專利名稱：一種α-半乳糖苷酶及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種α -半乳糖苷酶及其編碼基因和應用。
背景技術：
α -半乳糖苷酶(EC 3. 2.1. 22, a -galactosidase)又稱為蜜二糖酶,屬外切糖苷酶類，能夠特異性水解糖鏈非還原末端的α -半乳糖苷鍵，廣泛用于食品加工、飼料工業和醫藥等領域。在食品工業中，α-半乳糖苷酶可用于制取低α-半乳糖基寡聚糖含量的豆奶制品，有利于人體消化。在飼料工業中，添加α-半乳糖苷酶不僅可降解低聚糖，提高豆柏的代謝能，同時還可以消除腸道的脹氣現象，增加動物的采食量。在醫藥方面，利用α-半乳糖苷酶的轉移酶活性，可改造環糊精，改變藥物的理化性質，增加藥物的穩定性，從而延長藥效。另外，α-半乳糖苷酶在臨床醫學上可用于治療法布里病。α-半乳糖苷酶被認為是最有應用潛力的酶制劑之一。α -半乳糖苷酶因其廣泛的用途，已成為人們研究和開發的執占。α-半乳糖苷酶廣泛存在于微生物、植物、動物和人體內。其中尤以微生物的產量高。國外從60年代即開始從微生物中篩選產α-半乳糖苷酶的研究(Akiba etal. Agricultural and biological chemistry, 1976,40 :1845-1849)。我國于 70 年代后期開始進行微生物產α-半乳糖苷酶及酶學性質的研究(劉波等，微生物學報，1979，19:225-226)。目前，國際上報道產α -半 乳糖苷酶的微生物主要有曲霉屬的黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、犁頭霉屬的分枝犁頭霉(Absdiaramosa)、卷霉屬的妮卷霉(Circinella muscae)、青霉屬(Penicillium sp.)的一些菌種。其中，黑曲霉和分枝犁頭霉等菌種產α-半乳糖苷酶最多。絲狀真菌可將它們產生的α-半乳糖苷酶分泌到胞外，且具有合適的酸堿度和良好的穩定性而有利于技術應用。目前，國內關于熱穩定α-半乳糖苷酶的研究報道還很少。
發明內容
本發明的目的是提供一種α-半乳糖苷酶及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白，命名為RmgalA蛋白，來自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432，是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列I自N末端第24至751位氨基酸殘基組成的蛋白質；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c)將(a)或(b)的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列I衍生的蛋白質。為了使(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標簽。表I標簽的序列
權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)或(b)或(C)(a)由序列表中序列I自N末端第24至751位氨基酸殘基組成的蛋白質；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c)將(a)或(b)的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列I衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA 分子1)序列表的序列2自5’末端第70至2253位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有α_半乳糖苷酶活性的蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為如下(I)或(II)(I)將權利要求2或3所述基因插入pET-30a(+)載體的多克隆位點得到的重組質粒；(II)將權利要求2或3所述基因插入PPIC9K載體的多克隆位點得到的重組質粒。
6.如權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為如下(III)或(IV)(III)將權利要求5的(I)所述重組表達載體導入大腸桿菌得到的重組菌；(IV)將權利要求5的(II)所述重組表達載體導入巴斯德畢赤酵母得到的重組菌。
7.擴增權利要求2或3所述基因的全長或其任一片段的引物對。
8.一種制備權利要求1所述蛋白的方法，是培養權利要求6所述的重組菌，得到權利要求I所述蛋白。
9.權利要求1所述蛋白作為α-半乳糖苷酶的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于所述應用中，反應溫度為30-70°C，優選為 50-60°C，最優選60°C ;所述應用中，反應pH為3. 5-6. 5，優選為4-5. 5，最優選4. 5。
全文摘要
本發明公開了一種α-半乳糖苷酶及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白，是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列1自N末端第24至751位氨基酸殘基組成的蛋白質；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c)將(a)或(b)的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白質。本發明提供的蛋白作為α-半乳糖苷酶具有如下酶學性質最適pH為4.5，在pH 4-10范圍內穩定；最適溫度為60℃，且在55℃以內穩定，在55℃保溫30min酶活幾乎不變，60℃下保溫30min仍殘留70％的活性，表現出較好的熱穩定性。本發明提供的蛋白在工業應用中具有較大潛力。
文檔編號C12N15/63GK103045562SQ201110311080
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月14日 優先權日2011年10月14日
發明者江正強, 賈會勇, 閆巧娟, 波利特, 宋爽 申請人:中國農業大學