專利名稱：Dreb基因轉化紅掌的遺傳轉化方法
技術領域：
本發明屬于分子育種領域，涉及DREB基因轉化紅掌的遺傳轉化方法。
背景技術：
紅掌為天南星科花燭屬多年生草本植物，原產哥倫比亞南部，是世界名貴花卉。紅掌具有艷麗的佛艷苞，花期長、周年開花、葉片蠟質，是觀葉觀花俱佳的室內觀賞植物。紅掌夜間生長適溫在18-20°C，白天為25°C左右。在夏季，如夜間室溫度超過25°C或白天室內溫度超過30°C時，而在冬季，如夜間室溫度低于12°C或白天室溫度低于18°C時，則會出現葉片失去光澤、發黃，佛艷苞花期變短，易枯萎，還會引起葉腐病，嚴重影響其生長和觀賞價值。為此，在夏季期必須采取人為降溫措施，而在冬季則必須人為進行加溫，使得室內溫度適宜紅掌的生長，然而降溫和加溫都顯著地增加了紅掌生產成本。因此，篩選、培育耐高溫和低溫的紅掌新品種有著巨大的實用價值和經濟意義。近年來，隨著植物基因工程的發展，分子育種克服了常規育種的種種限制，為利用新的基因資源改良紅掌品種提供了新的手段和途徑。農桿菌介導法以其操作簡單，費用低， 效率高，插入DNA片段大，穩定性好，轉基因拷貝數低等優點，已成為轉基因策略中的首選方法。DREB轉錄因子作為一類在植物抵抗非生物脅迫中起關鍵作用的轉錄因子家族，以其能夠激活多個功能基因的表達，從而提高植物綜合抗性的優點成為研究的熱點，在植物抗逆分子育種中具有巨大的潛在利用價值。近年來，通過導入DREB基因來改良作物的抗逆性，已經在油菜、煙草、番茄、小麥和菊花等作物中獲得成功，但利用DREB基因轉化紅掌的研究還未見報道。主要原因是紅掌的遺傳轉化極易受到各種因素影響，例如愈傷組織的預培養時間、農桿菌的侵染時間、愈傷組織與農桿菌的共培養時間及抑菌培養時間等等，這些因素直接影響著紅掌的轉化成功率。因此，系統深入研究其遺傳轉化條件，建立專門針對紅掌的遺傳轉化體系，可為紅掌分子育種工作提供理論基礎和實驗依據，有效推進紅掌分子育種進程。
發明內容
本發明的目的是提供DREB基因轉化紅掌的遺傳轉化方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現DRB基因轉化紅掌的遺傳轉化方法，包括如下步驟1)無菌愈傷組織的獲得取紅掌組培苗，切取帶有一對葉的紅掌莖尖，在繼代培養基1/2MS+6-BA 1. Omg/ L+IBAO. lmg/L上誘導愈傷組織，40天后挑選大小一致的愈傷組織，將愈傷組織表層去掉后切割成片狀，接種于MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L誘導培養基；2)農桿菌懸浮液制備中將插入目的基因DREB的重組質粒pCAMBIA1301-DREBa采用液氮冷凍法轉化農桿菌LBA4404感受態細胞，取經酶切驗證含有所述重組質粒pCAMBIAl301-DREBa的農桿菌 LBA4404-DREBa菌液制備農桿菌LBA4404_DREBa懸浮液，用于下一步的遺傳轉化；3)遺傳轉 化選取步驟1)中在MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L誘導培養基中誘導45天大小一致的愈傷組織，切除分化的芽點，在相同的誘導培養基中預培養7天，溫度為26士2°C， 光照時間為16h/d;然后將愈傷組織在步驟2)制備的農桿菌LBA4404-DREBa懸浮液中侵染lOmin，用濾紙吸干愈傷組織表面菌液后將其轉入墊有濾紙的誘導培養基中在溫度為 26士2°C、黑暗條件下共培養 3 天；之后轉入 MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+Cef 400mg/ L+AS lOOymg/L培養基中抑菌培養5天，溫度為26 士 2°C，光照時間為16h/d;再轉入 MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+Cef 400mg/L+Hyg 20mg/L 篩選培養基中進行抗性篩選 6 個月，溫度26士2°C，光照時間為16h/d，具有潮霉素抗性的愈傷組織將長出不定芽點；4)抗性愈傷組織篩選切取步驟3)中經抗性篩選得到的帶有不定芽點的愈傷組織塊轉入不加抗生素的再生培養基MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 1. 0mg/L上，在溫度為26士2°C，光照時間為16h/d 的條件下培養，待不定芽長至2. 0-3. Ocm時，切下不定芽轉入生根篩選培養基1/2MS+IBA 0. lmg/L+Hyg 7mg/L中培養，獲得具有潮霉素抗性的生根苗，將生根苗轉入1/2MS+IBA 0. lmg/L培養基中正常生根；5)轉基因植株的獲得待步驟4)得到的具有潮霉素抗性的植株長出8-10片葉時，取其嫩葉，采用CTAB 法提取基因組DNA，，設計并合成SEQ ID No. 3所示的正向引物Hyg-F和SEQ ID No. 4所示的反向引物Hyg-R，以抗性植株的DNA為模板，進行PCR擴增，PCR鑒定結果能夠擴增出950bp 條帶的抗性植物為轉入目的基因DREBa成功的轉基因紅掌植株。其中，所述的重組質粒pCAMBIAl301-DREBa通過如下方法構建①DRraa基因克隆以菊花品種‘鐘山紅楓，RNA為模板，以SEQ ID No. 1所示的正向引物DREBa-F禾口 SEQ IDNo. 2所示的反向引物DREBa-R進行RT-PCR擴增合成DREBa基因的cDNA開放閱讀框 0RF，用瓊脂糖凝膠電泳回收純化長度為872bp的RT-PCR目的產物片段，與T-載體連接后轉化大腸桿菌DH5ci感受態，進行LB+50mg/L氨芐青霉素平板培養，培養條件為37°C，16h， 挑取白色克隆接種于LB培養基進行液體培養，培養條件為37°C，16h，提取含有DREBa基因片段的T-載體質粒，測序驗證，DREBa基因的cDNA開放閱讀框ORF序列如SEQ ID No. 5所示。②pCAMBIAl301-DREBa植物表達載體構建ffiBamH I和Kpn I雙酶切連接了 DREBa基因的T-載體，電泳回收目的片段，與用 BamH I和Kpn I雙酶切過的植物表達載體pCAMBIA 1301連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態， 挑取陽性克隆接種于LB培養基進行液體培養，培養條件為37°C，16h，提取質粒，經BamHI和 KpnI雙酶切鑒定得到pCAMBIAl301-DREBa重組質粒。所述的農桿菌LBA4404_DREBa懸浮液的通過如下方法制備將農桿菌 LBA4404-DREBa菌液于YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平固體培養基劃板培養，培養條件為28°C，48h，挑取單克隆接種于30ml YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平液體培養基震蕩培養，培養溫度為28°C，震蕩速度200r/min，至農桿菌LBA4404_DREBa長至對數生長期即OD6qq為0. 5時，將LBA4404-DRE Ba菌液倒入無菌離心管中，4000rpm離心lOmin，收集菌體沉淀，用等量30ml MS液體培養基重懸，備用。步驟1)中切割為片狀的愈傷組織的大小優選為0. 3 0. ScmXO. 3 0. 8cmX0. 1 0. 3cm。有益效果1.本發明針對根癌農桿菌介導的紅掌轉基因存在的基因型依賴性強、轉化頻率低、轉化后外植體再生困難、重復性差、轉化細胞不易成苗等問題，專門對DREB基因轉化紅掌的遺傳轉化條件進行了系統深入研究，提供了一套適用于紅掌的DREB基因遺傳轉化體系，為紅掌分子育種奠定基礎。2.遺傳轉化體系建立，對影響遺傳轉化的條件如預培養時間、農桿菌侵染時間、共培養時間、抑菌培養時間進行了考察，獲得了最佳遺傳轉化組合預培養時間分別為0、3、 5、7天，試驗結果表明7天的愈傷成活率最高；農桿菌侵染時間分別為5、10、15、20分鐘， 試驗結果表明10分鐘時浸染效果最佳；紅掌愈傷組織與農桿菌共培養時間分別為1、2、3、 5天，試驗結果表明3天時成活率最高；抑菌培養時間分別為1、3、5、7、9天，試驗結果表明 5天時抑菌效果最佳。因此，理想的遺傳轉化體系中預培養時間為7天，農桿菌侵染時間為 10分鐘，紅掌愈傷組織與農桿菌共培養時間為3天，抑菌培養時間為5天。3.在篩選方式上，針對紅掌對篩選抗生素(潮霉素)敏感的問題，采用了高選擇壓長時間篩選抗性芽點，無選擇壓恢復抗性芽分化和生長，再高選擇壓篩選抗性不定芽并結合生根篩選的多次篩選方法，取得了較好效果，提高了轉化體再生率。4.在抑菌培養方法上，基于抑菌抗生素(頭孢霉素)對紅掌愈傷組織再生的強烈抑制作用，經篩選確定了遺傳轉化中使用的最適抑菌抗生素(頭孢霉素)濃度以抑制農桿菌過度生長，在有效抑制農桿菌滋生的同時獲得較高的轉化體再生率。
圖1紅掌外植體類型對愈傷組織誘導的影響A.誘導莖段產生的愈傷組織；B.誘導葉柄產生的愈傷組織；C.誘導葉片產生的愈傷組織。圖2不同激素濃度與組合對紅掌莖段愈傷組織誘導的影響A. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L IBA ；B. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA ； C. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA。圖3不同濃度IBA對紅掌莖段愈傷組織誘導的影響A. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. 05mg/L IBA ；B. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L IBA ； C. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. 15mg/L IBA。圖4不同濃度潮霉素對紅掌愈傷組織分化和芽再生的影響A Omg/L 潮霉素；B :5mg/L 潮霉素；C 1 Omg/L 潮霉素；D :20mg/L 潮霉素；E :30mg/L 潮霉素；F :50mg/L 潮霉素。圖5紅掌轉基因的過程A 預培養；B/C/D 抗性芽生長的過程。
具體實施例方式實施例1無菌愈傷組織的獲得1)外植體選擇采用莖段、葉片、葉柄在繼代培養基1/2MS+6-BA1. 0mg/L+IBA0. lmg/L上誘導愈傷組織，40天后供實驗用。培養條件為溫度24 26°C，光照強度40 μ mol ·πΓ2 .s—1，12h/12h 光暗交替。結果莖段作為外植體進行組織培養芽誘導率最高，最為成功(表1，圖1)。表1 不同外植體對紅掌的愈傷誘導
權利要求
1.DREB基因轉化紅掌的遺傳轉化方法，其特征在于包括如下步驟1)無菌愈傷組織的獲得取紅掌組培苗，切取帶有一對葉的紅掌莖尖，在繼代培養基1/2MS+6-BA 1. Omg/ L+IBAO. lmg/L上誘導愈傷組織，40天后挑選大小一致的愈傷組織，將愈傷組織表層去掉后切割成片狀，接種于MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L誘導培養基；2)農桿菌懸浮液制備中將插入目的基因DREB的重組質粒pCAMBIAl301-DREBa采用液氮冷凍法轉化農桿菌LBA4404感受態細胞，取經酶切驗證含有所述重組質粒pCAMBIAl301-DREBa的農桿菌 LBA4404-DREBa菌液制備農桿菌LBA4404_DREBa懸浮液，用于下一步的遺傳轉化；3)遺傳轉化選取步驟1)中在MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L誘導培養基中誘導45天大小一致的愈傷組織，切除分化的芽點，在相同的誘導培養基中預培養7天，溫度為26士2°C，光照時間為16h/d ；然后將愈傷組織在步驟2)制備的農桿菌LBA4404-DREBa懸浮液中侵染lOmin，用濾紙吸干愈傷組織表面菌液后將其轉入墊有濾紙的誘導培養基中在溫度為26士2°C、黑暗條件下共培養 3 天；之后轉入 MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+Cef 400mg/L+AS 100 μ mg/L 培養基中抑菌培養5天，溫度為26士2°C，光照時間為16h/d ；再轉入MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+Cef 400mg/L+Hyg 20mg/L篩選培養基中進行抗性篩選6個月，溫度26士2°C，光照時間為16h/d，具有潮霉素抗性的愈傷組織將長出不定芽點；4)抗性愈傷組織篩選切取步驟3)中經抗性篩選得到的帶有不定芽點的愈傷組織塊轉入不加抗生素的再生培養基MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 1. 0mg/L上，在溫度為26士2°C，光照時間為16h/d的條件下培養，待不定芽長至2. 0-3. Ocm時，切下不定芽轉入生根篩選培養基1/2MS+IBA 0. Img/ L+Hyg 7mg/L中培養，獲得具有潮霉素抗性的生根苗，將生根苗轉入1/2MS+IBA 0. lmg/L培養基中正常生根；5)轉基因植株的獲得待步驟4)得到的具有潮霉素抗性的植株長出8-10片葉時，取其嫩葉，采用CTAB法提取基因組DNA，，設計并合成SEQ ID No. 3所示的正向引物Hyg-F和SEQ ID No. 4所示的反向引物Hyg-R，以抗性植株的DNA為模板，進行PCR擴增，PCR鑒定結果能夠擴增出950bp條帶的抗性植物為轉入目的基因DREBa成功的轉基因紅掌植株。
2.根據權利要求1所述的DREB基因轉化紅掌的遺傳轉化方法，其特征在于所述的重組質粒pCAMBIAl301-DREBa通過如下方法構建①DREBa基因克隆以菊花品種‘鐘山紅楓，RNA為模板，以SEQ ID No. 1所示的正向引物DREBa-F和SEQ IDNo. 2所示的反向引物DREBa-R進行RT-PCR擴增合成DREBa基因的cDNA開放閱讀框0RF， 用瓊脂糖凝膠電泳回收純化長度為872bp的RT-PCR目的產物片段，與T-載體連接后轉化大腸桿菌DH5 α感受態，進行LB+50mg/L氨芐青霉素平板培養，培養條件為37°C，16h，挑取白色克隆接種于LB培養基進行液體培養，培養條件為37°C，16h，提取含有DREBa基因片段的T-載體質粒，測序驗證，DREBa基因的cDNA開放閱讀框ORF序列如SEQ ID No. 5所示；②pCAMBIAl301-DREBa植物表達載體構建用BamH I和Kpn I雙酶切連接了 DREBa基因的T-載體，電泳回收目的片段，與用BamH I和Kpn I雙酶切過的植物表達載體pCAMBIA 1301連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態，挑取陽性克隆接種于LB培養基進行液體培養，培養條件為37°C，16h，提取質粒，經BamH I和 KpnI雙酶切鑒定得到pCAMBIAl301-DREBa重組質粒。
3.根據權利要求1所述的DREB基因轉化紅掌的遺傳轉化方法，其特征在于所述的農桿菌LBA4404-DREBa懸浮液的通過如下方法制備將農桿菌LBA4404_DREBa菌液于 YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平固體培養基劃板培養，培養條件為28 V，48h，挑取單克隆接種于30ml YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平液體培養基震蕩培養，培養溫度為 28°C，震蕩速度200r/min，至農桿菌LBA4404_DREBa長至對數生長期即OD6tltl為0. 5時，將 LBA4404-DREBa菌液倒入無菌離心管中，4000rpm離心lOmin，收集菌體沉淀，用等量30ml MS液體培養基重懸，備用。
4.根據權利要求1所述的DREB基因轉化紅掌的遺傳轉化方法，其特征在于步驟1)中切割為片狀的愈傷組織的大小為0. 3 0. 8cmX0. 3 0. 8cmX0. 1 0. 3cm。
全文摘要
本發明屬于分子育種領域，公開了DREB基因轉化紅掌的遺傳轉化方法。該方法是將紅掌無菌愈傷組織切開后用含有重組質粒pCAMBIA1301-DREBa的農桿菌液侵染10min，共培養3d、抑菌培養5d、篩選培養獲得具潮霉素抗性的生根苗。經PCR檢測證實外源基因已轉入紅掌基因組DNA中。本發明首次針對紅掌建立了其遺傳轉化體系，為紅掌分子育種工作提供了理論基礎和實驗依據，將有效推動其分子育種進程。
文檔編號C12N15/66GK102286527SQ20111025270
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優先權日2011年8月30日
發明者劉兆磊, 房偉民, 滕年軍, 蔣甲福, 陳發棣, 陳琳, 陳素梅, 陶清良 申請人:南京農業大學