專利名稱：一種大腸菌群的顯色培養基及其快速檢測卡的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物檢驗領域，涉及微生物顯色培養基，還涉及用顯色培養基制作的快速檢測卡。
背景技術：
大腸菌群作為食品衛生質量的重要指標之一，一方面能反映被檢測物有無糞便污染，根據數量多少判斷樣品被污染程度，另外一方面在一定程度上反映了食品在生產、加工、運輸、保存等過程的衛生狀況，所以具有廣泛的微生物意義。目前國內采用的進出口食品大腸菌群檢測方法有好多種，中華人民共和國食品安全國家標準大腸菌群計數4789. 3-2010中規定有兩種方法MPN計數法和平板計數法。其中MPN計數法基本等效于美國FDA的標準方法的兩步法推測實驗-證實實驗，相比之前的三步法乳糖發酵試驗-分離培養-證實試驗，實驗步驟已經簡化了許多。平板計數法相對比較簡單，選擇培養-證實實驗。兩種檢測方法都采用的發酵管法檢測，實驗前期需要做大量的準備工作，對實驗室的要求也比較高，另外試驗后也有大量的處理和清洗工作，浪費大量的人力和無力，而且檢測效率不高，一個樣品要2 4天才能出報告，影響了產品的流通。CN1093409A、CN1483835A.CN101013127A公開的大腸菌群檢測卡或者紙片都是利用了大腸菌群產酸使PH指示劑變色的原理對樣品中大腸菌群進行檢驗。目前市場上還有美國petrif ilm測試片法，該測試片含有改良的VRB培養基、冷水可溶膠和PH指示劑可增強菌落技術效果，大腸菌群菌落在測試片上生長產酸，PH指示劑使培養基顏色變深，在紅色菌落周圍有氣泡者，為大腸菌群細菌。該測試片檢測靈敏度較高，但是檢測結果容易受樣品酸堿度的影響，因此樣品稀釋處理后必須進行酸堿調節后才可以加樣，另外該測試片成本相對較高，一般的基層單位和食品企業根本無法負擔。CN1796568A公開的快速檢測大腸菌群和大腸桿菌的培養基，是利用微生物培養過程中產生的特異性酶與顯色底物反應而顯色的原理檢測大腸菌群和大腸桿菌。培養基中有兩個特異性酶底物，一個是4-甲基傘形酮- β -D-半乳糖苷被大腸菌群特有的β -D-半乳糖苷酶所分解，游離出來的4-甲基傘形酮基團，在366mm紫外燈下產生熒光從而表面檢樣中存在大腸菌群，另外一個底物吲哚酚-β -D-葡萄糖苷被大腸桿菌特有的β -D-葡萄糖苷酶分解后產生不溶性的靛藍色沉淀，從而表明檢樣中存在大腸桿菌，大腸菌群數和大腸桿菌數總和為檢樣中總大腸菌群數。該檢驗方法檢測大腸桿菌造作簡單且便于觀察，但是大腸菌群數觀察必須在紫外燈下觀察產生熒光菌的落數，結果觀察相對比較麻煩，而且工作人員長期在紫外燈下工作對身體特別是視力副作用特別大，一定程度上限制了該培養基的推廣和應用。
發明內容
本發明的目的是為了提供一種大腸菌群的顯色培養基及其快速檢測卡。本發明解決其技術問題的解決方案是一種大腸菌群的顯色培養基，每IOOOmL培養基含有蛋白胨5 50g，酵母浸出物3 50g，乳糖1 25g，氯化鈉2 15g，丙酮酸鈉0. 1 5g，SDS 0. 01 0. 5g，磷酸二氫鈉0. 1 4g，特異性酶顯色底物0. 001 2g，異丙基- β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 0. 001 2g。優選的，每IOOOmL培養基含有蛋白胨5 25g，酵母浸出物3 12. 5g，乳糖1 IOg,氯化鈉2. 5 6. 5g，丙酮酸鈉0. 1 lg, SDS 0. 05 0. 3g，磷酸二氫鈉0. 2 2g，特異性酶顯色底物0. 05 Ig,異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 0. 05 lg。優選的，特異性酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷。一種大腸菌群快速檢測卡，其結構由下至上依次為底片、吸水保濕層、培養基層、 蓋膜，培養基層上吸附有上述的培養基。優選的，培養基層是由吸附有培養基的吸水濾紙構成。優選的，吸水濾紙由天然纖維素材料、半合成材料或全合成材料制成。優選的，吸水保濕層含有瓜爾膠、卡拉膠、瓊脂粉、聚丙烯酸樹脂、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、辛烯酸琥珀酸樹脂、海藻酸鈉中的一種或者幾種組合物。優選的，吸水保濕層由瓜爾膠、聚丙烯酸樹脂、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉組成，其質量比為5:25:5:65。優選的，底片由合成紙或聚酯材料制成。優選的，蓋膜由聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯膜材料制成。本發明的有益效果是
本發明是根據近年來發展起來的酶觸顯色原理研制而成，能對飲用水、地表水、或食品中的大腸菌群進行檢測；特別添加了半乳糖苷酶誘導劑，使大腸菌群細菌在短時間內分泌出大量的半乳糖苷酶，與培養基中的顯示底物發生特異性反應，大大縮短檢測時間，提高了檢測效率；本發明既能對大腸菌群進行定性檢測，又同時可進行定量分析，陽性結果顯色明顯且觀察方便，減少假陽性和假陰性出現的幾率，檢測結果準確。本發明用大腸菌群顯色培養基制作的快速檢測卡，其操作簡便、靈敏度高、結果準確、成本低、實用快速、所產生的垃圾僅僅是紙片，可以減少環境污染。
圖1是大腸菌群快速檢測卡結構示意圖； 圖2是I號平板的大腸桿菌檢測圖3是I號檢測卡的大腸桿菌檢測圖； 圖4是II號平板的大腸桿菌檢測圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。一種大腸菌群的顯色培養基，每IOOOmL培養基含有蛋白胨5 50g，酵母浸出物 3 50g,乳糖1 25g，氯化鈉2 15g，丙酮酸鈉0. 1 5g，SDS 0. 01 0. 5g，磷酸二氫鈉 0. 1 4g，特異性酶顯色底物0. 001 2g，異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)0. 001 2g。優選的，一種大腸菌群的顯色培養基，每IOOOmL培養基含有蛋白胨5 25g，酵母浸出物3 12. 5g，乳糖1 IOg,氯化鈉2. 5 6. 5g，丙酮酸鈉0. 1 lg, SDS 0. 05 0. 3g，磷酸二氫鈉0. 2 2g，特異性酶顯色底物0. 05 lg，異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 0. 05 lg。優選的，特異性酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷。本發明利用大腸菌群特異性酶——半乳糖苷酶與顯色底物反應的原理，在檢測卡上加入特異性酶顯色底物，如5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷，當培養物中有大腸菌群時，其特有的半乳糖苷酶與顯色底物反應，產生藍色不溶于水物質，藍色菌落越多，大腸菌群越多。一種大腸菌群快速檢測卡，檢測卡結構如圖1所示，注1為標簽、2為蓋膜、3為培養基層、4為吸水保濕層、5為底片。底片5上方涂有一層不干膠，將吸水保濕層4粘附在底片5上，吸水保濕層4上方粘連一張培養基層3，培養基層3上方蓋有一張蓋膜2，蓋膜2通過標簽1與底片5連在一起。其中，培養基層上吸附有上述的培養基。優選的，培養基層由吸附有培養基的吸水濾紙構成。優選的，吸水濾紙由天然纖維素材料、半合成材料或全合成材料制成。優選的，吸水保濕層含有瓜爾膠、卡拉膠、瓊脂粉、聚丙烯酸樹脂、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、辛烯酸琥珀酸樹脂、海藻酸鈉中的一種或者幾種組合物。優選的，吸水保濕層由瓜爾膠、聚丙烯酸樹脂、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉組成，其質量比為5 25 5 65，這種吸水保濕層的保濕性能好，且能長久提供檢測大腸菌群生長所需水份。優選的，底片由合成紙或聚酯材料制成。優選的，蓋膜由聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯膜材料制成。下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。實施例1
一種大腸菌群顯色培養基，每IOOOmL培養基含有蛋白胨5g，酵母浸出物50g，乳糖 12. 5g，氯化鈉2g，丙酮酸鈉5g，SDS 0. 5g，磷酸二氫鈉4g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷 0. OOlg，IPTG lg。將上述成分溶于水至IOOOmL,加熱煮沸，121°C滅菌15min，即可使用。實施例2
一種大腸菌群顯色培養基，每IOOOmL培養基含有蛋白胨8. 7g，酵母浸出物37. 5g， 乳糖25g，氯化鈉15g，丙酮酸鈉0. 2g，SDS 0. 3g，磷酸二氫鈉0. lg，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷 2g，IPTG 0. OOlg0將上述成分溶于水至IOOOmL,加熱煮沸，121°C滅菌15min，即可使用。實施例3
一種大腸菌群顯色培養基，每IOOOmL培養基含有蛋白胨25g，酵母浸出物5g，乳糖6. 5g，氯化鈉6. 5g，丙酮酸鈉0. lg, SDS 0. 2g，磷酸二氫鈉0. 2g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷 lg, IPTG 0. 05g。將上述成分溶于水至IOOOmL,加熱煮沸，121°C滅菌15min，即可使用。實施例4
一種大腸菌群顯色培養基，每IOOOmL培養基含有蛋白胨5g，酵母浸出物3g，乳糖lg，氯化鈉2. 5g，丙酮酸鈉0. 5g，SDS 0. 05g,磷酸二氫鈉0. 3g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷 0. lg，IPTG 0. Ig0將上述成分溶于水至IOOOmL,加熱煮沸，121°C滅菌15min，即可使用。實施例5
一種大腸菌群顯色培養基，每IOOOmL培養基含有蛋白胨10g，酵母浸出物12. 5g，乳糖 IOg,氯化鈉5g，丙酮酸鈉lg，SDS 0. 3g，磷酸二氫鈉2g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷 0. 05g，IPTG lg。將上述成分溶于水至IOOOmL,加熱煮沸，121°C滅菌15min，即可使用。實施例6
一種大腸菌群顯色培養基，每IOOOmL培養基含有蛋白胨50g，酵母浸出物20g，乳糖2g， 氯化鈉6. 3g，丙酮酸鈉0. 2g，SDS 0. Olg,磷酸二氫鈉0. 3g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷 O.Olg，IPTG 2g。將上述成分溶于水至IOOOmL,加熱煮沸，121°C滅菌15min，即可使用。實施例7
大腸菌群快速檢測卡，包括底片、吸水保濕層、培養基層、蓋膜。其中，底片材料為聚酯； 吸水保濕層由質量比為5:25:5:65的瓜爾膠、聚丙烯酸樹脂、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉等粉碎混合均勻制成；培養基層的吸水濾紙材料為天然纖維素，其均勻地吸附有實施例1 配制的大腸菌群顯色培養基；蓋膜材料為聚丙烯。實施例8
大腸菌群快速檢測卡，底片為合成紙，吸水保濕層由瓜爾膠粉碎制成，培養基層的吸水濾紙由半合成材料制成，其均勻地吸附有實施例2配制的大腸菌群顯色培養基，蓋膜材料為聚酯。實施例9
大腸菌群快速檢測卡，底片材料為聚酯，吸水保濕層由丙烯酸樹脂、瓊脂粉、辛烯酸琥珀酸樹脂等粉碎混合均勻制成；培養基層的吸水濾紙材料為天然纖維素，其均勻地吸附有實施例3配制的大腸菌群顯色培養基，蓋膜材料為聚苯乙烯膜。實施例10
大腸菌群快速檢測卡，底片為合成紙，吸水保濕層由瓜爾膠、卡拉膠、海藻酸鈉等粉碎混合均勻制成，培養基層的吸水濾紙由全合成材料制成，其均勻地吸附有實施例4配制的大腸菌群顯色培養基，蓋膜材料為聚丙烯。實施例11
大腸菌群快速檢測卡，底片材料為聚酯，吸水保濕層由瓜爾膠、海藻酸鈉等粉碎混合均勻制成，培養基層的吸水濾紙材料為天然纖維素，其均勻地吸附有實施例5配制的大腸菌群顯色培養基，蓋膜材料為聚丙烯。實施例的大腸菌群顯色培養基，加樣后需培養18 Mh，可以觀察結果；快速檢測卡，加樣后培養15 24h就可以觀察結果。顯色平板或者檢測卡上出現藍綠色的菌落即為陽性菌落。特異性實驗
將大腸埃希氏O^Escherichia co7i) ATCC25922,弗氏檸檬酸桿菌{Ci trobac terfreundii) ATCC 43864、糞鏈球菌(5 faecal is) ATCC29212、阪崎腸桿蔑(Mnterobacter sakazakii ) ATCC51329> 1 t^J 1 If lif {Enterobacter cloacae) ATCC 13047、鼠傷寒沙門 ^MQSalmonella typhimurium) CMCC(B) 50115、腸炎沙門氏菌 (fehofleWa) 39111、大腸桿菌 0157coli 0157:H7) ATCC 35150、金黃
色葡萄球菌 C^a/^j^occociAs aureus Rosenbach) CMCC (B)洸003、副溶血弧菌(Kzlrio parahaemolyticus ) ATCC17802、蠟樣芽孢桿菌(Macillus cereus ) CMCC63303、銅綠假單胞菌(Monilia albican) ATCC10231、白色假絲酵母菌(C a^ic<ms)ATCC10231 等 13 種標準菌株分別制成適當濃度的標準菌懸液(濃度為10° 102cfu/mL)，每種菌分別用NA平板或者PDA平板檢測，實施例7的大腸菌群快速檢測卡，實施例1的大腸菌群顯色培養基三種方式進行檢測。每種方式均從13種菌懸液分別吸取ImL菌液檢測，37°C培養18 Mh。檢測結果如表1，“ + ”表示陽性結果，有藍點出現，“_”表示陰性結果，無藍點出現。
權利要求
1.一種大腸菌群的顯色培養基，每IOOOmL培養基含有蛋白胨5 50g，酵母浸出物3 50g,乳糖1 25g，氯化鈉2 15g，丙酮酸鈉0. 1 5g，SDS 0. 01 0. 5g，磷酸二氫鈉0. 1 4g，特異性酶顯色底物0. 001 2g，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)O. 001 2g。
2.根據權利要求1所述的大腸菌群的顯色培養基，其特征在于每IOOOmL培養基含有蛋白胨5 25g，酵母浸出物3 12. 5g，乳糖1 10g，氯化鈉2. 5 6. 5g，丙酮酸鈉 0. 1 lg，SDS 0. 05 0. 3g，磷酸二氫鈉0. 2 2g，特異性酶顯色底物0. 05 lg，異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 0. 05 Igo
3.根據權利要求1或2所述的大腸菌群顯色培養基，其特征在于所述特異性酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷。
4.一種大腸菌群快速檢測卡，其結構由下至上依次為底片、吸水保濕層、培養基層、 蓋膜，其特征在于培養基層上吸附有權利要求1 3任一項所述的培養基。
5.根據權利要求4所述的一種大腸菌群快速檢測卡，其特征在于所述培養基層是由吸附有培養基的吸水濾紙構成。
6.根據權利要求5所述的一種大腸菌群快速檢測卡，其特征在于所述吸水濾紙由天然纖維素材料、半合成材料或全合成材料制成。
7.根據權利要求4所述的一種大腸菌群快速檢測卡，其特征在于所述吸水保濕層含有瓜爾膠、卡拉膠、瓊脂粉、聚丙烯酸樹脂、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、辛烯酸琥珀酸樹脂、 海藻酸鈉中的一種或者幾種組合物。
8.根據權利要求7所述的一種大腸菌群快速檢測卡，其特征在于所述吸水保濕層由瓜爾膠、聚丙烯酸樹脂、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉組成，其質量比為5:25:5:65。
9.根據權利要求4所述的一種大腸菌群快速檢測卡，其特征在于所述底片由合成紙或聚酯材料制成。
10.根據權利要求4所述的一種大腸菌群快速檢測卡，其特征在于所述蓋膜由聚酯、 聚丙烯或聚苯乙烯膜材料制成。
全文摘要
本發明公開了一種大腸菌群的顯色培養基及其快速檢測卡，培養基含有蛋白胨、酵母浸出物、乳糖、氯化鈉、丙酮酸鈉、SDS、磷酸二氫鈉、特異性酶顯色底物、IPTG。快速檢測卡結構由下至上依次為底片、吸水保濕層、培養基層和蓋膜，培養基層上吸附有上述的培養基。本發明提供的大腸菌群的顯色培養基及檢測卡，能對飲用水、地表水、或食品中的大腸菌群進行檢測，檢測時間短，且效率高；既能對大腸菌群進行定性檢測，又同時可進行定量分析，陽性結果顯色明顯且觀察方便，減少假陽性和假陰性出現的幾率，檢測結果準確。
文檔編號C12Q1/04GK102311990SQ201110275619
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者盧新, 陳娟麗 申請人:廣州綠洲生化科技有限公司