠、角質白及多種維生素等。甲魚含有很高的蛋白質，大約每公斤有165克蛋白質，而食物或藥物中的蛋白質一般要被消化液酶解為低聚肽或氨基酸而被機體吸收和利用，因此吸收慢，利用率低，所以也達不到應有的藥效。利用現代生物酶解技術，超濾和薄膜濃縮，噴霧干燥技術處理得到的小分子甲魚低聚肽，可以克服上述問題，使甲魚低聚肽口服能夠更完全和直接被消化道吸收，目前，提取甲魚低聚肽的方法主要有堿液提取法和生物酶解法，前者在提取過程中加入大量的堿處理，既破壞了蛋白質的成分，造成成品苦咸等不良口感，而且對環境造成污染；申請號 201010103157. 9專利文獻中公開了甲魚小分子多肽的制備方法用胰酶在55_60°C酶解 l-4h，在90-95°C保溫10h，降溫至60°C，加入復合蛋白酶酶解l_4h，再經過去油脂，活性炭脫色，真空濃縮，醇沉，高溫滅菌，噴霧干燥得到成品。該方法胰蛋白酶但是成本高，操作流程太長，步驟繁瑣，不適合工業化生產。
發明內容
針對現有技術的酶解液存在腥味，咸味和分子量大，分子量分布不集中，成本高的缺陷，本發明的目的在于提供了一種甲魚肽的提取方法，以甲魚為原料用堿性蛋白酶或用中性蛋白酶酶解，噴霧干燥得到的甲魚肽；本方法操作簡便，口感好，成本低，環保高效，適合工業化大生產。為了實現上述技術目的，本發明采取以下技術措施 一種甲魚肽的制備方法，其步驟如下
1.按原料甲魚的重量的0.2-5%的比率加入堿性蛋白酶，40-70°C恒溫酶解l-10h，或按原料甲魚重量的0. 1-4%的比率加入中性蛋白酶，40-70°C恒溫酶解l-10h，將得到的酶解液升溫至85-120°C，滅酶10-60min，過濾；
2.濾液濃縮，干燥即得到甲魚肽。本發明也可以先把原料甲魚去除內臟和油脂，攪碎，煎煮l-10h，冷卻至40-70°C 后再進行酶解。優選的制備方法如下
1.按原料甲魚的重量的0. 5-3%的比率加入堿性蛋白酶，50-65°C恒溫酶解2_4h，或按原料甲魚重量的0. 5-3%的比率加入中性蛋白酶，50-65°C恒溫酶解2-6h，將得到的酶解液升溫至95-110°C，滅酶20-40min;過濾2.濾液濃縮，噴霧干燥即得到甲魚肽。上述步驟中也可以先把原料甲魚去除內臟和油脂，攪碎，煎煮2_4h，冷卻至 50-65 °C后再進行酶解。更優的方法
1.按原料甲魚的重量的洲的比率加入堿性蛋白酶，60°C恒溫酶解3h，或按原料甲魚重量的21的比率加入中性蛋白酶，60°C恒溫酶解4h，將得到的酶解液升溫至100°C，滅酶 30min;過濾
2.濾液經薄膜濃縮，噴霧干燥即得到甲魚肽。上述步驟中也可以先把原料甲魚去除內臟和油脂，攪碎，煎煮4h，冷卻至60°C后再進行酶解。本品為鱉科動物鱉Trionyx sinensis Wiegmann的全體。與現有技術相比，本發明方法的優點和有益效果如下
1.本發明方法提取的甲魚肽純度高，分子量集中，其中酶解液中分子量在10000-140 道爾頓達到99%以上，其中1000-140道爾頓達到50%以上。2.本發明生產出來的甲魚肽的人體容易吸收。3.本方法避免了調節PH，納濾脫鹽工序，減少了工業成本，改善了成品的風味，提高了肽的得率。4.本發明的生產周期短，操作簡便，成本低，產品質量可靠，安全無毒副作用，可廣泛用于保健品、藥品等領域。
具體實施例方式實施例1
一、制備方法，其步驟如下
1.以中華鱉為原料，選用鮮活甲魚100kg，去除內臟和油脂，攪碎，加入1000L純水， 100°c煎煮 2h；
2.冷卻至60°C，按原料甲魚的重量的21的比率加入堿性蛋白酶^ig，60°C恒溫酶解 3h,或按原料甲魚重量的1%的比率加入中性蛋白酶lkg，55°C恒溫酶解4h，將得到的酶解液升溫至100°C，滅酶30min;過濾
3.濾液濃縮密度1.05-1. 1之間，噴霧干燥即得到11. 64kg粉末甲魚肽。二、甲魚肽含量測定 1.方法提要
低分子量的蛋白質水解物(包含肽類及游離氨基酸)可溶于三氯乙酸溶液；高分子量的蛋白質在三氯乙酸溶液中易沉淀。樣品經三氯乙酸溶液溶解后，離心分離出沉淀蛋白質物質，測定出離心清液中的酸溶蛋白質含量，清液中的酸溶蛋白質含量減去游離氨基酸含量即為肽的含量。2.分析步驟
2.1酸溶蛋白質含量的測定
稱取2g (精確至Img)樣品，加入至IOmL容量瓶中，用15%三氯乙酸溶液定容，混合均勻，靜置lOmin。將樣品溶液在4000rpm下離心IOmin后，取全部清液，按GB/T 5009. 5規定的方法測定清液中的酸溶蛋白質，蛋白質換算系數為6. 25。檢驗結果根據樣品的干燥失重，折算為干基。2.2游離氨基酸含量的測定
樣品前處理稱取20 30mg樣品，精確到0. OOOlg，用3%磺基水楊酸溶液溶解均勻。 將樣品溶液轉移至50ml容量瓶中，定容。將樣品溶液在轉速為4000r/min離心機上離心 5min得清液，再用0. 45 μ m微孔濾膜過濾清液，將濾液轉移至50ml容量瓶中，定容后作為儀器檢測用樣品。其余操作同GB 12292水果、蔬菜汁游離氨基酸含量的測定規定的方法。2. 3結果的表述
肽的含量馬按式(1)計算
S =尸廣 j............................................................ (1)
式中
B1——樣品中肽含量(以干基計)，% ； P1——樣品中酸溶蛋白質含量(以干基計)，% ；
^——樣品中游離氨基酸含量(以干基計)，％。2. 4測定結果
測定成品中肽的含量，結果見表1。表1甲魚肽粉中肽的含量測定結果
樣品甲魚肽肽含量60. 58%3.相對分子質量小于1000的肽所占比例(高效凝膠過濾色譜法) 3. 1方法提要
采用高效凝膠過濾色譜法測定。即以多孔性填料為固定相，依據樣品組分分子體積大小的差別進行分離，在肽鍵的紫外吸收波長220nm條件下檢測，使用凝膠色譜測定相對分子質量分布的專用數據處理軟件(即GPC軟件)，對色譜圖及其數據進行處理，計算得到肽的相對分子質量大小及分布范圍。3. 2 試劑
乙腈色譜純；三氟醋酸分析純；水超純水或二次蒸餾水。相對分子質量校正曲線所用標準品細胞色素C (cyyochrome, MW12500)；抑酞酶 (aprotinin, MW6500)；桿菌酶(bacitracin, MW1450)；乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸 (MW451)；乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸(麗189)。3. 3儀器和設備
高效液相色譜儀配有紫外檢測器和含有GPC數據處理軟件的色譜工作站或積分儀； 流動相真空抽濾脫氣裝置；超聲波振蕩器；分析天平感量0. OOOlgo3. 4色譜條件與系統適應性實驗
色譜柱TSKgel G2000 SffXL 300mmX7. 8mm或性能與此相近的同類型其他適用于測定蛋白質和多肽的凝膠柱；流動相乙腈水三氟乙酸，45:55:0. 1 (體積比)檢測波長 UV220nm ；流速0. 5ml/min ；柱溫:30°C ；進樣體積10μ 1。為使色譜系統符合檢測要求，規定在上述色譜條件下，凝膠色譜柱的柱效即理論塔板數(N)按三肽標準品(乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸)峰計算不低于5000，低聚肽的分配系數(Kd)應在0 1之間。3. 5相對分子質量校正曲線制作
分別用流動相配制成0. 1% (w/ν)的上述不同相對分子質量的肽標準品溶液，用孔徑為 0. 2-0. 5μπι聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾后分別進樣，得到系列標準品的色譜圖。以相對分子質量的對數(IgMW)對保留時間作圖或作線性回歸得到相對分子質量校正曲線及其方程。3. 6樣品制備
稱取樣品20. Omg于IOmL容量瓶中，用流動相定容至刻度，超聲振蕩lOmin，使樣品充分溶解混勻，用孔徑為0. 2-0. 5μπι聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾后，上機進樣。3. 7相對分子質量的計算
將3. 6制備的樣品溶液在上述色譜條件下分析。然后用GPC數據處理軟件，將樣品的色譜數據代入校正曲線方程中進行計算，即可得到樣品中肽的相對分子質量及其分布范圍。用峰面積歸一化法計算相對分子質量范圍在1000以下的肽的峰面積相對百分比之和。3. 8測定結果
甲魚肽分子量分布范圍測定結果見表6，7。表2甲魚肽結果
權利要求
1.一種甲魚肽的制備方法，包括原料甲魚酶解、濃縮、干燥，其特征在于用堿性蛋白酶或中性蛋白酶酶解。
2.根據權利要求1所述的甲魚肽的制備方法，其特征在于堿性蛋白酶加入量為原料甲魚重量的0. 2-5%，酶解時間為I-IOh ；或中性蛋白酶加入量為原料甲魚重量的0. 1-4%，酶解時間為I-IOh ；酶解后酶解液升溫至85-120° C，滅酶10-60min。
3.根據權利要求2所述的甲魚肽的制備方法，其特征在于堿性蛋白酶加入量為原料甲魚重量的0. 5-3%，酶解時間為2-4h ；或中性蛋白酶加入量為原料甲魚重量的0. 5-3%，酶解時間為2-4h ；酶解后酶解液升溫至95-110° C，滅酶20-40min。
4.根據權利要求3所述的甲魚肽的制備方法，其特征在于堿性蛋白酶加入量為原料甲魚重量的洲，酶解時間為池；或中性蛋白酶加入量為原料甲魚重量的洲，酶解時間為4h ； 酶解后酶解液升溫至100° C，滅酶30min。
全文摘要
本發明的目的在于提供了一種甲魚肽的提取方法，以甲魚為原料用堿性蛋白酶或用中性蛋白酶酶解，堿性蛋白酶加入量為原料甲魚重量的0.2-5%，中性蛋白酶加入量為原料甲魚重量的0.1-4%，酶解時間為1-10h，酶解后酶解液升溫至85-120°C，滅酶10-60min，噴霧干燥得到甲魚肽；本方法操作簡便，口感好，成本低，環保高效，適合工業化大生產。
文檔編號C12P21/06GK102286588SQ20111023629
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月18日 優先權日2011年8月18日
發明者劉根云, 盧建中, 易敏之, 鐘虹光, 馬莉 申請人:江中藥業股份有限公司