專利名稱：一株產慶大霉素C1a的工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于抗生素制藥領域，涉及一種工程菌的構建及其應用，具體地說，本發明涉及一株產慶大霉素Cla工程菌，應用于抗生素制造。
背景技術：
小單孢菌可產生豐富的次級代謝產物，特別是氨基糖苷類抗生素，如慶大霉素、西索米星和福提米星等。這些小單孢菌分布奇特，生長緩慢且細胞壁結構特殊，故研究進展緩慢。此外，由于缺乏通用的基因操作系統，小單孢菌遺傳操作困難，使得對其分子生物學的研究也大大落后于鏈霉菌。小單孢菌是慶大霉素產生菌，慶大霉素是氨基糖苷類抗生素，已在臨床上應用了近半個世紀，是我國、乃至全世界抗感染必備的基本藥物。慶大霉素屬多組分代謝產物，起抗菌作用的主要組分為C族復合物C1、C2和Cla。慶大霉素產生菌代謝產物可開發的組分十分豐富，如慶大霉素Cla是合成抗耐藥菌藥物依替米星(Etimicin)的前體；慶大霉素 B是進一步合成抗耐藥菌藥物異帕米星的母體；慶大霉素A、B、X是進一步開發抗原蟲的良好藥物；最新研究發現氨基糖苷類抗生素還具有抗HIV等功效。因此對該類稀有藥用微生物進行深入研究，特別是分子遺傳學方面的研究，具有極大意義。盡管人們對小單孢菌和慶大霉素的研究已近五十年，也取得了一些可喜的成果， 但一直未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究開發過程中，效價提高了近萬倍，而慶大霉素僅提高了幾十倍，差別非常懸殊。二十世紀八十年代興起的鏈霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、產量提高、組分改善及雜合抗生素生產等方面取得了一定的進展， 但在小單孢菌中的應用進展緩慢。依替米星是新型半合成慶大霉素，是中國獨創的抗生素一類新藥，已在多國申請專利，其知識產權得到了有效保護，需求量大，是本類抗生素臨床首選藥物。但由于合成依替米星的母體是慶大霉素Cla (圖1)。而慶大霉素Cla需要從慶大霉素產生菌的代謝產物中分離才能得到。不幸的是，到目前為止，所有慶大霉素產生菌的代謝產物是復合物，主要包括慶大霉素Cl、C2和Cla等。這些復合物化學結構相近，理化性質相似，從中分離單組份慶大霉素Cla非常困難，導致慶大霉素Cla供不應求，且生產成本居高不下，層析分離周期長，收率低，料耗大，污染嚴重，提取精制工藝復雜，而且產品質量不穩定，與慶大霉素Cla結構相似的副產物隨時出現干擾，給依替米星產品質量控制造成了極大的不確定性，嚴重影響了藥品的穩定性、安全性和有效性，是迫切需要解決的科學難題。若能獲得專一性慶大霉素Cla產生菌，則以上所有問題將迎刃而解，其所帶來的經濟效益，社會效益和環境效益等是極其巨大的，更重要的是給清潔生產，安全用藥，提供了可靠保障
發明內容
本發明的目的在于提供一株產慶大霉素Cla的工程菌。該工程菌為滅活卵猶功能的絳紅色小單孢菌(Micromonospora purpurea) GKllOl菌株，已于2011年9月13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No. 52450所述的工程菌的發酵方法，具體如下菌株GKllOl發酵前先用稀釋平板法分離出產孢豐富的單菌落后，再轉接于斜面培養基，37°C培養10天，挖塊接種于種子培養基，37°C 搖床培養觀h，轉速為^Orpm，然后按10%接種量轉接于發酵培養基，37°C搖床培養124 h， 轉速為280rpm ；所述種子培養基葡萄糖0. 1-1. 0%，玉米淀粉1. 0-2. 0%，玉米粉0. 5-2. 5%， 蛋白胨 0. 1-0. 8%,黃豆餅粉 0. 5-1. 5%, KNO3 0. 05-0. 10%, CaCO3 0. 1-0. 5%, ρΗ6· 5-7. 5，發酵培養基玉米淀粉3. 0-6. 0%，玉米粉1. 0-2. 0%，蛋白胨0. 1-0. 8%，黃豆餅粉1. 0-4. O %，ΚΝ03 0. 01-0. 10%, (NH4)2SO4 0. 1-0. 5%, CaCO3 0. 1-0. 5%，淀粉酶 0. 001-0. 025%, ρΗ6· 5-7. 5。 所述的工程菌在制備抗菌藥物中的應用。菌株GKllOl的篩選，主要包括以下幾個步驟 Α.卵猶基因置換質粒的構建；
B.置換質粒轉化絳紅色小單孢菌；
C.轉化子的篩選；
D.工程菌組分的鑒定。基因置換的方法為PCR擴增卵猶上下游各2000 bp左右的片段作為同源交換臂， 并將紅霉素抗性基因作為篩選標記插入兩交換臂之間，將此三個片段同時連接到穿梭載體如pKC1139上，另外載體pKC1139上的安普霉素抗性基因也可用于之后的篩選環節。其中轉化是以五coli ET12657(pUZ8002)介導的結合轉移方法。過程為先篩選同時含安普霉素抗性(AmK)和紅霉素抗性(ermER)的菌株，松弛培養后再從中篩選含紅霉素抗性(ermEK)但對安普霉素敏感(Ams)的菌株。發酵液組分檢測采用薄層層析(TLC)，組分精確測定采用HPLC-MS法。本發明獲得了一株產生慶大霉素Cla的工程菌，該工程菌為絳紅色小單孢菌 (Micromonospora purpurea) GKllOl菌株，已于2011年9月13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，其簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院 3號，保藏編號為CGMCC No. 5245.本發明的工程菌用于產慶大霉素Cla，大大簡化了生產工藝，并降低生產成本，減少環境污染，同時提高了產品質量。達到了可大規模生產慶大霉素Cla的目標。
圖1為慶大霉素化學結構式。圖2為重組質粒pFD306圖譜。圖3為卵猶基因功能同源交換滅活(敲除)示意圖。I:親株染色體基因位置；II 與染色體KBl側單交換；III:與染色體KB2側單交換；IV染色體回復突變；V 與染色體雙交換。圖4為親株絳紅色小單孢菌S-1212與工程菌絳紅色小單孢菌GKllOl代謝產物的 TLC比較分析結果；其中A為工程菌絳紅色小單孢菌GKllOl代謝產物；B為親株絳紅色小單孢菌S-1212代謝產物。
圖5為親株絳紅色小單孢菌S-1212代謝產物的HPLC-MS圖譜。其中總離子流圖譜的峰1對應的是慶大霉素Cla，分子量450. 2 ；峰2，對應的是慶大霉素C2，分子量464. 3 ； 峰3，對應的是慶大霉素C2b，分子量464. 3 ；峰4，對應的是慶大霉素C2a，分子量464. 3 ；峰 5，對應的是慶大霉素Cl，分子量478. 3。圖6為工程菌絳紅色小單孢菌GKllOl代謝產物的HPLC-MS圖譜。其中總離子流圖譜的峰15對應的是慶大霉素Cla，分子量450. 2 ；峰20，對應的是慶大霉素C2b，分子量 464. 3 ；未檢測到慶大霉素Cl、C2和CM組分的痕跡。
具體實施例方式實施例1
本發明包括以下主要步驟 1.構建卵猶基因置換質粒
根據慶大霉素生物合成基因簇(可參考GenBank Accession Number AY524043)，分別在卵猶基因(SEQ. NO. 1)上下游設計兩對引物LBl和LB2以及LB3和LB4，以出發菌株 S-1212 (周曉蘭，黃建忠，，施碧紅，施巧琴.影響絳紅色小單孢菌 purpurea)^-\2\2孢子萌發的幾個主要因子的研究.福建師范大學學報(自然科學版)， Vol. 18 No. 1，ρ72-75)的染色體DNA (CTAB法)為模板，分別進行PCR，擴增得到gntK兩端的DNA序列，作為同源交換臂；上游交換臂稱為KB1(LB1/LB2)，長度為2076 bp ；下游交換臂稱為KB2(LB3/LB4)，長度為2044bp。以質粒pAGe為模板(朱碧銀，洪文榮，嚴紹德，朱寶泉， 林玉雙，封成軍.黑暗鏈霉菌DNA同源重組系統的構建.生物技術通報2011 (4)，162 一 166·)，El和E2為引物，擴增抗性篩選標記基因ermE，長度為1711bp (Fig. 2)。KB1、KB2 和ermE分別經pMD19_T (TA)克隆，得到陽性質粒，依次命名為pFD301、pFD302和pFD303。 pFD303經Spe I/Xba I酶切，回收1711 bp片段，與經Xba I酶切過的pFD301(4758 bp)進行酶連，轉化和篩選，得到陽性質粒，命名為PFD304 ；用)(ba I酶切pFD302，回收2048bp片段，與經)(ba I酶切過的pFD304 (6463 bp)進行酶連，篩選得到陽性質粒，命名為pFD305 ； 用Bgl II酶切pFD305,回收5801 bp片段，與經BamH I酶切過的pKC1139 (6500 bp)進行酶連，經篩選，最終得到陽性質粒，命名為PFD306 (圖2)。表1實施例所涉及的引物
權利要求
1.一株產慶大霉素Cla工程菌，其特征在于，所述工程菌為滅活卵猶功能的絳紅色小單孢菌(Micromonospora purpurea) GKl 101，已于2011年9月13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No. 5245.
2.一種如權利要求1所述的工程菌的發酵方法，其特征在于，菌株GKllOl發酵前先用稀釋平板法分離出產孢豐富的單菌落后，再轉接于斜面培養基，37°C培養10天，挖塊接種于種子培養基，37°C搖床培養觀h，轉速為280rpm，然后按10%接種量轉接于發酵培養基，37 °C搖床培養124 h，轉速為280rpm;所述種子培養基葡萄糖0. 1-1. 0%，玉米淀粉 1. 0-2. 0%,玉米粉 0. 5-2. 5%，蛋白胨 0. 1-0. 8%,黃豆餅粉 0. 5-1. 5%, KNO3 0. 05-0. 10%, CaCO3 0. 1-0. 5%, ρΗ6· 5-7. 5，發酵培養基玉米淀粉3. 0-6. 0%,玉米粉1. 0-2. 0%,蛋白胨 0. 1-0. 8%，黃豆餅粉 1. 0-4. 0 %，KNO3 0. 01-0. 10%, (NH4)2SO4 0. 1-0. 5%, CaCO3 0. 1-0. 5%，淀粉酶 0. 001-0. 025%, ρΗ6. 5-7. 5。
3.如權利要求1所述的工程菌在制備抗菌藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種滅活gntK功能的產慶大霉素C1a的工程菌及其應用，所述工程菌為絳紅色小單孢菌GK1101，已于2011年9月13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCCNo.5245，所述的工程菌用于制備抗菌藥物。本發明獲得了產慶大霉素C1a的工程菌，簡化了生產工藝、降低了生產成本，同時還方便了產品的質量控制。
文檔編號C12N1/20GK102363759SQ20111033153
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者嚴凌斌, 封成軍, 林玉雙, 洪文榮 申請人:常州方圓制藥有限公司, 福州大學