專利名稱：一株從白蟻腸道內分離的肺炎克雷伯氏菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株肺炎克雷伯氏菌。
背景技術：
白蟻Termite屬于節肢動物門昆蟲綱有翅亞綱等翅目的昆蟲，是較為古老的社會性害蟲，主要以富含纖維素、半纖維素和木質素等木質材料為食，這種本領是靠其后腸內的微生物的作用。Termite若喪失了腸道中消化木質素和纖維素的微生物的作用，就會因為不能消化木材而死。Termite屬于典型的寡氮營養型生物，其腸道固氮微生物的固氮作用是白蟻體內氮素的主要來源。Termite腸道固氮菌及其代謝產物可能直接作為Termite生長的氮源， 這使Termite得以利用含氮極低的木質食物為生。固氮作用是Termite生命活動必不可少的，可以通過破壞Termite的固氮系統，使Termite氮素營養不良而死亡，這不失為是一種值得探索的防治白蟻方法與途徑。目前，對于Termite氮營養方面，還有許多重要問題仍需作進一步研究，這不僅具有理論意義，而且也有一定的應用意義。
發明內容
本發明提供了一株從白蟻腸道內分離的肺炎克雷伯氏菌。一株從白蟻腸道內分離的肺炎克雷伯氏菌，它為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033，屬于克雷伯菌屬(Klebsiella)，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 2011315，保藏日期為2011年9月 15日；它為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，長為2. 0 μ m 2. 5 μ m，寬為1. 6 μ m 2 μ m，有莢膜； 在無氮培養基上形成乳白色半透明的圓形菌落，菌落邊緣整齊，表面濕潤不易挑取，培養5d 后有褐色色素產生。本發明中一株從白蟻腸道內分離的肺炎克雷伯氏菌，它為肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-033，其半固體穿刺試驗陰性、淀粉水解試驗陽性、脂肪水解試驗陰性、明膠水解試驗陰性、H2S試驗陽性、尿素試驗陽性、吲哚試驗陰性、甲基紅試驗陽性、伏普試驗陽性、檸檬酸鹽試驗陽性、尿酶試驗陽性、蔗糖試驗產酸產氣、麥芽糖試驗產酸產氣、D-山梨醇試驗產酸產氣、鼠李糖試驗產酸產氣、甘露醇試驗產酸產氣、乳糖試驗產酸產氣、海藻糖試驗產酸產氣，最適生長溫度為37°C，最適生長pH為7. 0士02。本發明一株從白蟻腸道內分離的肺炎克雷伯氏菌，它為肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-033，經 16S rDNA 測序其基因序列與 GenBank(http// www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫中已知細菌16S rDNA基因序列進行比對，獲取相近典型菌株的基因序列；利用MEGA4. 1和Clustal X軟件繪制固氮菌株HUB-IV-033的系統進化樹，菌株 HUB-IV-033 與 Klebsiella pneumoniae strain HDMB-X 菌株的親緣關系最近，比對后相似性達99% ；結合菌株HUB-IV-033形態學觀察、生理生化試驗鑒定結果，確定菌株HUB-IV-033為克雷伯菌屬(Klebsiella)的一個新菌株，命名為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-033。本發明一株從白蟻腸道內分離的肺炎克雷伯氏菌，它為肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033，屬于克雷伯菌屬(Klebsiella)，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 2011315，保藏日期為2011年9月15日。本發明從白蟻腸道內分離肺炎克雷伯氏菌，為固氮菌株，并采用分子生物學方法對其進行鑒定，并結合生理生化特性等對其進行分類學鑒定，確定其種類地位，本發明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033，屬于克雷伯菌屬(Klebsiella)，它作為指示菌，可以被樹木內生菌發酵產物所抑制，從而破壞白蟻的固氮系統，白蟻氮氮素營養不良而死亡，達到防治白蟻的目的，同時開發了可利用的固氮微生物資源及篩選，對開發人畜無毒、環保的殺白蟻生物藥劑具有重要的理論意義和現實意義。
圖1為具體實施方式
一中16S rDNA PCR擴增產物電泳圖，其中M =DNA MarkerDL2000, Lane 1 :HUB-IV_033 16S rDNA 擴增片段；圖2為具體實施方式
一中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-033 的16S rDNA的系統發育樹。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式一株從白蟻腸道內分離的肺炎克雷伯氏菌，它為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-033，屬于克雷伯菌屬(Klebsiella), 已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC N0 M2011315，保藏日期為2011年9月15日；它為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，長為2. 0 μ m 2. 2 μ m，寬為1. 6 μ m 2 μ m，有莢膜；在無氮培養基上形成乳白色半透明的圓形菌落，菌落邊緣整齊，表面濕潤不易挑取，培養5d后有褐色色素產生。本實施方式中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-033可在無氮培養基上生長，最適生長溫度為37°C，最適生長pH為7. 0士0. 2。本實施方式一株從白蟻腸道內分離的肺炎克雷伯氏菌，它的篩選方法按以下步驟實現一、制備白蟻勻漿從蟻巢中收集10只健康的白蟻，用體積濃度為75%的乙醇消毒3-^iin，無菌水沖洗3次后，切去頭胸部，腹部置于已滅菌的培養皿中；之后，無菌操作將10只白蟻腹部轉入已滅菌的裝有0. lmmol/L pH 7. 0磷酸鹽緩沖液的研缽中，研磨成勻漿，加入IOmL無菌水稀釋成混濁液，即為白蟻勻漿；同時，將消過毒的白蟻腹部于計數培養基平板上滾動擦拭，放入培養箱培養，以檢驗白蟻表面消毒是否徹底；二、富集培養用滅菌的移液槍吸取ImL白蟻勻漿裝入盛有30mL富集培養基(無氮培養基)的 250mL 的三角瓶中，100r/min、30°C，培養 3_5d ；三、平板分離單菌落
將富集培養后的培養液梯度稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10_6、10-7和10_8，用移液槍各取0. ImL培養液，無菌操作涂布于平板培養基上，30°C下倒置培養Mh ；挑取生長較大及不同形態菌落純化6次以上，鏡檢，將純化的單菌落轉至斜面培養基，4°C冰箱保存；每次試驗重復三次(n = 3)。本實施方式所述富集培養基(無氮培養基)的制備過程為蔗糖15g、KH2PO4 0. 8g、MgSO4 0. 2g、NaCl 0. 2g、CaCO3 lg、質量分數為 10 % 的 Na2MO4 · 2H20 lmL、質量分數為10%&Η3Β03 lmL、質量分數為10%的MnSO4 lmL、質量分數為10 %的Fii2SO4 lmL、 H2OlOOOmL,調pH至6. 5-7. 0，121。°C滅菌30min ；平板/斜面分離培養基的制備過程為在富集培養基中加入2%瓊脂制成平板分離培養基，滅菌后，倒入無菌培養皿中備用。本實施方式所述白蟻為黑翅土白蟻(Odontotermes formosanus)，取自中國武漢珞珈山大白蟻亞科的高等培菌白蟻。對篩選所得菌進行生理生化試驗依據《伯杰氏細菌學鑒定手冊》(第八版)和《常見細菌系統鑒定手冊》對其進行常規生理生化鑒定，實驗結果為半固體穿刺試驗陰性、淀粉水解試驗陽性、脂肪水解試驗陰性、明膠水解試驗陰性、壓3試驗陽性、尿素試驗陽性、吲哚試驗陰性、甲基紅試驗陽性、伏普試驗陽性、檸檬酸鹽試驗陽性、尿酶試驗陽性、蔗糖試驗產酸產氣、麥芽糖試驗產酸產氣、 D-山梨醇試驗產酸產氣、鼠李糖試驗產酸產氣、甘露醇試驗產酸產氣、乳糖試驗產酸產氣、 海藻糖試驗產酸產氣。分子生物學鑒定①以細菌16S rDNA通用引物對肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pnenmoniae) HUB-IV-033的DNA片段進行PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳(見圖1)。結果可以看出，在 1574bp出現特異條帶，條帶清晰、完整，無DNA、RNA等污染，此片段與預計的片段條帶大小基本吻合；②將陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，序列結果見SEQ ID No. 1, 將其基因序列與GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)數據庫中已知細菌16S rDNA 基因序列進行比對，獲取相近典型菌株的基因序列；利用MEGA4. 1和Clustal X軟件繪制固氮菌株HUB-IV-033的系統進化樹(如圖2所示)。結果表明，菌株HUB-IV-033與 Klebsiella pneumoniae strain HDMB-X菌株的親緣關系最近，比對后相似性達99%；結合菌株HUB-IV-033形態學觀察、生理生化試驗鑒定結果，確定菌株HUB-IV-033為克雷伯菌屬 Klebsiella的一個新菌株，命名為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-033 樹木內生菌發酵產物對肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-033的抑制作用本試驗以HUB-IV-033為指示菌，以實驗室保藏的樹木內生菌HUB-I-004〔它為枯草芽孢桿菌新亞禾中(Bacillus subtilis subsp. Iawsoniana subsp. nov)HUB-I-004, 已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC N0 M209161，保藏日期為2009年7月22 H),HUB-1-47〔它為枯草芽孢桿菌新亞種(Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov)HUB-I-47，已在中國典型培養物保藏中心保藏， 保藏地址為武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 209162，保藏日期為2009年7月22 日〕為功能菌，進行抑菌試驗(結果見表1)，表明樹木內生菌的發酵產物對肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-033 均有較好的抑制作用。表 權利要求
1. 一株從白蟻腸道內分離的肺炎克雷伯氏菌，其特征在于它為肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033，屬于克雷伯菌屬(Klebsiella)，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 2011315，保藏日期為2011年9月15日。
全文摘要
一株從白蟻腸道內分離的肺炎克雷伯氏菌，它涉及一株肺炎克雷伯氏菌。它為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-033，屬于克雷伯菌屬(Klebsiella)，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC NOM2011315，保藏日期為2011年9月15日。本發明從白蟻腸道內分離固氮菌株，它作為指示菌，可以被樹木內生菌發酵產物所抑制，從而破壞白蟻的固氮系統，白蟻氮氮素營養不良而死亡，達到防治白蟻的目的，同時開發了可利用的固氮微生物資源及篩選，對開發人畜無毒、環保的殺白蟻生物藥劑具有重要的理論意義和現實意義。
文檔編號C12N1/20GK102409012SQ20111031886
公開日2012年4月11日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者周東坡, 常志威, 張小燕, 肖野, 趙凱, 郝妍 申請人:黑龍江大學