專利名稱：一種表達苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制備方法
技術領域：
本發明一般的涉及乳酸乳球菌制品的制備方法，特別的涉及表達苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制備方法。
背景技術：
苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)是人體必需的一種氨基酸，正常人從飲食中攝入及體內再循環的苯丙氨酸，除少部分被直接利用外，大部分在肝臟的苯丙氨酸羥化酶 (Phenylalanine hydroxylase,PAH)的作用下轉化成為酪氨酸后被利用。患有常染色體隱性遺傳病——苯丙酮尿癥(Phenylketonuria，PKU)的患者，由于苯丙氨酸羥化酶基因缺陷， 導致肝臟的PAH酶活性降低或缺失，無法將苯丙氨酸轉化成為酪氨酸，致使苯丙氨酸通過其他途徑轉化為苯丙酮酸、苯乙酸、苯乳酸等。這些非正常代謝產物在血、腦脊液和其他組織中大量積累，對各種組織特別是腦組織造成不可逆損傷。PKU患者的主要臨床表現是智力低下，癲癇發作和黑色素減少。目前國際上通用的治療PKU方法是低苯丙氨酸飲食控制療法。該方法需從患者一出生起即給予低苯丙氨酸含量的特制的或人工合成的奶粉或食物，同時嚴格限制正常食物的攝入，并且根據各生長發育階段和個體的差異隨時調整飲食控制量，直至智力發育基本成熟的年齡，即17-18歲。由于苯丙氨酸在日常飲食中普遍、大量存在，飲食控制難度極大且控制過程容易造成患兒其它必需氨基酸的攝入不足，從而引起患兒體質下降、生長發育遲滯等副作用。而特制的人工合成的低苯丙氨酸食品品種少、口感差、價格昂貴，實際應用中更使患者由于常年無法食用正常飲食而極其痛苦，因此少有患者能堅持此種飲食從而控制苯丙氨酸攝入量達十幾年者，因此極大地影響了治療效果。國際上于上世紀80年代初開始研究酶法治療PKU，主要是采用逆轉錄病毒和重組腺病毒載體介導的方法，來實現PAH 在PKU模型小鼠的肝細胞中的表達。但這一方法的主要問題是轉移效率低，轉移物免疫原性強，外源基因在細胞中只能短期表達，同時存在安全性隱患，因此至今未見用于臨床的報道。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)廣泛存在于各種綠色植物和少數微生物中，它可以催化苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸，因此有希望口服該酶治療PKU。由于植物和酵母等生產的天然PAL量極少，提取成本很高，因此通過基因工程方法獲取大量 PAL成為研究的重點。《中國病理生理雜志》2000年16卷第1期第12頁公開了一種水稻PAL基因在大腸桿菌BL21DE3中的表達方法，PAL主要以包涵體形式存在，誘導7小時后其表達量達到峰值，占菌體總蛋白量的35. 43%。但該菌超聲破碎后提取的粗酶比活力很低，僅為0. 46U/g， 原因是PAL在生物體外極不穩定。利用該文獻報道的方法，一方面無法提取得到體外穩定存在的PAL純品，另一方面表達PAL所用的大腸桿菌為人體致病菌，不能直接口服應用，因此利用該方法表達的PAL無法在臨床治療PKU中使用。中國專利02117216. 1公開了一種治療PKU的藥物的制備及使用方法，該方法將PAL基因轉入腸道正常菌中，通過口服該菌，利用其表達的PAL酶在消化道內將苯丙氨酸轉化為肉桂酸，從而降低食物來源中的苯丙氨酸進入血液的量，以達到治療PKU的同時保持較正常飲食的目的。《生物工程學報》2002年18卷第6期第713頁公布了利用上述專利方法在乳酸乳球菌(L. lactis)NICE系統中表達歐芹PAL的方法，其使用翻譯融合型載體ρ (NZ8048-PAL)工和轉錄融合型載體P (NZ8048-PAL) 2在乳酸乳球菌中表達歐芹PAL，表達量分別占總蛋白的 5. 16%和2. 76%。該方法的明顯缺陷在于乳酸乳球菌的發酵量和乳酸乳球菌中表達產物的含量均很低，造成最終發酵獲得的PAL總水平低，因此成本極高，限制了其實際臨床應用。本申請人在之前的中國發明專利申請200810098008. 0中公開了一種治療PAL的乳酸乳球菌制品的制備方法。該方法在生物工程學報公開方法的基礎上進一步對乳酸乳球菌的發酵培養基進行了優化，采用這樣的發酵培養基發酵培養較采用傳統的Μ17培養基發酵培養時菌體密度提高了 3. 02倍，PAL比活性提高了 1. 65倍，兩者的乘積也即發酵獲得 PAL的總活性提高了 4. 99倍。但是上述優化發酵培養基發酵表達PAL的乳酸乳球菌的方法還有進一步改進的余地，以進一步提高乳酸乳球菌的發酵量和乳酸乳球菌中表達產物的含量，從而進一步降低患者臨床使用的成本，有利于該活性乳酸乳球菌制品的推廣應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種表達PAL的活性乳酸乳球菌制品的高效低成本的制備方法。可在現有技術的基礎上進一步提高乳酸乳球菌的發酵量和乳酸乳球菌中表達產物的含量，從而進一步降低患者臨床使用該活性乳酸乳球菌制品的成本，有利于該活性乳酸乳球菌制品的推廣應用。為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下1)獲得表達PAL的基因；2)構建重組表達載體將表達PAL的基因與適于轉化乳酸乳球菌的表達載體相連接形成重組表達載體；3)構建工程菌將重組表達載體轉化感受態的乳酸乳球菌；4)篩選獲得高效表達PAL的乳酸乳球菌菌株；5)發酵乳酸乳球菌并誘導表達PAL ；6)干燥發酵收獲的菌體，其中在5)的發酵時使用的培養基由體積比4 6-6 4的配制中間培養基與 Μ17肉湯培養基混合得到，并將ρΗ值調節到6. 5-7. 5，所述的配制中間培養基每IL中含有蛋白胨 5-30g，酵母提取物 2. 5-15g，乳糖或葡萄糖 5-30g, MgSO4. 7Η200· 2-0. 5g，MnSO4. H2O 0. 05-0. lg, NaAc. 3H20 3. 3g, KH2P042g, Tween-800. 5_5ml。在上述技術方案的獲得表達PAL的基因過程中，可以人工合成編碼PAL的基因，也可以從其它表達PAL的動植物或微生物中提取總RNA經反轉錄得到編碼PAL的cDNA。其中在人工合成編碼PAL的基因時優選用乳酸乳球菌翻譯偏愛密碼子合成編碼PAL的基因，在提取反轉錄得到編碼PAL的cDNA時優選從植物或紅酵母中提取總RNA經反轉錄得到編碼 PAL的cDNA，并更優選從歐芹中提取總RNA經反轉錄得到編碼PAL的cDNA。
在上述技術方案的構建重組表達載體時，所述的適于轉化乳酸乳球菌的表達載體包括但不局限于pET23b、pMG36e、pNZ8048、pNZ8149等。連接可采用本領域技術人員公知的方法，選擇相同的限制性內切酶對上述表達載體與儲存表達PAL基因的載體分別進行酶切后將分別得到的酶切表達載體與表達PAL的基因在T4DNA連接酶的作用下進行連接。在上述技術方案的構建工程菌時，應首先制備感受態的乳酸乳球菌，優選用電穿孔法制備感受態乳酸乳球菌，具體方法可參見文獻的報道。之后用將重組表達載體轉入感受態乳酸乳球菌。在上述技術方案的篩選獲得高效表達PAL的乳酸乳球菌菌株時，可選擇本領域技術人員公知的菌落PCR鑒定法、酶切圖譜法或PAL酶活性檢測法。其中菌落PCR鑒定法的原理是特異性PCR引物分別位于插入PAL基因的兩端，直接將少量菌體加入到PCR反應液中，可判斷是否有PAL基因的插入。酶切圖譜法的原理是根據質粒酶切電泳圖譜上條帶的數目和位置判斷有無插入片段及其大小。PAL酶活性檢測法的原理是將適量菌液、苯丙氨酸與高氯酸混合反應過夜，過濾離心后進行高效液相色譜(HPLC)分析，根據有無特異性的 PAL催化產物肉桂酸可判斷重組工程菌有無PAL表達活性。上述發酵過程在主要發酵條件方面，發酵溫度應維持在25_40°C，發酵時間控制在 6-30小時。為減少外源基因PAL過早表達對乳酸乳球菌生長的不利影響，優選當發酵液光密度OD值達到0. 3-0. 6時進行誘導，誘導劑優選乳鏈菌素(Nisin)，誘導劑優選終濃度為 3. 75_50ng/mlo在上述技術方案的干燥發酵收獲的菌體時，為保持乳酸乳球菌的活菌率并同時有利于PAL酶活的保存，優選將收獲的菌體高速離心脫水并用適當的緩沖液洗滌后再進行烘干處理。所述的適當的緩沖液優選PH值為7. 5-8. 8的緩沖液，并更優選磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液；為在保證洗滌效果的基礎上減少洗滌所造成的收獲菌體的損失，所述的洗滌次數優選2-3次；所述的干燥溫度優選25-60°C，時間優選6-72小時。通過實施上述的技術方案可使獲得的乳酸乳球菌活菌數和其中PAL的比活力大幅提高，其中前者可達到1012CFU/ml以上，后者可達到80U/g以上。
具體實施例方式實施例1 利用乳酸乳球菌偏愛密碼子人合成PAL基因構建表達PAL的乳酸乳球菌工程菌人工合成文獻“人工合成苯丙氨酸脫氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品級表達”(賈興元，陳星，蘇暢等，中華微生物學和免疫學雜志2006年1月第26卷第1期23-26頁)中
圖1所示的采用乳酸乳球菌偏愛密碼子的PAL基因序列，標記為PALart,連接到T載體后DNA 測序進行驗證。該PALart在5，端和3，端分別有XbaI和NcoI酶切位點。NcoI和XbaI雙酶切含PALart片段的T載體后得到完整的PALart基因片段，然后在T4DNA連接酶的作用下與由NcoI和XbaI雙酶切pNZ8149所得的線性質粒連接。連接體用電穿孔法轉化感受態乳酸乳球菌NZ3900，具體條件為在EquiBio Easyject細胞打孔儀上進行，參數設定為2. 5kv，25 μ F，400 Ω。其中ρΝΖ8149與ΝΖ3900均購自荷蘭NIZO food research。
5
實施例2 =PALart重組表達質粒的篩選和鑒定分別采用酶切圖譜法和PAL酶活性檢測法進行篩選和鑒定。酶切圖譜法采用NcoI和^CbaI雙酶切，電泳結果顯示重組質粒被切成2. 8kb和 1. 9kb的兩條帶，而質粒pNZ8149則被切為約1. 9kb和650bp的兩條帶，與預期的條帶數目和大小位置相符，可確定重組質粒有2. 2kb的PALart片段插入。PAL酶活性檢測法取400μ 1菌液加等量5%高氯酸與lOmmol/L苯丙氨酸， 0. lmol/L硼酸鹽緩沖液調節pH為8. 8，30°C反應1小時，12000rpm離心后取上清用0. 22 μ m 針頭濾膜過濾，HPLC自動進樣20μ 1進行分析。流動相為含體積濃度為0. 的乙酸的甲醇/水(50/50)溶液，流速為1. Oml/min,分離柱為4. 6mmX 25cm的C18反相柱，檢測波長為 ^Onm。同樣色譜條件下上肉桂酸標準品，記錄肉桂酸的保留時間。兩次HPLC保留時間比對結果顯示特異性的PAL催化反應產物肉桂酸的峰，表明該重組質粒有PALart表達活性。實施例3 利用歐芹PAL基因構建表達PAL的乳酸乳球菌工程菌從受機械損傷的歐芹莖葉中用常規方法提取總RNA，用RT-PCR技術制備PAL的 cDNA，其中所用的特異性引物為上游引物T1 5 ‘ -TACGATATCAGGAACTTGGTAACAAT-3 ‘，下游引物T2 5 ‘ -CTAAGATCTCATGCATFTCAGTTAACA-3 ‘。用EcoRV和BglII酶切得到的cDNA片段，得到具有粘性末端的PAL cDNA片段。然后用EcoRV和BglII酶切表達載體pNZ8149，并將酶切得到片段在T4DNA連接酶的作用下與 PAL cDNA片段連接得到重組質粒pNZ8149-PAL。參照實施例1的電轉化條件將重組質粒PNZ8149-PAL轉化到感受態乳酸乳球菌 NZ3900中。PNZ8149-PAL重組表達質粒的篩選和鑒定方法同實施例2。實施例4 表達PAL的基因工程乳酸乳球菌發酵培養分別配制如表1的培養基并調節pH到6. 5-7. 5用于發酵培養，其中配制過程中使用的M17肉湯培養基可按微生物學相關教科書上給出的配制方法配制，也可從商業途徑獲得，例如從BD公司購買。將實施例1獲得的表達PAL的乳酸乳球菌菌種按常規方法進行活化后按1 50比例分別接種上述培養基，于30°C進行半厭氧發酵培養(靜置不攪拌但也不封發酵容器口)，發酵時間為18小時，發酵過程中控制pH為6. 5-7. 5之間。當發酵液光密度OD值達到0. 4時用乳鏈菌素進行誘導，誘導劑終濃度為7. 5ng/ml。發酵結束后將發酵液經高速離心(SOOOrpm/分，離心20分鐘)脫水并用pH8. O的 0. lmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次，收集菌體，60°C烘干，4°C密封避光保存。實施例5 干燥菌體中PAL酶比活力與菌體存活情況檢測1)干燥菌體中PAL酶活力的檢測取400 μ 1菌液加等量5 %高氯酸與lOmmol/L苯丙氨酸，0. lmol/L硼酸鹽緩沖液調節PH為8. 8，30°C反應1小時，12000rpm離心后取上清用0. 22 μ m針頭濾膜過濾，HPLC 自動進樣20μ1進行分析。流動相為含體積濃度為0.1%的乙酸的甲醇/水(50/50)溶液，流速為1. Oml/min,分離柱為4. 6mmX 25cm的C18反相柱，檢測波長為^Onm。同樣色譜條件下上不同濃度的肉桂酸標準品，根據分別測定得到的峰面積對肉桂酸濃度繪制工作曲線，將菌液酶解苯丙氨酸樣品測定得到的肉桂酸峰的峰面積值代入工作曲線計算可得到樣品中肉桂酸的含量。
6
根據國際酶學生化學會委員會規定1個酶活力(U)，是指在特定條件下，1分鐘內能將1 μ mol底物轉化為產物所需的酶量，或是轉化底物中1 μ mol的有關基團的酶量；酶的比活力可用活力單位/毫克蛋白(U/mg)表示，也可用單位/克(U/g)或單位/ml(U/ml)制劑表示。由上述肉桂酸含量測定結果與國際酶學生化學會委員會的規定可得到干燥菌體中PAL比酶活力。2)干燥菌體存活情況檢測將干燥處理后的菌體在瓊脂肉湯M17固體培養基(LM17)中劃線，30°C恒溫培養72 小時后進行菌落計數。實施例6 不同培養基發酵培養的方法及結果不同發酵培養基組成及用其發酵培養的結果如下表1和表2所示，其他發酵培養條件如實施例4。表1不同發酵培養基組成及用其發酵培養的結果
權利要求
1.一種表達苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制備方法，按順序包括如下步驟1)獲得表達苯丙氨酸解氨酶的基因；2)構建重組表達載體將表達苯丙氨酸解氨酶的基因與適于轉化乳酸乳球菌的表達載體相連接形成重組表達載體；3)構建工程菌將重組表達載體轉化感受態的乳酸乳球菌；4)篩選獲得高效表達苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌菌株；5)發酵乳酸乳球菌并誘導表達苯丙氨酸解氨酶；6)干燥發酵收獲的菌體，其特征是在5)的發酵時使用的培養基由體積比4:6-6:4的配制中間培養基與M17 肉湯培養基混合得到，并將PH值調節到6. 5-7. 5，所述的配制中間培養基每IL中含有蛋白胨 5-30g,酵母提取物 2. 5-15g，乳糖或葡萄糖 5-30 g，MgSO4. 7H20 0. 2-0. 5g，MnSO4. H2O 0. 05-0. lg, NaAc. 3H20 3. 3g, KH2PO4 2g, Tween-80 0. 5_5mL·
2.如權利要求1的制備方法，其特征是利用乳酸乳球菌偏愛密碼子人合成所述的表達苯丙氨酸解氨酶的基因。
3.如權利要求1的制備方法，其特征是所述表達苯丙氨酸解氨酶的基因提取自歐芹。
4.如權利要求1的制備方法，其特征是所述的適于轉化乳酸乳球菌的表達載體是 PNZ8149。
5.如權利要求1的制備方法，其特征是所述的感受態的乳酸乳球菌是NZ3900。
6.如權利要求1的制備方法，其特征是當發酵液光密度OD值達到0.3-0. 6時進行誘導，誘導劑為乳鏈菌素，終濃度為3. 75-50ng/mL·
7.如權利要求1的制備方法，其特征是所述發酵溫度為25-30°C，發酵時間為6-30小時。
8.如權利要求1的制備方法，其特征是在所述干燥發酵收獲的菌體前采用高速離心脫水收集菌體并用PH在7. 5-8. 8之間的緩沖液洗滌2-3次收集菌體。
9.如權利要求1的制備方法，其特征是所述干燥發酵收獲的菌體采用25-60°C的干燥溫度與6-72小時的干燥時間。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥領域，涉及表達苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制備方法，按順序包括如下步驟1)獲得表達苯丙氨酸解氨酶的基因；2)將表達苯丙氨酸解氨酶的基因與適于轉化乳酸乳球菌的表達載體相連接形成重組表達載體；3)將重組表達載體轉化感受態的乳酸乳球菌；4)篩選獲得高效表達苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌菌株；5)發酵乳酸乳球菌并誘導表達苯丙氨酸解氨酶；6)干燥發酵收獲的菌體，其中在步驟5)的發酵時使用的培養基由體積比4∶6-6∶4的配制中間培養基與M17肉湯培養基混合得到，并將pH值調節到6.5-7.5。采用本發明的技術方案可使獲得的乳酸乳球菌活菌數和其中苯丙氨酸解氨酶的比活力大幅提高，其中前者可達到1012CFU/ml以上，后者可達到80U/g以上。
文檔編號C12N1/21GK102358890SQ20111033961
公開日2012年2月22日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者劉金毅, 周敏毅, 牛春, 程永慶 申請人:北京三元基因工程有限公司, 北京畢艾歐科技發展有限責任公司