專利名稱：水稻抗旱相關轉錄因子基因OsWTF1及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物生物技術領域，具體涉及一個水稻轉錄因子家族AP2/ERF超家族 ERF亞家族蠟質相關基因的分離克隆、功能驗證和應用。
背景技術：
水稻是我國最重要的糧食作物，水稻也是農業耗水的第一大戶。近年來由于生態環境和氣候變暖的影響，水資源匱乏嚴重制約了我國糧食的生產，并已成為水稻減產的主要原因。為培育抗干旱的水稻新品系，人們嘗試通過生物技術途徑來認識植物對干旱的反應機制，并利用分子生物學手段來提高植物的抗旱性。研究表明，植物能分泌蠟質到角質層表面或者角質層內，限制植物非氣孔性水分喪失，具有保水抗旱的作用。另一方面，對植物轉錄因子的深入研究也發現含有58-59個高度保守氨基酸結構域的ERF轉錄因子能參與調節植物對生物及非生物因素脅迫的應答過程，提高植物對干旱、病蟲、低溫逆境等脅迫的耐受作用。針對我國正面臨的越來越嚴重的缺水問題，能找到調控水稻蠟質相關基因表達的 ERF類轉錄因子，將對培育新型抗旱的水稻品種，提高水稻產量具有重要的意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種與水稻抗旱性相關的蠟質轉錄因子基因及其編碼蛋白。 本發明所提供的與水稻抗旱性相關的蠟質轉錄因子基因，名稱為OsWTFI (與擬南芥中wmi 同源)，該基因在水稻基因組數據庫TIGR中的編號為0s02g0202000，編碼一個含有“AP2” 結構域的ERF類型水稻蠟質代謝轉錄因子，該基因的CDS全長618bp，編碼205aa的蛋白。 到目前還沒有任何關于OsWTFl功能的研究報道。本發明所述基因即是水稻基因組數據庫 TIGR中的編號為0s02g0202000的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表 SEQ ID No 1 的 DNA 序列；2)編碼序列表中SEQ ID No 2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。序列表中SEQ ID No 1的DNA序列由912個堿基組成，含有2個外顯子，分別為自 5'端第154位到第236位堿基和自5'端第357位到第892位堿基。該序列編碼SEQ ID No 2的核苷酸殘基序列。與水稻耐旱性相關的基因OsWTFl的編碼蛋白OsWTFl，是具有序列表中SEQID No 2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID No :2的氨基酸序列經過一個或者幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No :2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No :2衍生的蛋白質。序列表中SEQ ID No 2氨基酸殘基序列是由205個氨基酸殘基組成的蛋白質。含有本發明基因OsWTFl的表達載體、轉基因細胞系及寄主菌均屬于本發明的保護范圍。
擴增OsWTFl中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。本發明的另一個目的是提供一種改良植物抗旱性的方法。本發明所提供的改良植物抗旱性的方法，是將所述與抗旱性相關基因OsWTFl構建過表達載體導入植物組織或細胞，改良植物的抗旱性。用于構建所述植物表達載體的出發載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。利用任意一種可以引導外緣基因在植物中表達的載體，將本發明的OsWTFl 基因在植物中超量表達表現出耐旱特征。本發明的基因在構建到植物表達載體上時，可在其轉錄起始核苷酸前加上任何一個強啟動子或誘導性啟動子，也可使用增強子。攜帶有本發明OsWTFl基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射以及電穿孔等常規生物技術方法轉入植物細胞，并培育出抗旱性得到改良的植物。被轉化的植物寄主可以是水稻、玉米、小麥等單子葉植物，也適用于煙草、 大豆等雙子葉植物，培育抗旱的植物品種。下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1是采用ClustalW軟件(公開使用軟件)將水稻OsWTFl蛋白與其擬南芥中同源蛋白進行同源性比較結果。其中黑色表示高度保守的氨基酸。圖2是OsWTFl基因編碼蛋白的保守域分析圖。圖3是OsWTFl的全長cDNA克隆圖中從左到右依次為M，分子量大小Marker ； 1，5’ RACE擴增產物；2，5’ RACE擴增的陰性對照；3，3，RACE擴增產物；4，3，RACE擴增的陰性對照。5，RACE擴增得到約750bp 左右的片段，3’ RACE擴增得到約300bp左右的片段，將5’ RACE和3’ RACE產物切膠回收， 并轉入pGEM-T Easy Vector,經測序拼接獲得791bp全長cDNA，編碼區長度618bp，預測編碼蛋白質為 205aa。克隆全長 cDNA 在 Genbank 登錄(DQ468387，ABE98440)。圖4是干旱和紫外輻射條件下OsWTFl的基因表達分析圖。其中CK表示未處理的日本晴葉片中OsWTFl基因的表達，1表示干旱處理后水稻葉片中OsWTFl基因的表達，2表示紫外處理條件下，水稻葉片中OsWTFl基因的表達。 OsActin基因的表達被作為內參(OsActin的表達一輪，28cycles)。圖5是OsWTFl超量表達轉基因植物的PCR和RT-PCR檢測結果圖。其中A =OsffTFl超量表達轉基因植物的PCR檢測。P表示含有OsWTFl基因片段的質粒作為陽性對照；1，2為非轉基因植株作為隱性對照；3-16為獨立轉基因植株株系。B =OsffTFl超量表達轉基因植物的RT-PCR檢測。P表示含有OsWTFl基因片段的質粒；CKl和CK2為非轉基因對照植株，其余為獨立轉基因株系，OsActin基因被作為內參。圖6是OsWTFl超表達水稻植株葉片表皮蠟質晶體的掃描電鏡觀察結果。其中ai為野生型對照植株葉片腹面；a2為為野生型對照植株葉片背面辦為 OsffTFl超表達轉基因水稻葉片腹面；b2為OsWTFl超表達轉基因水稻葉片背面。圖7是OsWTFl超量表達轉基因植株葉片的葉綠素浸提率分析圖。
圖8是OsWTFl轉基因植物對干旱的抗性反應顯示圖。是對培養于溫室的分蘗期水稻植株進行抗旱處理實驗。其中a為野生型(WT)日本晴植株，b為OsWTFl轉基因植株。如圖分別為干旱處理前，OsffTFl超表達轉基因水稻Id1與野生型 的比較；干旱處理一周后，OsffTFl超表達轉基因水稻b2與野生型a2的比較；干旱處理一周后再復水一周，OsffTFl超表達轉基因水稻b3與野生型a3的比較。
具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、植物抗逆性相關蛋白OsWTFl及其編碼基因的獲得微陳列(Microarray)分析的結果表明水稻0s02g0202000基因是一個AP2型的轉錄因子基因，編碼一個含有“AP2”結構域的ERF類型水稻蠟質代謝轉錄因子。利用BLAST 程序發現它與擬南芥中wmi高度同源，對wmi的研究表明它是參與蠟質代謝途徑的一個轉錄因子。于是我們將0s02g0202000基因命名為OsWTFl。根據水稻已公布的BAC文庫 AP004869 序列設計 5，RACE 擴增引物WTFlRl 和 WTFlXbaR, 3' RACE 擴增引物WTFlFl 和 WTFlBamF，進行OsWTFl基因的全長cDNA擴增。擴增條件參照SMART RACE cDNA Amplification Kit 說明進行操作。5’RACE 在Superscript III逆轉錄酶的作用下，以4 μ L水稻幼穗總RNA為模板、 5，CDS primer 和 SMARTII A oligo 為引物，合成 5，RACE 的單鏈 cDNA。3’RACE 在Superscript III逆轉錄酶的作用下，以4 μ L水稻幼穗總RNA為模板， 加入 3，CDS primer A 和 DTT、dNTP 及 First-strand Buffer，42°C加入 1.5h，合成 3，RACE 的單鏈cDNA。5’ RACE單鏈cDNA和3’ RACE單鏈cDNA合成后，稀釋反轉錄產物100倍，5’ RACE 以5，RACE單鏈cDNA為模板，以UPM和WTFlRl為引物；3，RACE以3，RACE單鏈cDNA為模板，以UPM和WTFlFl為引物進行降落PCR，反應條件94°C 5s, 72°C 3min，5循環；4°C 5s， 70 °C 10s, 72 °C 3min，5 循環；94°C 5s, 68 °C 10s, 72 °C 3min，25 循環；4°C 保存。將第一輪 PCR產物分別以UPM、WTFlXbaR和UPM、WTFlBamF進行PCR反應，擴增條件為94°C 3min ； 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，35 循環；72°C 5min ；4°C保存。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收5’ RACE和 3’ RACE片段，將回收片段與載體pGEM-T Easy連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，根據PGEM-T Easy載體上的羧卞青霉素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，結合圖3，測序結果表明擴增到了 OsWTFl基因5’端和3’端的蛋白編碼區片段，然后再從2個有相互重疊序列的3，-RACE和5，-RACE產物中獲得全長OsWTFl基因的全長cDNA。 OsffTFl基因的蛋白編碼區序列如SEQ No 3所示，由618個脫氧核糖核苷酸組成，編碼SEQ No :2所示的蛋白。特異性引物信息如下上游引物WTFlBamF 5，-AT GGATCC ATCTCTGCCTCCCCTGTCCTTC-3，，加粗帶下劃線的堿基為BamHI酶切位點，
下游引物WTFlXbaR 5，-AT TCTAGA CGTCGTTTCATCCAAGCCTTTC-3，，加粗帶下劃線的堿基為XbaI酶切位點；上游引物WTFlFl :5，-GACTCCAACTGGGTGATGACGGTG-3，，下游引物WTFlRl :5，-TTGCTACGGGCGTCCTGGTCTGC-3，。實施列2、OsffTFl基因的Blast比對，編碼蛋白的亞細胞定位和保守結構域分析參見圖1 及圖 2，通過 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 網站的 CLUSTAL W和DNAMAN軟件進行同源性分析。水稻OsWTFl基因與擬南芥蠟質代謝轉錄因子基因 WINl (SHNl)的同源性較高，OsWTFl與擬南芥基因WINl (atlgl5360)氨基酸的同源性是 61%，與At5g25390的氨基酸同源性是54%，與At5glll90的氨基酸同源性是55%。擬南芥基因Wim(SHNl，atlgl5360)、At5glll90、At5g25390基因為調控蠟質代謝相關基因，推測OsWTFl基因可能與水稻蠟質代謝相關。通過http://W0lfpS0rt. org/網站亞細胞定位分析軟件分析，找到與OsWTFl同源性較高的已知基因有11個定位在細胞核中，2個定位在葉綠體中。初步確定，OsWTFl基因編碼的蛋白定位在細胞核中。根據水稻OsWTFl基因編碼蛋白的序列保守區用 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi 提供的軟件進行功能分析，并用http^/swissmodel. expasy. org/軟件進行蛋白質結構預測， 發現OsWTFl有一個AP2結構域，在6-66aa處，屬于EREF類的轉錄因子。實施列3、OsffTFl基因在逆境條件下的表達差異分析為檢驗OsWTFl基因在逆境條件下的反應，采用干旱和紫外輻射方法處理水稻葉片并檢測處理后植株中OsWTFl基因的表達。常規栽培的水稻至分蘗末期分成三組，一組對照，在自然光下生長；紫外處理組在自然光照條件下另加UVB管提供UVB輻射(15W，上海顧村光電儀器廠)。紫外燈管定位于植物上端20-30cm，UVB輻射光期8h/d (處理時間為每天9 00-17 00)，處理一周時間。干旱處理組則在自然光下生長另加6天干旱處理。處理后取葉片采用Invitrogen公司的Trizol 抽提液提取總RNA，并以總RNA為模板對逆境處理后葉片中OsWTFl基因的表達進行RT-PCR 分析。反轉錄體系2 μ L 50ng/ μ L Olig (dt), 4. 0 μ L 5Χ first strand buffer>0. 4μ L 1 OOmmo 1/L DDT、2. OyL lOmmol/L dNTPU. 0μ L M-MLV 200U/μ L，再加入 DEPC 處理的 H20 至 20yL。于 37°C 水浴 lh。置于 95°C 下 5min，滅活 M-MLV，加入 2 μ L TE (pH = 8. 0)，合成單鏈cDNA。以合成的各cDNA第一鏈為模板，用WTFlBamF和WTFlXbaR檢測OsWTFl基因的表達。發現正常栽培條件下，OsWTFl基因在水稻葉片中的表達較低，反轉錄的cDNA經過兩輪PCR(第一輪28cycles第二輪30cycles)后才見表達的條帶。以OsActin基因被作為內參，反應條件為94 °C預變性3min ；94 °C 30sec, 60°C 30sec ；72°C 35sec，28個循環；72°C延伸IOmin0其特異性引物如下ActinBamF :5’ -ATGGATCCAGGTAATAAGATCTTCAACAC-3，ActinSpeR 5' -ATACTAGTACCTGGAAACACACAAGACA-3'如圖4所示，經一段時間的紫外和干旱處理后，水稻葉片中OsWTFl基因的表達均比對照明顯增加，干旱處理對OsWTFl表達的增加比經紫外處理更顯著。實施列4、OsffTFl基因超量表達載體的構建和轉化為了能更好地闡明OsWTFl基因的功能，申請人將其在水稻中超量表達，從轉基因植物的表型來進行OsWTFl基因的功能驗證。
超量表達載體構建方法如下將全長OsWTFl全長cDNA(SEQ ID No 3)定向克隆到 pCambial300M載體35S啟動子下游，用于構建水稻35S_0sWTFl超量表達的植物雙元表達載體。經凍融法轉入農桿菌EHA105中后，通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法將其導入到水稻品種“日本晴”中，經過預培養、侵染、共培養、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、 煉苗移栽，得到轉基因植株。農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法應用Qu等人報道的方法(Qu et al. ，2006)。實施列5、OsffTFl基因超量表達轉基因植物的分子檢測本發明OsWTFl基因超量表達轉基因分子檢測采用PCR和RT-PCR法進行。5. IOsffTFl基因超量表達轉基因植株DNA層面上的PCR分子檢測用CTAB法提取水稻基因組DNA 剪取水稻葉片約IOOmg在研缽中用液氮磨成粉狀后，加入60°C預熱的600 μ L DNA提取緩沖液，60°C水浴保溫30-60min，不時溫和搖動。加入600 μ L等體積氯仿/異戊醇，顛倒混勻，室溫下靜置5-lOmin，使水相和有機相分層。室溫下10000r/min離心30min。取上清液至另一 1. 5mL eppendorf管，加入一倍體積異丙醇， 混勻，_20°C放置30min后10000r/min離心IOmin ；70%酒精洗兩遍，晾干，加入100 μ L TE 溶液溶解。OsffTFl基因超量表達轉基因植株的PCR鑒定取具有潮霉素抗性的轉OsWTFl水稻植株基因組DNAlOOng，以HygF和HygR引物進行PCR擴增鑒定潮霉素編碼基因，以引物WTFlBamF和WTFlXbaR進行PCR擴增鑒定，同時設置過表達質粒為陽性對照，未轉基因植株基因組DNA為陰性對照。結果如圖5中A所示，所有轉基因陽性植株都能擴增出水稻基因組本身具有的約820bp帶內含子的DNA片段和插入到水稻基因組中的OsWTFl全長約700bp的cDNA片段，而未轉基因的陰性對照植株和轉基因陰性植株都只能擴增到約820bp帶內含子的水稻基因組自身帶有的DNA片段，質粒對照也能擴出約700bp的OsWTFl全長cDNA片段。PCR檢測獲得轉OsWTFl全長cDNA的陽性植株22株。5. 20sffTFl基因超量表達轉基因植株RNA層面上的RT-PCR分子檢測提取DNA水平上檢測為陽性植株的幼穗部總RNA和未轉基因的日本晴幼穗總RNA， 反轉錄成cDNA為模板，用WTFlBamF和WTFlXaR為引物進行PCR，分析目的基因在轉錄水平上的表達情況，并以ACTIN基因的表達作為內參。RNA的提取和RT-PCR反應的方法同實施列3中的RT-PCR方法。結果如圖5中B所示，與未轉基因植株相比，OsWTFl已經在部分轉基因植株中得到不同表達程度的增強表達，其中6號轉基因植株獲得強表達，可以用于進一步表型鑒定。實施列6、OsffTFl基因超量表達轉基因植株葉片表面蠟質的掃描電鏡觀察取同一生長期超量表達轉OsWTFl基因植株和未轉基因的對照植株的水稻全展葉葉片用戊二醛固定，保存于4°C的冰箱內，按掃描電鏡的要求脫水、干燥后，將樣品于JEOL JFC-1600鍍膜機上噴金鍍膜，于JSM-6360LV掃描電鏡下觀察并拍照。結果如圖6所示 OsWTFl超量表達植株葉片背面(b2)和腹面(bl)都有表皮蠟質明顯增厚、乳突增多增大、乳突形態發生改變，乳突高度明顯增加，變成接近圓柱體的形狀等形態上的變化，而且這些變化在轉OsWTFl基因水稻葉片的腹面(bl)表現更加明顯。實施列7、OsffTFl基因超量表達轉基因植株葉片的葉綠素浸提率
轉OsWTFl基因植株葉片的葉綠素浸提率按一定時間內葉綠素浸提量占葉綠素總量的百分比進行。取OsWTFl基因超量表達轉基因植株和對照植株(未轉基因的野生型植株)在同一抽穗期劍葉下第一片功能葉，自來水沖洗后稱重，各取5g放入三角瓶中，加入30mL 80% 的乙醇，置于黑暗條件下偶爾搖動。前Ih每隔IOmin從各個樣品中各取400 μ L浸提液，然后在901^11、1201^11再各取40(^1^浸提液，測量其在λ 664ηπι和λ 647nm波長下的吸收值。 按公式計算葉綠素總量(mmol/g) = 7. 93A664+19. 53A647。結果如圖7所示，隨著時間的推移，轉基因和對照野生型植株的葉綠素浸提率逐漸提高，但在浸提的全部過程中，轉OsWTFl 基因植株的葉片葉綠素浸提率一直都比對照低，酒精浸提120min后，未轉基因野生型植株葉片中大約80%的葉綠素被浸提出來，而轉OsWTFl基因植株的葉片浸提率卻不到40%，表明轉基因植株對葉綠素的通透性降低。實施列8、OsffTFl基因超量表達轉基因植物對干旱處理的反應在實施例5結果前提下，本發明首先對OsWTFl基因超量表達轉基因植物T3 代植物進行了純合體篩選。具體步驟如下每個植株選取30粒種子去殼，70%乙醇表面消毒lmin，30%漂白液消毒30min，滅菌水洗5遍，用無菌鑷子播種在含潮霉素的 1/2MS (Murashige & Skong)培養基平皿上進行篩選，野生型日本晴作為對照，培養條件為 28°C，持續光照強度為25001UX，16h光照/8h黑暗。兩周后統計發芽及成活率，本發明默認 100%成活率的植株為純合體，每個純合體植物單獨取樣并進行相應的分子檢測。取分子檢測和潮霉素篩選結果一致的株系用于接下來的表型鑒定。本發明選取三條獨立的超量表達轉基因純和水稻用于表型篩選。取純和轉基因株系種子和野生型日本晴種子發芽并常規培養至分蘗期中期，不澆水進行干旱處理。干旱一周后，如圖8所示，OsWTFl超表達植物基本保持著正常的生長狀態(b2)，而對照野生型(a2)大多數萎焉，葉片下垂，出現嚴重的旱脅迫表現。干旱一周后復水一周，如圖8所示，絕大多數對照野生型植物葉片出現不可恢復的干枯，僅有少數的兩個分蘗返青，見a3 ；而OsWTFl超表達植物均可恢復至正常生長狀態， 見b3。植物在干旱后的復水能力也是抗旱的一個重要指標。干旱及復水實驗表明，OsWTFl 超量表達增強了植物的耐旱性，結果證實OsWTFl對干旱的響應起了重要的作用。
權利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中SEQID No :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中SEQID No 2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關的由(a)衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的蛋白，其特征在于所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加是指在SEQ ID No 2的第1位氨基酸至第206位氨基酸進行取代和/或缺失和/或添加。
3.權利要求1或2所述蛋白的編碼基因。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于如下(a)或(b)或(c)的基因(a)其核苷酸序列為序列表中SEQID No :1自5'末端第1位至第912位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子，(b)其核苷酸序列為序列表中SEQID No 1所示的DNA分子，(c)在嚴格條件下與(a)限定的DNA序列雜交的編碼所述蛋白質的DNA分子。
5.含有權利要求3或4所述基因的重組表達載體。
6.根據權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為 pCambial300M-0sWTFl，所述 pCambial300M_0sWTFl 是在 pCambial300M 載體的多克隆位點插入權利要求3或4所述基因得到的重組表達載體。
7.含有權利要求3或4所述基因的轉基因細胞系或重組菌。
8.一種培育抗旱水稻的方法，是將權利要求5或6所述的重組表達載體導入水稻細胞中，得到抗旱水稻。
全文摘要
本發明公開了一種水稻抗旱相關轉錄因子基因OsWTF1及其編碼蛋白與應用，該水稻抗旱相關蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中SEQ ID No2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中SEQ ID No2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關的由(a)衍生的蛋白質。該水稻抗旱相關蛋白及其編碼基因可用于培育抗旱水稻。
文檔編號C12N15/63GK102351950SQ20111033299
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者劉愛玲, 周小云, 張先文, 鄒杰, 陳信波 申請人:湖南農業大學