專利名稱：強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法
技術領域：
本發明屬于酶法合成食品添加劑領域，具體涉及一種強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法。
背景技術：
現有技術異槲皮苷(Isoquercitrin)，即槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖苷 (Quercetin-3-glucose)，是自然界中非常罕見的一種具有顯著的抗氧化性、抗腫瘤等生物活性的黃酮類化合物，是國際上各大醫藥食品公司競相開發的高級食品添加劑、輔助藥物或藥物有效成分，也是國際上新型多功能食品添加劑EMIQ(EnZymatiCally Modified Isoquercitrin)的合成原料(Toxicology, 2010, 268 (3) :213-218)。專利CN 101985639A介紹了異槲皮苷的制備方法主要有提取法和水解法兩種 (1)異槲皮苷在自然界中的分布較少，其含量僅有幾萬分之一甚至是十萬分之幾，直接從自然界植物中提取難以制備異槲皮苷；( 酸催化水解法的水解溫度較高，使用的酸對設備腐蝕嚴重，并產生大量的酸性廢水，且蘆丁的水解過程中槲皮素和異槲皮苷共存，必須對水解產物采用分離手段才能獲得異槲皮苷(African Journal of Biotechnology, 2011, 10(8) :1460-1466)。因此，以酶促水解蘆丁公認是制備異槲皮苷的有效途徑。即，以自然界分布廣泛、來源豐富的蘆丁為原料，經糖苷酶催化水解反應制備異槲皮苷，建立生物轉化蘆丁定向合成異槲皮苷的酶促水解工藝是今后規模化制備異槲皮苷的唯一選擇。令人遺憾的是，生物合成異槲皮苷目前尚未實現工業化大規模應用，原因在于蘆丁等大多天然糖苷底物溶解性差和α-L-鼠李糖苷酶活力較低等產業化難題。傳統以水為溶劑的中糖苷酶催化的活力十分有限，而非水相介質具有顯著增強酶催化效率的能力 (Bioprocess and Biosystems Engineering. 2009,32(6) :765-772)，如在水為介質的糖苷酶催化反應體系中添加共溶劑(Cosolvent)、表面活性劑(Surfactant)等改變反應介質理化性質的途徑來增強酶促合成異槲皮苷的效率，即介質工程(Medium Engineering)手段改變反應介質與優化反應參數來強化異槲皮苷的生物合成過程。在糖苷酶催化反應中，一般只有與酶分子緊密結合的一層左右的必需水 (Essential Water)分子對酶的催化活性是至關重要的。不同酶與必需水結合的緊密程度及所結合的必需水數量是不相同的，并且對產物產生一些影響。有些情況下，在反應體系中加入適當的添加劑代替必需水，也有助于提高酶的柔性(Flexibility)，從而提高酶的立體選擇性。特別是，添加適當的共溶劑或(和)表面活性劑的方法改變反應介質的理化性質， 從而對酶促反應過程進行調控和強化。合適的共溶劑、表面活性劑添加到酶促反應體系， 可以提高底物在反應體系中的溶解度，也可以促使酶具有更加嚴密的構型，具體表現在熱穩定性的提高和對底物選擇性的增強(Journal of Molecular Catalysis B =Enzymatic, 1996,3-6(1) :201-211 ；Bioresource Technology,2011,102(3) :2890-2896)。因此，本專利在酶促合成異槲皮苷的體系中添加共溶劑或表面活性劑來強化合成效率，該方法操作簡便，反應條件溫和，產物得率高，對環境友好，從而可以克服傳統糖苷酶催化合成效率較低和底物溶解度較低的缺點，易于工業化生產高純度異槲皮苷，為推動其在醫藥、食品、化妝品等工業中的廣泛應用具有十分重要的意義。
發明內容
技術問題針對現有技術中所述的不足，本發明提供了一種強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法。該方法在酶促合成異槲皮苷的體系中添加共溶劑或表面活性劑，可大大強化合成效率。技術方案一種強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，包括酶促合成異槲皮苷的體系，該體系包括溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的蘆丁母液，蘆丁母液中含有α -L-鼠李糖苷酶液，上述體系中添加有共溶劑或表面活性劑，其中共溶劑的體積濃度為1 20%，表面活性劑的體積濃度為0. 01 10%。配制蘆丁母液的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液濃度為0. 01 lmol/L。配制蘆丁母液的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液PH值為5 9。所述蘆丁母液的濃度為0. 01 lg/L。所述蘆丁母液中按體積比1 50%加入α -L-鼠李糖苷酶液。所述蘆丁母液中加入α -L-鼠李糖苷酶液的濃度為0. 1 100g/L。所述共溶劑包括醇類、酯類、酮類、鹵代烴和雜環化物，所述醇類為甲醇、乙醇或正丁醇，所述酯類為乙酸乙酯、乙酸丁酯或丙酸乙酯，所述酮類為丙酮或丁酮，所述鹵代烴為一氯甲烷、二氯甲烷或氯仿，所述雜環化物為四氫呋喃、二甲基亞砜、吡啶或呋喃。所述表面活性劑包括陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑或非離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑為硬脂酸、十二烷基苯磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉，所述陽離子表面活性劑為季銨化物，所述兩性離子表面活性劑為卵磷脂、氨基酸型或甜菜堿型，所述非離子表面活性劑為脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯或對聚十 (氧乙烯)特-辛基酚。所述蘆丁酶促反應溫度范圍為10 60°C，振蕩轉速范圍為50 200r/min，反應時間范圍為1 48h。(1)在酶促合成異槲皮苷的體系中添加共溶劑以0. 01 lmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制pH = 5 9的0. 01 lg/L 的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比1 50%加入0. 1 100g/L α -L-鼠李糖苷酶液，加入共溶劑至體積濃度為1 20%，在10 60°C、50 200r/min條件下振蕩反應1 48h。 反應結束后，HPLC檢測結果表明共溶劑可大大強化酶活及產物轉化率。(2)在酶促合成異槲皮苷的體系中添加表面活性劑以0. 01 lmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制pH = 5 9的0. 01 lg/L 的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比1 50%加入0. 1 100g/L α -L-鼠李糖苷酶液，加入表面活性劑至濃度為0. 01 10%，在10 60°C、50 200r/min條件下振蕩反應1 48h。反應結束后，HPLC檢測結果表明表面活性劑可大大強化酶活及產物轉化率。有益效果在酶促合成異槲皮苷的體系中添加共溶劑或表面活性劑來強化合成效率，該方法反應條件溫和，產物得率高，對環境友好，克服了傳統糖苷酶催化合成效率較低和底物溶解度較低的缺點，易于工業化生產高純度異槲皮苷。此外，整個酶促反應工藝基本上無廢棄物產生，無環境污染，具有非常良好的工業化應用前景，可以滿足迅速發展的醫藥工業和日化工業的需要。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。本發明實施例中使用同時檢測蘆丁和異槲皮苷的測定方法為高效液相色譜法，色譜條件Alltima Cw Q50mmX 4. 6mm，5 μ m)，流動相0. 02%磷酸-乙腈(80 20, ν/ν)；檢測波長:360nm ；流速1. OmL/min ；進樣量20 μ L。其中，產物異槲皮苷的轉化率計算方法為
權利要求
1.一種強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，包括酶促合成異槲皮苷的體系，該體系包括溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的蘆丁母液，蘆丁母液中含有α -L-鼠李糖苷酶液，其特征在于上述體系中添加有共溶劑或表面活性劑，其中共溶劑的體積濃度為1 20%，表面活性劑的體積濃度為0. 01 10%。
2.根據權利要求1所述的強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，其特征在于配制蘆丁母液的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液濃度為0. 01 lmol/L。
3.根據權利要求1所述的強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，其特征在于配制蘆丁母液的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液PH值為5 9。
4.根據權利要求1所述的強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，其特征在于蘆丁母液的濃度為0. 01 lg/L。
5.根據權利要求1所述的強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，其特征在于在蘆丁母液中按體積比1 50%加入α -L-鼠李糖苷酶液。
6.根據權利要求1所述的強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，其特征在于在蘆丁母液中加入α -L-鼠李糖苷酶液的濃度為0. 1 100g/L。
7.根據權利要求1所述的強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，其特征在于所述共溶劑包括醇類、酯類、酮類、鹵代烴和雜環化物，所述醇類為甲醇、乙醇或正丁醇，所述酯類為乙酸乙酯、乙酸丁酯或丙酸乙酯，所述酮類為丙酮或丁酮，所述鹵代烴為一氯甲烷、二氯甲烷或氯仿，所述雜環化物為四氫呋喃、二甲基亞砜、吡啶或呋喃。
8.根據權利要求1所述的強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，其特征在于所述表面活性劑包括陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑或非離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑為硬脂酸、十二烷基苯磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉，所述陽離子表面活性劑為季銨化物，所述兩性離子表面活性劑為卵磷脂、氨基酸型或甜菜堿型，所述非離子表面活性劑為脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯或對聚十(氧乙烯)特-辛基酚。
9.根據權利要求1所述的強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，其特征在于蘆丁酶促反應溫度范圍為10 60°C，振蕩轉速范圍為50 200r/min，反應時間范圍為1 48h。
全文摘要
強化酶法合成異槲皮苷的介質工程方法，在反應體系中添加共溶劑或表面活性劑改變反應介質的理化性質，提高底物在反應介質中的溶解度，提高酶的熱穩定性及其對底物的立體選擇性。該方法操作簡便，反應條件溫和，產物得率高，對環境友好，克服了傳統糖苷酶催化合成效率較低和底物溶解度較低的缺點，有利于工業化生產高純度異槲皮苷。
文檔編號C12P19/60GK102286576SQ20111026996
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月14日 優先權日2011年9月14日
發明者吳福安, 張旭東, 王俊, 許晏 申請人:江蘇科技大學