專利名稱：一種油菜種皮中不同來源ans基因表達的快速檢測方法及運用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術及分子育種領域，特別是利用核苷酸多態性和等位特異PCR 技術檢測油菜種子中來自A染色體組、B染色體組和C染色體組的ANS基因表達的方法。
背景技術：
油菜是世界上重要的油料作物。油菜育種的主要目標之一是在雙低的基礎上選育黃籽油菜品種。在相同的遺傳背景下，黃籽油菜與黑籽油菜相比具有種皮薄、含油量高、木質素含量低等優點。無論是黃籽油菜還是黑籽油菜種子的胚都是黃色的，黃籽的種皮是透明的，黑籽的種皮為黑色，黃籽的顏色是其胚顏色的體現，油菜種子表現出來的顏色差別是由種皮決定的。研究表明油菜中種皮顏色的深淺和透明度取決于花色素合成酶(ANS)活性高低， 而花色素合成酶活性的強弱直接由ANS基因的表達量控制。現有檢測ANS基因的表達的方法為特異引物RT-PCR和Northern分析方法，但這些方法不能區分表達的ANS基因是來自A 染色體組、B染色體組還是C染色體組，其中白菜(Brassica campestris, AA, 2n=20)為A 染色體組；黑芥(Brassica nigra, BB, 2n=16)為 B 染色體組；甘藍(Brassica oleracea, CC, 2n=18)為C染色體組。由于以往的油菜3個基本種(白菜、黑芥、甘藍)和3個異源四倍體(芥菜型油菜，甘藍型油菜，埃塞俄比亞芥)的ANS基因的序列信息不完善，使RT-PCR 和Northern分析方法不能區分表達的ANS基因是來自A染色體組、B染色體組還是來自C 染色體組，無法在育種過程中用于大規模使用。為了進一步研究油菜種皮顏色形成的分子調控機理，加快黃籽油菜品種選育的進程，非常需要有一種能有效區分表達的ANS基因是來自A染色體組、B染色體組還是C染色體組的檢測方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種能快速、簡便、有效區分油菜種皮中表達的ANS基因來源的檢測方法。本發明的技術方案，包括如下步驟
(1)根據油菜三個基本種(白菜、甘藍、黑芥)和三個異源四倍體(芥菜型油菜、甘藍型油菜、埃塞俄比亞芥)ANS基因的序列比對分析，尋找核苷酸多態性位點；白菜(Brassica campestris, AA, 2n=20)為 A 染色體組；黑芥(Brassica nigra，BB, 2n=16)為 B 染色體組；甘藍(Brassica oleraceEi，CC, 2n=18)為 C 染色體組；
(2)通過比較A、B、C染色體組中ANS基因的多態性，利用引物設計軟件分別設計A、B、 C染色體組的特異引物；通過PCR條件的優化，確定特異擴增A、B、C染色體組ANS基因的引物；
所述特異擴增A染色體組ANS基因的引物為 上游引物 5，-TTAGCGAAAAGCGGGATCAGC-3，，
下游引物5’ -CCACGGGCAAACCGAAGAA-3’，該引物對只能使來自A染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為；
所述特異擴增B染色體組ANS基因的引物為 上游引物 5，-TTAGCAAAGAGCGGAATCGAA-3，，
下游引物5’ -CCACGGGCAAACCGAAGAA-3’，該引物對只能使來自B染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為
所述特異擴增C染色體組ANS基因的引物為 上游引物 5，-TAGCAATGGGAAGTTTAAGAGTA-3，，
下游引物5’ -GTGGTTCATAGAGCATATCTCG-3’，該引物對只能使來自C染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為452bp ；
(3)從不同類型油菜授粉后10-30天的種皮中分離總RNA，分別反轉錄后，進行特異引物PCR擴增；
(4)PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠為染料，電泳后用凝膠分析系統進行分析，根據引物特異性與電泳帶的有無，確定表達的ANS基因是來自哪個染色體組；
如果來自A染色體組ANS基因的特異引物擴增，電泳分離的擴增片段大小約為^K)bp， 說明表達的ANS基因是來自A染色體組；
如果來自B染色體組ANS基因的特異引物擴增，電泳分離的擴增片段大小約為^K)bp， 說明表達的ANS基因是來自B染色體組；
如果來自C染色體組ANS基因的特異引物擴增，電泳分離的擴增片段大小約為450bp， 說明表達的ANS基因是來自C染色體組。所述的油菜種皮中不同來源ANS基因表達的快速檢測方法在基因定位和分子標記輔助育種的運用，利用所述多態性位點作為一種分子標記，可用于基因定位和分子標記輔助育種。本發明的優勢利多態性位點的特異引物進行PCR，能夠簡便、快速地檢測表達的 ANS基因是來自A染色體組、B染色體組還是來自C染色體組，解決了當前對油菜種皮顏色形成調控研究和油菜黃籽品種選育過程中的一個ANS基因來源問題。下面結合附圖和實例對本發明作進一步描述，但不意味限制本發明的范圍。說明書附圖
圖1為A染色體組的ANS基因特異引物在6個不同類型的材料中的PCR擴增圖； 圖2為B染色體組的ANS基因特異引物在6個不同類型的材料中的PCR擴增圖； 圖3為C染色體組的ANS基因特異引物在6個不同類型的材料中的PCR擴增圖； 圖中A:白菜；B:黑芥；C:甘藍；AB:芥菜型油菜；AC:甘藍型油菜；BC:埃塞俄比亞芥。
具體實施例方式實施例1
(1)根據己發表的擬南芥ANS基因和油菜ANS基因序列(Abrahams S, Lee Ε, Walker A R, Tanner G J, Larkin P J, Ashton AR. The Arabidopsis TDS4 gene encodes leucoanthocyanidin dioxygenase (LDOX) and is essential for proanthocyanidin synthesis and vacuole development. Plant J, 2003, 35:624-636 ；Mingli Yan,Xianjun Liu, Chunyun Guan, Xinbo Chen, Zhongsong Liu. Cloning and expression analysis of anthocyanidin synthase gene homolog from Brassica juncea, Mol Breeding, 2011，28:313 - 322)，通過生物信息學分析，設計一對擴增ANS基因全長cDNA的簡并引物，以黑芥(BB)、甘藍(CC)、白菜(AA)、埃塞俄比亞芥(BBCC)和芥菜型油菜(AABB) 的種皮cDNA為模板進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收，將回收片段連接到PMD18-T載體上，然后將載體轉到感受態的大腸桿菌中，再將轉化后的菌液涂到含氨芐青霉素的篩選培養基上篩選出抗性克隆，對抗性克隆進行菌落PCR檢測，隨機挑選10 個陽性克隆進行測序。把所測得的DNA序列進行比對分析。(2)利用DNAMAN軟件，將所測得的黑芥(BB)、甘藍(CC)、白菜(AA)、埃塞俄比亞芥 (BBCC)和芥菜型油菜(AABB)的ANS基因的序列連同已發表(Feng Cheng, Shengyi Liu, Jian ffu, Lu Fang , Silong Sun , Bo Liu, Pingxia Li, Wei Hua, Xiaowu Wang . BRAD, the genetics and genomics database for Brassica plants.BMC Plant Biology , 2011, 11:136)的白菜(AA)、甘藍(CC)、芥菜型油菜(AABB)和甘藍型油菜(AACC)的ANS基因的 cDNA序列進行比對分析，尋找核苷酸多態性位點。通過比較A、B、C染色體組中ANS基因的多態性，白菜(Brassica campestris, AA, &ι=20)為A染色體組；黑芥(Brassica nigra，BB, 2n=16)為B染色體組；甘藍(Brassica oleracea，CC, 2n=18)為C染色體組。利用引物設計軟件I^imer Priemer 5. O分別設計A、B、C染色體組的特異引物。通過PCR條件的優化，確定特異擴增A、B、C染色體組ANS基因的引物，特異擴增來自A染色體組ANS基因的引物為上游引物 5，-TTAGCGAAAAGCGGGATCAGC-3，，下游引物 5，-CCACGGGCAAACCGAAGAA-3，， 該引物對只能使來自A染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為特異擴增來自B染色體組ANS基因的引物為上游引物5’ -TTAGCAAAGAGCGGAATCGAA-3’，下游引物5’ -CCACGGGCAAACCGAAGAA-3’，該引物對只能使來自B染色體組的ANS基因有擴增產物PCR產物大小為特異擴增來自C染色體組ANS基因的引物為上游引物 5，-TAGCAATGGGAAGTTTAAGAGTA-3，，下游引物 5，-GTGGTTCATAGAGCATATCTCG-3，，該引物對只能使來自C染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為452bp。(3)利用總RNA提取試劑盒分別提取6個黑籽材料(白菜，染色體組AA ；黑芥，染色體組BB ；甘藍，染色體組CC ；芥菜型油菜，染色體組AABB ；甘藍型油菜，染色體組AACC ；埃塞俄比亞芥，染色體組BBCC)授粉后25天種皮的總RNA。(4)以總RNA為模板，根據逆轉錄試劑盒(Τ0Υ0Β0，Lot: 118200)的說明進行操作， 通過逆轉錄酶合成cDNA。(5 )以cDNA為模板，以來自A染色體組的ANS基因的特異引物(上游弓丨物 5，-TTAGCGAAAAGCGGGATCAGC-3，，下游引物 5，-CCACGGGCAAACCGAAGAA-3，)進行 PCR 擴增。 PCR反應體系總體積為 20 μ L,含 IOX PCR buffer 2.0 μ LUO mmol L 1 dNTP mix各 0.3 μ LUO mmol L 1 正向引物 1 yL、10 mmol L 1 反向引物 1 yL、l U Taq DNA 聚合酶、2. 5 mmol L 1 MgCl2 2 μ LU μ L反轉錄產物、無菌去離子水(補足到20 μ L)。 PCR擴增條件為94°C預變性3 min;94°C變性25 s，60°C退火30 s，72°C延伸20 s，循環 30次；最后72°C延長6 min。(6)擴增產物通過1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠染色。然后通過凝膠分析系統進行拍照和分析，結果如圖1所示。在白菜、芥菜型油菜和甘藍型油菜的種皮cDNA中擴增得到大小約為290bp的片段，說明這3個材料中來自A染色體組的ANS基因有表達， 而在黑芥、甘藍和埃塞俄比亞芥的種皮中未有擴增片段，由于這3個材料不含A染色體組， 所以沒有A染色體組來源的ANS基因表達。實施例2
(1)以cDNA為模板，以來自B染色體組的ANS基因的特異引物(上游引物 5，-TTAGCAAAGAGCGGAATCGAA-3，，下游引物 5，-CCACGGGCAAACCGAAGAA-3，)進行 PCR 擴增。 PCR反應體系總體積為 20 μ L,含 IOX PCR buffer 2.0 μ LUO mmol L 1 dNTP mix各 0.3 μ LUO mmol L 1 正向引物 1 yL、10 mmol L 1 反向引物 1 yL、l U Taq DNA 聚合酶、2. 5 mmol L 1 MgCl2 2 μ LU μ L反轉錄產物、無菌去離子水(補足到20 μ L)。 PCR擴增條件為94°C預變性3 min;94°C變性25 s，60°C退火30 s，72°C延伸20 s，循環 30次；最后72°C延長6 min。(2)擴增產物通過1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠染色。然后通過凝膠分析系統進行拍照和分析，結果如圖2所示。在黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥的種皮cDNA 中擴增得到大小約為290bp的片段，說明這3個材料中來自B染色體組的ANS基因有表達， 而在白菜、甘藍和甘藍型油菜的種皮中未有擴增片段，由于這3個材料不含B染色體組，所以沒有B染色體組來源的ANS基因表達。(3)其它同實施例1。實施例3
(1)以cDNA為模板，以來自C染色體組的ANS基因的特異引物(上游引物 5，-TAGCAATGGGAAGTTTAAGAGTA-3，，下游引物 5，-GTGGTTCATAGAGCATATCTCG-3，)進行 PCR 擴增。PCR 反應體系總體積為 20 μ L,含 IOX PCR buffer 2.0 μ LUO mmol L 1 dNTP mix 各 0. 3 μ L、10 mmol L 1 正向引物 1 μ L、10 mmol L 1 反向引物 1 μ L、1 U Taq DNA聚合酶、2. 5 mmol L 1 MgCl2 2 μ LU μ L反轉錄產物、無菌去離子水(補足到20 yL)。PCR擴增條件為94°C預變性3 min;94°C變性25 s，57°C退火30 s，72°C延伸30 s，循環30次；最后72°C延長6 min。(2)擴增產物通過1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠染色。然后通過凝膠分析系統進行拍照和分析，結果如圖3所示。在甘藍、甘藍型油菜和埃塞俄比亞芥的種皮cDNA 中擴增得到大小約為450bp的片段，說明這3個材料中來自C染色體組的ANS基因有表達， 而在白菜、黑芥和芥菜型油菜的種皮中未有擴增片段，由于這3個材料不含C染色體組，所以沒有C染色體組來源的ANS基因表達。(3)其它同實施例1。
權利要求
1.一種油菜種皮中不同來源ANS基因表達的快速檢測方法，其特征是，包括步驟(1)根據油菜三個基本種(白菜、甘藍、黑芥)和三個異源四倍體(芥菜型油菜、甘藍型油菜、埃塞俄比亞芥)ANS基因的序列比對分析，尋找核苷酸多態性位點；白菜(Brassica campestris, AA, 2n=20)為 A 染色體組；黑芥(Brassica nigra，BB, 2n=16)為 B 染色體組；甘藍(Brassica oleraceEi，CC, 2n=18)為 C 染色體組；(2)通過比較A、B、C染色體組中ANS基因的多態性，利用引物設計軟件分別設計A、B、 C染色體組的特異引物；通過PCR條件的優化，確定特異擴增A、B、C染色體組ANS基因的引物；所述特異擴增A染色體組ANS基因的引物為 上游引物 5，-TTAGCGAAAAGCGGGATCAGC-3，，下游引物5’ -CCACGGGCAAACCGAAGAA-3’，該引物對只能使來自A染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為；所述特異擴增B染色體組ANS基因的引物為 上游引物 5，-TTAGCAAAGAGCGGAATCGAA-3，，下游引物5’ -CCACGGGCAAACCGAAGAA-3’，該引物對只能使來自B染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為所述特異擴增C染色體組ANS基因的引物為 上游引物 5，-TAGCAATGGGAAGTTTAAGAGTA-3，，下游引物5’ -GTGGTTCATAGAGCATATCTCG-3’，該引物對只能使來自C染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為452bp ；(3)從不同類型油菜的授粉后10-30天的種皮中分離總RNA，分別反轉錄后，進行特異引物PCR擴增；(4)PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠為染料，電泳后用凝膠分析系統進行分析，根據引物特異性與電泳帶的有無，確定表達的ANS基因是來自哪個染色體組；如果來自A染色體組ANS基因的特異引物擴增，電泳分離的擴增片段大小約為^K)bp， 說明表達的ANS基因是來自A染色體組；如果來自B染色體組ANS基因的特異引物擴增，電泳分離的擴增片段大小約為^K)bp， 說明表達的ANS基因是來自B染色體組；如果來自C染色體組ANS基因的特異引物擴增，電泳分離的擴增片段大小約為450bp， 說明表達的ANS基因是來自C染色體組。
2.根據權利要求1所述的油菜種皮中不同來源ANS基因表達的快速檢測方法在基因定位和分子標記輔助育種的運用，其特征是，利用所述多態性位點作為一種分子標記，可用于基因定位和分子標記輔助育種。
全文摘要
一種油菜種皮中不同來源ANS基因表達的快速檢測方法。本發明通過克隆和分析油菜3個基本種(白菜染色體組為AA,2n=20；甘藍染色體組為CC,2n=18；黑芥染色體組為BB,2n=16)和3個異源四倍體(芥菜型油菜染色體組為AABB,2n=36；甘藍型油菜染色體組為AACC,2n=38；埃塞俄比亞芥染色體組為BBCC,2n=34)ANS基因的序列，根據A、B和C染色體組來源的ANS基因的核苷酸多態性位點，設計能夠區分A、B和C染色體組來源的ANS基因的特異的引物，結合RT-PCR，對不同染色體組型油菜的種皮中表達的ANS基因類型進行鑒定。這一方法對進一步研究油菜籽種皮顏色形成的分子調控機理，加快黃籽油菜品種選育的進程有積極意義，同時也為油菜ANS基因的來源檢測提供了新的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102433379SQ20111036848
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月20日 優先權日2011年11月20日
發明者嚴明理, 劉麗莉, 舒佳賓 申請人:湖南科技大學