專利名稱：一種海洋鏈霉菌鹵化酶基因及其產物，以及其修飾產物的生物合成基因簇的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是海洋鏈霉菌鹵化酶基因及其產物，另外還涉及鹵化酶修飾產物的生物合成基因簇。
背景技術：
海洋鏈霉菌i^treptomyces xinghaiensis)是大連理工大學分離鑒定的一個海洋鏈霉菌新種(一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187，中國發明專利200710158478. 7)， 該菌種具有良好的抗耐藥金黃色葡萄球菌MRSA菌株活性，同時對綠膿假單胞菌、大腸桿菌、鮑曼不動桿菌以及白色念珠菌等也具有較好的活性，而其抗綠膿假單胞菌活性在所分離的所有菌株中比較突出。海洋鏈霉菌的16S rDNA序列與兩個親緣關系較近的標準菌種5 flavofuscus NRRL Β_8036 Π5 albiaxialis DSM 41799τ 同源性分別為 98. 1% 和 97. 5%， 但基因組DNA-DNA雜交分析顯示該菌種與兩個標準菌種的相關性只有31. 4%和46. 9%。對海洋鏈霉菌進行深入研究，發現了一個鹵化酶基因及其修飾產物的完整基因簇。鹵化酶是修飾很多抗生素的重要修飾酶，對很多抗生素的活性具有重要的作用。 由于FAD&依賴型的鹵化酶是許多抗生素生物合成基因簇中的后修飾酶，因此編碼這類鹵化酶的基因序列與多種抗生素的生物合成基因簇偶聯。在生物合成的過程中，催化合成反應的中間進行鹵代反應，從而對最終產物的生物活性產生影響。利用鹵化酶作為新型生物催化劑，可產生新的藥物分子用于臨床治療。鹵化酶可修飾多種抗生素，包括四環素類，安莎類，β內酰氨類、糖肽類等。其中complestatin (chloropeptin II)是含有鹵化修飾結構的一種特殊的糖肽類化合物，與萬古霉素、替考拉寧結構不同之處是其不含有糖基，它是由線性非核糖體多肽 (non-ribosomal peptide, NRPQ進一步通過NRPS合成酶進行酚氧化偶聯形成的剛性交聯結構。早在1980年人們就發現complestatin具有較強的抑制人補體旁路途徑的活性。作為人體重要的免疫防御系統之一，補體系統過度激活與類風濕性關節炎等多種疾病相關， 而重癥非典型性肺炎(SARS)也和補體系統的過度激活有關，因此開發高效低毒的抗補體藥物對于相關疾病的治療具有重要意義。研究者還發現complestatin具有較強的抑制艾滋病毒HIV-I整合酶的活性。此外，complestatin還可促進纖溶酶原自溶，也可作為阻止缺氧缺血等急性腦損傷造成的興奮毒性細胞死亡的神經保護分子。由于complestatin的多種獨特的生物活性，也吸引著人們進行化學合成研究，但直到2010年才報道了其化學全合成，但化學合成步驟多，難度較大。此外，complestatin溶解性不好，可能也是限制其藥物開發的因素，因此其類似物的開發具有重要研究意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種海洋鏈霉菌鹵化酶基因，另外還提供其產物；本發明還提供利用鹵化酶基因修飾產物的生物合成基因簇，其基因序列與complestatin的生物合成基因序列具有較高的同源性，但又具有其自身獨特的基因組成。本發明公開一種海洋鏈霉菌鹵化酶基因核苷酸序列，其特征為
(a)、含有SEQID NO. 1所示核苷酸序列的核酸；和
(b)、與(a)所述核酸具有至少75%序列相同性、同時保留了鹵化酶功能的核酸。本發明一種包括編碼基因序列的海洋鏈霉菌鹵化酶蛋白質
(a)、含有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白質；和
(b)、在(a)的蛋白質的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有鹵化酶功能的由(a)衍生的蛋白質。本發明還公開所獲得的海洋鏈霉菌鹵代酶修飾產物基因簇序列，以已及分離獲得該序列的方法，包括以下步驟
1)用R)Smid載體構建插入片段約為35-401Λ的海洋鏈霉菌基因組文庫；
2)將所獲得的文庫轉染細菌，平板涂布，經鑒定文庫合格后挑取平板上的單克隆于培
養基中培養；
3)提取培養的單克隆的DNA，PCR擴增，并對PCR擴增產物進行檢測，獲得含有鹵代酶基因的陽性克隆；和對該陽性克隆進行測序，獲得該鹵代酶基因全長以及修飾產物基因簇序列；
4)海洋鏈霉菌complestatin類似物基因簇功能預測，以及鹵化酶修飾產物結構預測 包括非核糖體多肽合成酶蛋白功能域的分析，以及編碼complestatin類似物的基因簇測序結果分析。所述分析海洋鏈霉菌修飾產物基因簇合成產物結構預測的方法，包括 ，1)海洋鏈霉菌鹵化酶測序結果分析；
，2)海洋鏈霉菌R)Smid文庫鹵代酶陽性質粒的序列結果分析； ，3)海洋鏈霉菌非核糖體多肽合成酶進行蛋白功能域的分析； 4)海洋鏈霉菌中編碼鹵化酶修飾產物的基因簇測序結果分析。本發明采用建立R)Smid基因組文庫的方法，利用鹵化酶基因的保守探針進行文庫的PCR篩選，獲得了新的鹵化酶基因。與傳統的SuperCos載體相比，Fosmid文庫構建時不采用限制性酶切，避免了酶切位點的偏好性，而且其拷貝數低，更具有穩定性。利用PCR 快速篩選R)smid文庫，成功獲得了鹵化酶基因的全長及其所在的基因簇。該基因簇共包括 11個生物合成酶，分別為非核糖體多肽合成酶基因，調節基因和轉運蛋白基因等基因具有較高同源性。
圖1是顯示海洋鏈霉菌與已知晶體結構的蛋白氨基酸序列的同源比對； 圖2是顯示海洋鏈霉菌鹵代酶氨基酸序列系統發育樹；
圖3是海洋鏈霉菌中complestatin-like化合物基因簇與5 Iavendulae中 complestatin基因簇的對比；
圖4是顯示海洋鏈霉菌非核糖體多肽合成酶(NRPS)的結構模塊與S. Iavendulae的比對；
圖5是顯示海洋鏈霉菌非核糖體多肽合成酶(NRPS) —級結構的預測。 圖6是海洋鏈霉菌鹵化酶修飾產物生物合成基因簇的功能注釋表。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。本發明將海洋鏈霉菌的基因組用DNA破碎儀(Hydro-Siear 0703,美國 GeneMachine)將基因組DNA打斷，獲得主要條帶在35 401Λ的片斷，使用Klenow片段進行末端補平，并通過酚氯仿抽提乙醇沉淀精制DNA片斷，精制后的DNA片段經過脈沖場電泳確認，連入 Copycontrol Fosmid Library Production Kit (Epicentre, USA)提供的 Fosmid 載體。用噬菌體包裝蛋白(Copycontrol Fosmid Library Production Kit, Epicentre) 體外包裝，轉染大腸桿菌EPI300，使用堿裂解法提取DNA，Notl酶切鑒定，脈沖場電泳檢測插入片斷的長度。判斷文庫是否合格，從而構建并獲得海洋鏈霉菌基因組文庫。使用鹵化酶特異性引物對海洋鏈霉菌基因組文庫進行篩選，最終得到13個陽性單克隆，對這13個陽性單克隆的雙向進行末端測序，并選擇其中一個進行全測序。在對序列結果進行分析后，獲得海洋鏈霉菌鹵化酶基因及其修飾的Complestatin類似基因簇。實施例1 海洋鏈霉菌鹵化酶基因的分離，以及其修飾產物基因簇的獲得。提取海洋鏈霉菌基因組DNA
用TBS培養基(以g/L計，胰蛋白胨17，大豆蛋白胨3，氯化鈉3，葡萄糖2. 5，磷酸氫二鉀2.5，pH 7. 5)在觀°〇，150印111中培養48小時。收集放線菌菌體細胞IOml以上，將菌體細胞重懸于5ml SET緩沖液，加入適量0. Imm的玻璃珠進行漩渦震蕩。用Iml 20mg/ml 的溶菌酶，37°C消化2h以上，再加入500 μ 15mg/ml的蛋白酶K，37°C反應30min。之后加入1/10體積的20%SDS溶液，55°C反應lh。用1/3體積的5 M NaCl溶液，室溫反應30 min，然后加入1 1體積比的飽和酚/氯仿，混勻后置于室溫反應30min。以8000 r/min 4°C離心20min，棄蛋白沉淀，并向上清其中加入等體積的異丙醇，室溫放置30min。用槍頭或毛細管將析出的DNA繞出，并以70%乙醇洗滌DNA數次。最后將乙醇揮發干，將得到的 DNA溶于ddH20中。海洋鏈霉菌鹵代酶基因序列的獲得
由于海洋鏈霉菌基因組中的編碼鹵化酶的基因簇序列未知，所以嘗試用兼并引物調取基因，在NCBI美國國家生物信息中心搜索已發布的放線菌鹵化酶的氨基酸序列，利用 Clustal W軟件進行同源比對。根據比對結果，在這一類鹵代酶的兩個保守區，即FAD結合位點(GGGXXG)和色氨酸殘基結合位點(GWTWXIP)的位置上，利用在線C0DEH0P引物設計軟件 http://bioinfo. weizmann. ac. il/blocks/codehop. html 上，設計簡并弓|物。表1擴增海洋鏈霉菌鹵代酶基因所用的CODEHOP簡并引物
權利要求
1.一種海洋鏈霉菌鹵化酶基因核苷酸序列，其特征是(a)、含有SEQID NO. 1所示核苷酸序列的核酸；和(b)、與(a)所述核酸具有至少75%序列相同性、同時保留了鹵化酶功能的核酸。
2.一種包括編碼基因序列的海洋鏈霉菌鹵化酶蛋白質，其特征是(a)、含有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白質；和(b)、在(a)的蛋白質的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有鹵化酶功能的由(a)衍生的蛋白質。
3.獲得海洋鏈霉菌鹵代酶基因全長以及其修飾產物基因簇序列的方法，其特征是包括以下步驟用R)smid載體構建插入片段約為35-401Λ的海洋鏈霉菌基因組文庫； 將所獲得的文庫轉染細菌，平板涂布，經鑒定文庫合格后挑取平板上的單克隆于培養基中培養；提取培養的單克隆的DNA，PCR擴增，并對PCR擴增產物進行檢測，獲得含有鹵代酶基因的陽性克隆；和對該陽性克隆進行測序，獲得該鹵代酶基因全長以及修飾產物基因簇序列；海洋鏈霉菌complestatin類似物基因簇功能預測，以及鹵化酶修飾產物結構預測包括非核糖體多肽合成酶蛋白功能域的分析，以及編碼complestatin類似物的基因簇測序結果分析。
4.根據權利要求3所述的獲得海洋鏈霉菌鹵代酶基因全長以及其修飾產物基因簇序列方法，其特征是，包括海洋鏈霉菌鹵化酶測序結果分析； 海洋鏈霉菌i^osmid文庫鹵代酶陽性質粒的序列結果分析； 海洋鏈霉菌非核糖體多肽合成酶進行蛋白功能域的分析； 海洋鏈霉菌中編碼鹵化酶修飾產物的基因簇測序結果分析。
5.海洋鏈霉菌中編碼鹵化酶修飾產物的基因簇，其特征為(a)、含有SEQID NO. 2所示核苷酸序列的核酸；和(b)、與(a)所述核酸具有至少75%序列相同性、同時保留了合成類似結構化合物的核酸。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域。本發明公開一種海洋鏈霉菌鹵化酶基因核苷酸序列，其特征為(a)含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的核酸和SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；和(b)與(a)所述核酸具有至少75％序列相同性、同時保留了鹵化酶功能的核酸。本發明采用建立Fosmid基因組文庫的方法，利用鹵化酶基因的保守探針進行文庫的PCR篩選，獲得了新的鹵化酶基因。與傳統的SuperCos載體相比，Fosmid文庫構建時不采用限制性酶切，避免了酶切位點的偏好性，而且其拷貝數低，更具有穩定性。利用PCR快速篩選Fosmid文庫，成功獲得了鹵化酶基因的全長及其所在的基因簇。該基因簇共包括11個蛋白合成基因，其序列分別與非核糖體多肽合成酶基因，調節基因和轉運蛋白基因等基因具有較高同源性。
文檔編號C12N15/52GK102533800SQ20111033307
公開日2012年7月4日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者楊天虹, 王玉梅, 趙心清, 陳亮宇 申請人:大連理工大學