一種基因工程口服dna疫苗及制備方法和應用的制作方法

專利名稱：一種基因工程口服dna疫苗及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因生物工程技術領域。更具體涉及一種基因工程口服DNA疫苗，同時還涉及一種基因工程口服DNA疫苗的制備方法，還涉及一種基因工程口服DNA疫苗的用途，具體涉及構建對蝦抗菌肽Penaeidin-2信號肽與鯉魚生長激素基因的融合基因sgh，并將融合基因構建到真核表達載體pcDNA3. 1-中，質粒pcDNA3. 1 (-)—signal-GH通過電轉的方法轉入到減毒的鼠傷寒沙門氏菌Mlmonella typhimurium W0420中，制備促進克氏螯蝦生長的口服DNA疫苗。
背景技術：
生長激素(Growth Hormone, GH)是動物腺垂體細胞合成并分泌的一種具有種屬特異性的單鏈蛋白質類激素，一般由186 191個氨基酸組成，分子量約為2. 1 2. 2KDa。 一般情況下，生長激素呈脈沖式分泌，其分泌受下丘腦產生的生長激素釋放素(GHRH)的調節。生長激素作用機理較為復雜，生長激素的主要生理功能是促進神經組織以外的所有其他組織生長，能促進骨骼生長，蛋白質合成，對胰島素有拮抗作用，并影響葡萄糖和脂類的代謝，與動物生長發育和繁殖等密切相關。魚類生長激素(fish growth hormone, fGH)是由魚腦垂體合成并分泌的一種蛋白多肽。魚類生長激素參與體內蛋白質合成，脂類的代謝和降解等生理功能，能夠顯著提高魚的生長速率，在水產領域里有較高的應用價值和市場前景。上世紀70年代中期研究學者首次分離到魚類生長激素。1976年farmer等從羅非魚腦垂體中分離得到生長激素。最初魚類生長激素分離主要通過柱層析，再經過沉淀分級，從垂體的堿性提取物中獲得生長激素。目前研究學者對魚類生長激素的組成、結構、功能、基因調控等方面進行了較為系統的研究，并取得了一定的研究成果。通過基因工程技術將魚類生長激素在大腸桿菌或酵母中高效表達。進一步的研究證實，在大腸桿菌或酵母中表達的魚類生長激素通過喂食、肌肉注射、高滲浸泡等方法對魚體具有顯著促進生長作用。即通過基因工程技術表達重組魚類生長激素與天然魚類生長激素具有相似的生物活性和功能，目前重組魚類生長激素已經應用于促進魚，蝦和貝類的生長。魚類生長激素主要是通過激活靶細胞膜上的受體來實現其生物學活性，魚類生長激素受體主要分布在肝臟細胞膜上，近年來研究發現魚類生長激素也可以直接作用于其它組織細胞，如腎臟、心臟和肌肉等組織的細胞膜上。魚類生長激素是新陳代謝的調節子元件，能促進魚生長和發育，提高餌料中蛋白質轉化效率，促進機體內蛋白質的合成，對糖類代謝的影響主要表現在可以促進肝糖原的消耗和增強對碳水化合物的利用能力。近年來有研究學者表明，魚類生長激素能刺激卵巢細胞產生類固醇激素調節其性腺發育，魚血清中生長激素水平與季節變化也存在一定的關系。研究學者闡明魚生長激素對蛙科魚類滲透壓調節起到了重要作用。生長激素能夠提高Na+-K+ATP酶的活性，同時抑制魷科魚類從淡水到海水遷移時引起的血漿滲透性和離子濃度提高。魚類生長激素還能參與魚類各種應激反應。
1995年HJ Tsai和KLLin利用原核表達系統在大腸桿菌中表達黃鰭鯛生長激素， 并將表達的黃鰭鯛生長激素經復性純化后注射到黃鰭鯛體內，12周后注射生長激素的實驗組黃鰭鯛體長和體重與對照組比較分別提高了 22%和65% (HJTsai.，KLLinJ.，C Kuo. Highly efficient expression of fish growth hormone by Escherichiacoli cells[J]. App 1. Envir. Microbiol, 1995,61 :4116-411.)。研究學者表明喂食外源生長激素能夠增加魚類蛋白質的合成，還可以增強魚類對餌料中某些必需氨基酸的吸收。Sieridan等研究學者證實生長激素能提高魚肝臟中脂肪酶活性，促進脂肪分解，以作為能量促進魚類生長。生長激素作用途徑有以下兩種，一種是誘導肝細胞、肌細胞產生胰島素樣生長因子家族(insulin-like growth factor, IGFs)等生長介導素，再經胰島素樣生長因子間接起作用，IGF-I由70個氨基酸組成的單鏈多肽，分子量為7.6kDa，與胰島素原約有50%的序列相似性。IGF-I通過與受體結合而發揮作用，其受體主要為IGFl受體(IGFlR)和IGF/ 胰島素雜合受體。另一種是生長激素激活JAK2(JanUsKinase)，JAK2和生長激素受體(GHR) 磷酸化，并同磷酸化的受體一起將生長激素信號向下游傳遞。無論上述哪一種生長激素作用途徑，生長激素都必須首先與細胞表面的特異性受體結合，通過受體的介導，激發一系列生化反應最終發揮其生物效應。生長激素還能通過JAK2介導胰島素受體底物(IRS-1或 IRS-3)的磷酸化來激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3-K/Akt)信號通路。2008年Arenal A等研究學者，將羅非魚生長激素基因構建在真核表達載體中，通過胚胎電穿孔方法，將質粒導入到南方濱對蝦胚胎受精卵中，PCR和Southern雜交分析有36%的幼蝦中檢測到羅非魚生長激素基因，后續研究證實與對照組比較，南方濱對蟲下幼蟲下的體重有32%的增力口 (Arenal A.，Pimentel R. Growthenhancement of shrimp(Litopenaeus schmitti)after transfer of tilapia growth hormone gene[J]. Biotechnol Lett, 2008, 30 (5) :845-851)。2007 年 Guti6rrez A 等將幼蝦蛻皮階段注射重組人活牛胰島素，測定蝦體血淋巴(肌肉，肝胰臟，鰓)中葡萄糖/糖原水平發現，注射后Ih 后血淋巴中血糖水平增加，并注射證后血糖水平開始下降。研究表明胰島素很可能是在甲殼類動物中參與調節了糖代謝(Gutierrez Α.，Nieto J.，Pozo F.，Stern S.，Schoofs L. Effect of insulin/IGF-I like peptides on glucose metabolism in thewhite shrimp Penaeus vannamei [J]. Gen Comp Endocrinol. 2007,153 :170-175.)。孫孝文等用顯微注射法將生長激素基因導入中國對蝦受精卵中，基因轉移比例可以到達3%以上(孫孝文，劉萍等.顯微注射生長激素基因導入中國對蝦受精卵的研究.中國水產科學，1996， 3(4) :35-38)。DNA疫苗是指將編碼某種蛋白質抗原的重組真核表達載體直接注射到動物體內， 使外源基因在機體內表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，從而誘導特異性的體液免疫和細胞免疫應答。DNA疫苗具有減毒疫苗的優點，又無逆轉的危險，因此越來越受到研究學者的重視，被看作是繼傳統疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗。DNA疫苗具有以下優點構建載體結構簡單，提純質粒DNA的工藝簡便，適于大批量生產，生產成本較低；隨著分子生物學技術的不斷發展，DNA克隆比較容易，使得DNA疫苗能根據實際需求隨時進行更新；質粒DNA分子較為穩定，可制成DNA疫苗凍干苗便于保存； 與傳統疫苗比較，DNA疫苗安全性更高，其具有與減毒疫苗等同的免疫原性，能夠激活T淋巴細胞而誘導細胞免疫，由于DNA序列編碼的僅是單一的一段病毒基因，基本沒有毒性逆
4轉的可能性，因而不存在減毒疫苗毒力回升的問題；質粒DNA疫苗抗原表位比較穩定，DNA 疫苗不像減毒疫苗或亞單位疫苗那樣，會出現表位丟失；目前將多種DNA混合，組成多價疫苗，從而使一種DNA疫苗能夠誘導機體產生針對多個抗原表位的免疫保護作用，使DNA疫苗生產的靈活性顯著提高。目前有研究學者對質粒DNA疫苗的安全性問題存在疑慮，擔心質粒DNA可能會整合到宿主細胞的染色體上造成插入突變，但現階段研究表明并未發現有插入突變產生。質粒DNA在動物體內會緩慢降解，不會造成動物的自體免疫。質粒DNA疫苗主要免疫方法是將質粒溶入陽性脂質體，使用基因槍皮內或肌內注射。DNA疫苗還可以通過靜脈、鼻內、口服等接種方法。1892年科學家首次從小鼠體內分離出鼠傷寒沙門氏菌，1893年證實該菌可引起人食物中毒，明確該菌是人、鼠共同致病菌。后續研究表明沙門氏菌屬于腸道病原菌，是一種侵襲性胞內菌，與宿主通過III型分泌機制介導，這種機制使該菌的效應蛋白轉移到真核細胞。沙門氏菌侵入機體的途徑可分為兩種以M細胞為代表的上皮細胞途徑和以樹突狀細胞為代表的細胞途徑。沙門氏菌可選擇性地入侵派伊爾結Grayer’ s pathch, PP)的 M細胞，隨后破壞M細胞，然后被位于上皮下穹隆區的APCs捕獲。M細胞自身可對許多外源物質進行吞飲，將抗原物質轉運至細胞內，從介導淋巴細胞產生初級免疫應答。寒沙門氏菌也可通過非M細胞途徑進入機體。目前有報道表明，樹突狀細胞(dendritic cell, DC)在攝取腸腔中的物質方面起到了重要作用。樹突狀細胞廣泛分布于脾臟、派伊爾結、淋巴結等組織中。腸道內樹突狀細胞主要定位于腸系膜淋巴結(mesenteric lymph nodes, MLN)和腸道上皮黏膜固有層(lamia propria, LP) 0沙門氏菌侵入腸上皮組織后進入淋巴系統，通過血液循環，定居在肝臟和脾臟等器官。研究學者最早發現的減毒沙門氏菌是鏈霉素依賴型菌株，需要宿主體內保持一定濃度水平的鏈霉素才能穩定增殖。上世紀70年代Germarier等采用化學誘變劑對沙門氏菌進行化學誘變，從大量的誘變菌株中篩選得到一株減毒沙門氏菌菌株。目前研究學者已對沙門氏菌致病機理有了較深入的研究，基本能夠判定沙門氏菌病原體在宿主體內寄生的必需基因，能確定沙門氏菌減毒的部分基因。通過基因定點突變，獲得減毒沙門氏菌安全菌株。通過化轉和電轉的方法將質粒DNA轉化到減毒沙門氏菌菌株后，帶有質粒DNA減毒沙門氏菌通過自然感染的途徑，高效地將質粒DNA直接運送到體內的抗原提呈細胞(APCs)和巨噬細胞，淋巴組織誘發細胞免疫和體液免疫。沙門氏菌主要減毒突變株asd突變株；aro 突變株:aro 基因系列(aroA、aroC、aroD) ；dam 突變株；cya、crp/cdt 突變株禾口 phoP/phoQ 突變株等。將沙門氏菌染色體中編碼天門冬氨酸-β-半醛脫氫酶基因(asd)突變，該基因編碼合成二氨基庚二酸(DAP)途徑中的一種酶，DAP是合成革蘭氏陰性菌細胞壁肽聚糖的重要組成部分。哺乳動物組織中不含DAP，因此該突變菌在動物體內或不含DAP的培養基中均被裂解。將構建含asd質粒轉化突變菌后可形成互補，菌體能穩定生長和繁殖。aroA基因編碼EPSP (5_烯醇丙酮酰莽草酸_3_磷酸)合成酶，該酶催化對氨基苯甲酸和2，4-二羥基苯甲酸鹽分支酸途徑的中間反應，產生芳香族氨基酸。當aroA基因缺失時，該減毒菌株在無法在哺乳動物體獲得這些化合物，生長受到限制而被減毒。研究學者在后續研究中構建了 aroC和aroD等基因突變減毒株。
dam基因編碼DNA腺苷酸甲基化酶，該酶編碼的甲基化酶能將甲基轉移到GATC序列中的腺嘌呤N6位點上，這些位點的甲基化可以控制RNA聚合酶和調節蛋白的相互作用。 當dam基因缺失后，細菌基因組突變率會明顯增高，從而達到減毒目的。cAMP受體蛋白(crp)基因和腺苷酸環化酶(cya)基因在轉錄水平上可以調節許多基因的表達，在運輸氨基酸和表達表面蛋白中發揮著重要作用。由于crp和cya基因的缺失，消除了細菌在哺乳動物中攝取cAMP的唯一途徑，因此該突變型菌株在宿主細胞內不能轉化成野生型菌株。phoP基因編碼轉錄激活因子，PhoQ基因編碼傳感器激酶，PhoP毒力調節子是鼠沙門氏菌致病和在巨噬細胞存活的必需因子。它由WioP蛋白、WioQ蛋白和受它們調節的系列基因組成。PhoP/WioQ蛋白能對脂多糖(LPQ成分中的類脂A進行結構修飾，改變LPS刺激宿主細胞細胞因子表達的水平，而減少內毒素作用。phoP/phoQ基因編碼高度保守的雙因子調節系統，其產物參與調節酸性磷酸酶的合成，促使細菌在巨噬細胞內的生存，與鼠傷寒菌的毒力、侵襲力密切相關。因此PhoP/phoQ基因缺失突變的沙門氏菌是減毒株，并為接受宿主提供了安全保證。1997年Destoumieux等研究學者首次從凡納濱對蝦的血淋巴中分離得到對蝦抗菌肽penaeidins家族，隨后對其結構、功能、表達調控等方面進行了深入的研究 (Destoumieux D,Bulet P,Loew D. Penaeidins,a new family of antimicrobialpeptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei(Decapoda). J. Biol. Chem. 1997,272 (28) 398-406)。penaeidins家族是一種新型的天然抗菌肽，并具有與DNA或幾丁質結合功能，現已在不同對蝦中發現了超過40種penaeidin存在。Penaeidins分子大小為5. 48-6. 62kDa, 是陽離子抗菌肽。Penaeidins具有兩個活性結構域，N末端的區域有一個富含脯氨酸結構域，C末端區域含有4-6個半胱氨酸，可以形成2-3對二硫鍵，這兩個結構域在penaeidins 各個亞家族中都高度保守，但各個penaeidins亞家族之間也具有一定差異性。研究學者由 cDNA合成的氨基酸序列中發現，Penaeidins的合成要經過信號肽的前體合成過程。該信號肽位于Penaeidins的前端，且該信號肽氨基酸序列高度保守，由19-21個氨基酸殘基組成。 研究表明penaeidins初始翻譯產物均含有信號肽，該信號肽主要負責Pen的加工和翻譯后運輸。本發明將一種對蝦抗菌肽Penaeidin-2的信號肽與鯉魚生長激素基因融合，并將融合基因構建到真核表達載體pcDNA3. 1-中，質粒pcDNA3. 1㈠一signal-GH通過電轉的方法轉入到減毒的鼠傷寒沙門氏菌&ilm0nella typhimurium W0420中，制備促進克氏螯蝦生長的口服DNA疫苗。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種口服DNA疫苗基因工程菌株，該菌株是減毒鼠傷寒沙門氏菌，具有較好的安全性。將對蝦抗菌肽Penaeidin-2信號肽與鯉魚生長激素基因融合，并將融合基因構建到真核表達載體pcDNA3. 1-中，質粒pcDNA3. 1 (-)-signal-GH通過電轉的方法轉入到減毒的鼠傷寒沙門氏菌Mlmonella typhimurium W0420中，制備促進克氏螯蝦生長的口服DNA疫苗。通過口服應用于克氏螯蝦養殖試驗，結果證明該口服DNA 疫苗具有促進對蝦生長發育，減毒鼠傷寒沙門氏菌Mlmonella typhimurium W0420能夠將質粒DNA運送到克氏螯蝦幼蝦體內，生長激素口服DNA疫苗促進克氏螯蝦幼蝦生長。本發明的另一個目的是在于提供了一種口服DNA疫苗基因工程菌株的制備方法， 易于工業化生產，操作簡單，成本低，安全性好。該口服DNA疫苗具有轉運促生長的DNA疫苗到克氏螯蝦體內的能力，并且該DNA疫苗能夠明顯促進克氏螯蝦幼蝦生長；具有水產養殖業的應用前景。本發明的再一個目的是在于提供了一種口服DNA疫苗基因工程菌株在克氏螯蝦幼蝦養殖業中的應用。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術方案本發明的技術要點之一是基因工程菌株的構建。本實驗所涉及的分子生物學方法為常規方法，為本領域人員所熟悉。本發明中未詳細闡述的請參見《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾等主編。一種基因工程口服DNA疫苗的制備方法，其步驟如下1.鯉魚生長激素(carp mature growth hormone)成熟肽基因的制備用兩條鯉魚腦垂體，按照RNA提取試劑盒的方法提取其總mRNA后，通過RT-PCR 得到總cDNA，根據GenBank鯉魚生長激素的cDNA序列，設計并合成引物，以上述得到的總 cDNA為模板，PCR擴增得到鯉魚生長激素GH基因，PCR產物通過DNA凝膠電泳檢測，回收 PCR產物并將其克隆到pGEM-T載體(在promega公司購置)中，轉化到大腸桿菌JM109 (在 INVITR0GEN公司購置)，挑取單菌落培養，用堿裂解法小量(15-20 μ g)提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序，得到的陽性克隆子即為包含gh基因的大腸桿菌，命名為pGEM-T-GH。2.融合基因Sgh的制備PCR擴增sgh基因通過PCR重疊延伸技術分3次PCR合成sgh。以實驗室保存的 pGEM-T-GH 質粒為模板，上游引物 Pl :5_TTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCATGGGGTCAGACAAC3_，下游引物 P4 5 GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3 劃線處為 XhoI 位點，退火溫度為56°C，PCR擴增目的片段，電泳并作回收；以上一步回收產物為模板，以上游引物P2 :5_GT CTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTG3_,下游引物 P4 5 GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTT GGAATCCAGGGATCT3_，退火溫度56°C做PCR，電泳并作回收；以上一步回收產物為模板，以上游引物 P3 5 GCGGCTAGCATGGGGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTC3 (劃線處為 NheI 位點)，下游引物 P4 5 GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA3，退火溫度 56°C 做 PCR，PCR 擴增目的基因sgh。PCR產物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產物并將其克隆到pGEM_T載體(在 promega公司購置)中，轉化到大腸桿菌JM109 (在INVITR0GEN公司購置)，挑取單菌落培養，用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序，得到的陽性克隆子即為包含sgh 基因的大腸桿菌，命名為pGEM-T-SGH。3.融合基因真核表達載體的構建用限制性內切酶NheI，XhoI 雙酶切 pGEM-T-SGH和 pcDNA3· 1 (-)(購置 hvitrogen 公司)，膠回收開環質粒pcDNA3. 1㈠和SGH基因的片段，4°C連接后轉化到感受態JM109 中，所得到的陽性克隆子命名為JM109/pcDNA3. l(-)—signal-GH。4.質粒轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌將質粒pcDNA3. 1(-)-signal-GH (5 μ 1)轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌 Salmonellatyphimurium W0420感受態細胞中。PCR鑒定篩選出陽性轉化子，所得陽性克隆即為本發明涉及的口服DNA疫苗Salmonella typhimuriumff0420/ pcDNA3. l(-)—signal-GH。一種基因工程口服DNA疫苗菌株，其特征在于，該疫苗為基因工程菌株， Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3. 1(-)—signal-GH, CCTCC NO :M2011233。戶;f白勺■ @ 工禾呈胃 tt Salmonella typhimurium W0420/ pcDNA3. 1(-) —signal-GH,重組質粒 /pcDNA3. 1 (-)—signal_GH 為本發明所構建。所述的基因工程菌株 Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3. 1 (-)—signal-GH，重組質粒 pcDNA3. l(-)--signal-GH為本發明所構建，保藏編號保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年7月4日，分類命名CCTCC NO M2011233, Salmonella typhimuriu W0420/pcDNA3. 1 (-)—signal-GH。所述的一種分離的蛋白質(pcDNA3. 1(-)-signal-GH編碼基因)，其序列為SEQUENCEN0. 1所示的核苷酸序列。 所述的一種分離的蛋白質，蛋白SGH是具有SEQUENCE NO. 2的氨基酸序列的蛋白。其序列為SEQUENCE NO. 2所示的氨基酸序列。通過上述的制備，獲得了因工程菌株Salmonella typhimuriumff0420/ pcDNA3. 1 (-)—signal-GH, 一種口服DNA疫苗基因工程菌株在克氏螯蝦幼蝦養殖業中的應用，其應用基本步驟是本發明與現有報道DNA疫苗相比，其優勢在于(1)本研究以減毒鼠傷寒沙門氏菌&ilmonella typhimurium W0420作為質粒DNA的轉運載體，將質粒DNA轉運到克氏螯蝦幼蝦體內。( 本研究首次通過PCR重疊延伸技術將對蝦抗菌肽Penaeidin-2的信號肽與鯉魚生長激素基因融合，并將融合基因構建到真核表達載體pcDNA3. 1-中。分別將質粒PCDNA3. 1㈠一signal-GH通過電轉的方法轉入到減毒的鼠傷寒沙門氏菌 Salmonella typhimurium W0420 巾。(3) M Μ. M Salmonellatyphimurium W0420/ pcDNA3. 1 (_)—signal-GH包被飼料喂食克氏螯蝦幼蝦，與對照組&ilmonella typhimurium W0420/pcDNA3. 1-克氏螯蝦幼蝦相比，前者生長速率顯著提高。(4)本發明所涉及的口服 DNA疫苗便于大規模生產，成本低廉，操作工藝簡單。


圖1為一種真核表達質粒pcDNA3. 1㈠一signal-GH的構建過程示意圖。圖2為一種真核表達質粒pcDNA3. 1 (-)-signal-GH的酶切和PCR鑒定示意圖。M. DL2000 1. sgh PCR 產物 2· ρcDNA3· 1 (-)--s i gna 1-GH 質粒 3. pcDNA3. 1 (-) —signal-GH 質粒單酶切 /XhoI 4. pcDNA3. 1 (-) -signal-GH 質粒雙酶切 / NheI,XhoI 5.DL10000。圖 3 為一種重組菌 Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3. 1 (-) -signal-GH 的 PCR鑒定示意圖。M Marker D2000 ； 1陰性對照；2沙門氏菌特異引物；3GH特異弓|物
具體實施例方式下面結合附圖及具體實施例子對本發明作進一步說明。在實施例中涉及的所有培養基和分子生物學操作方法為本領域技術人員所熟知。本實驗所涉及的分子生物學方法為常規方法，為本領域人員所熟悉。本發明中未詳細闡述的請參見《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾等主編。實施例1 鯉魚生長激素成熟肽基因(GH)的制備。(1)鯉魚生長激素RNA的提取取兩條鯉魚腦垂體，按照RNeaSyK Kit的操作說明書提取其總RNA，提取得到的總 RNA放置-80°C備用。(2)合成GH cDNA的第一條鏈按照Reverse Transcription System 試劑盒說明書，以 Oligo (dT) 2(1 為引物合成 cDNA 第一鏈。反應體系如下,依次將 12 μ 1 25mM MgCl2 ；6 μ 1 ReverseTranscription IOXBuffer ；6 μ 1 dNTP Mixture IOmM ；2 μ 1 Recombinant RNasinRibonuclease Inhibitor ；4 μ 1 AMV Reverse Transcriptase ；6μ 1 Oligo (dT) 20 Primer ； 15 μ 1 Total RNA加入經DEPC水處理并滅菌過的PCR管中。反應程序為42°C反應1小時，95°C反應5分鐘，4°C反應5分鐘。將上述反應后的產物放置于-20°C以作為目的基因克隆的模板。(3)鯉魚生長激素GH的制備 依據GenBank中已發表的鯉魚生長激素GH cDNA序列，綜合分析后設計合成一對 PCR 引物。上游引物 P1 ATGTCAGACAACCAGCGG，下游引物 P2 CTACAGGGTGCAGTTGG。引物由上海生物工程有限公司合成。以cDNA第一鏈為模板，按照以下反應體系2μ1 cDNA第一鏈； 4μ 1 25mM MgCl2 ；2 μ IReverse Transcription IOXBuffer ；4 μ 1 dNTP Mixture IOmM ； 2 μ 1 Upstream primer(20 μ M/L) ；2 μ 1 Downstream primer(20 μ M/L) ；0.5 μ 1 Taq DNA Polymerase ；3. 5 μ IDEPC處理的去離子水。應用降落式PCR的形式進行反應，其反應參數為95°C預變性 4min，94°C變性 30sec，60-50°C退火 30min，72°C延伸 lmin，20 個循環；94°C 變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸lmin，10個循環，72°C再延伸lOmin。將上述PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳并回收純化。具體步驟如下將上述PCR產物在(質量體積比) 瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下迅速切下要回收的目的條帶。用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的條帶，具體操作如下將單一的目的DNA條帶放入干凈的Eppendorf 管中，稱其重量。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液(凝膠重為0. lg，其體積可視為ΙΟΟμ 1， 以此類推)。55°C水浴10分鐘，其間每3分鐘溫和上下翻轉Eppendorf管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液取650 μ 1加入到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫O0-25°C 以下相同)放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μ 1漂洗液，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600 μ 1漂洗液，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱放入一個干凈的Eppendorf管中，室溫放置5_10分鐘，徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。向吸附膜中間位置懸空滴加50 μ 1洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘。將純化的PCR產物與pGEM-T載體(在promega公司購置)連接。連接體系如下1μ 1 IOXLigation Buffer ；2 μ 1 pGEM-T 載體；6 μ 1 純化后的 PCR 產物；1μ 1 Τ4 DNA Ligase。連接反應液4°C水浴放置過夜。轉化感受態大腸桿菌JM109。從LB平板上挑取單菌落于300 μ 1新鮮液體LB培養基(含終濃度lOOyg/ml氨芐青霉素)中，37°C，300rpm 搖床培養3小時，以此菌液為模板，以上游引物P1、下游引物P2進行PCR初步鑒定，并送上海生工有限公司測序。將陽性克隆的菌液轉接5 μ 1于20ml新鮮液體LB培養基(含終濃度為100yg/ml氨芐青霉素)中，37°C，300rpm搖床培養過夜，堿裂解法小量提取質粒，置于_20°C備用。重組質粒命名為pGEM-T-GH。實施例2 融合基因Sgh的制備。PCR擴增sgh基因通過PCR重疊延伸技術分3次PCR合成sgh。以實驗室保存的 pGEM-T-GH 質粒為模板，上游引物 P3 :5_TTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCATGGGGTCAGACAAC3_，下游引物 P4 5 GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3 劃線處為 XhoI 位點，退火溫度為 56°C，PCR 擴增目的片段。PCR 反應體系5μ1 10XK0D Buffer ；2μ 1 MgCl2 (25mM)； 5 μ 1 dNTP Mixture(2. 5mM) ； 1 μ 1 Upstream primer(25pmol) ；1 μ 1 Downstream primer (25pmol) ;1 μ 1 Template ；1 μ 1 Taq DNAPolymerase (IU/μ 1)；力口無菌水至終體積為 50 μ 1。sgh 基因的 PCR 反應條件為94°C 30s, 56 °C 30s, 68 °C Imin (30 個循環)， 68°C IOmin0將上述PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳并回收純化。具體步驟如下先將PCR 產物在(質量體積比)瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下迅速切下要回收的目的條帶。 用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的條帶，具體操作如下將單一的目的 DNA條帶放入干凈的Eppendorf管中，稱其重量。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液(凝膠重為0. lg，其體積可視為100 μ 1，以此類推)。55°C水浴10分鐘，其間每3分鐘溫和上下翻轉Eppendorf管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液取650 μ 1加入到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫O0-25°C以下相同)放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μ 1漂洗液，12000rpm離心 2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600μ 1漂洗液， 12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm離心 2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱放入一個干凈的Eppendorf管中，室溫放置5_10分鐘， 徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。向吸附膜中間位置懸空滴加50 μ 1洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘。以上一步回收產物為模板，以上游引物 P5 :5_GTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTG3_,下游引物 P4 5 GCGCTCGAGCTACAGGG TGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3_，退火溫度 56°C做 PCR，PCR 反應體系5μ 1 10XK0D Buffer ； 2μ 1 MgCl2 (25mM) ；5 μ 1 dNTPMixture (2. 5mM) ；1 μ 1 Upstream primer (25pmol) ；1 μ 1 Downstream primer(25pmol) ； 1 μ 1 Template ； 1 μ 1 Taq DNA Polymerase(IU/μ 1)；力口無菌水至終體積為50 μ 1。sgh基因的PCR反應條件為94°C 30s, 56°C 30s, 68°C Imin (30個循環)，68°C lOmin。將上述PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳并回收純化。具體步驟如下先將PCR產物在(質量體積比)瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下迅速切下要回收的目的條帶。用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的條帶，具體操作如下將單一的目的DNA條帶放入干凈的Eppendorf管中，稱其重量。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液 (凝膠重為0. Ig,其體積可視為100 μ 1，以此類推)。55°C水浴10分鐘，其間每3分鐘溫和上下翻轉Eppendorf管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液取650 μ 1加入到一個吸附柱中 (吸附柱放入收集管中)，室溫(20-25°C以下相同)放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μ 1漂洗液，12000rpm 離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600 μ 1漂洗液，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱放入一個干凈的Eppendorf管中，室溫放置5_10 分鐘，徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。向吸附膜中間位置懸空滴加50μ 1 洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘。以上一步回收產物為模板，以上游引物 P6 5 GCGGCTAGCATGGGGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTC3 (劃線處為 NheI 位點)，下游引物 P4 5 GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTA3 ,退火溫度 56°C 做 PCR，PCR 擴增目的基因 sgh。PCR 反應體系:5μ 1 IOXKODBuffer ；2 μ 1 MgCl2 (25mM) ；5 μ 1 dNTP Mixture (2. 5mM)； 1 μ 1 Upstream primer(25pmol) ； 1 μ 1 Downstream primer(25pmol) ； 1 μ 1 Template ； 1μ 1 Taq DNAPolymerase (IU/μ 1)；加無菌水至終體積為50 μ 1。sgh基因的PCR反應條件為94°C 30s, 56°C 30s, 68°C Imin (30個循環)，68°C IOmin0將上述PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳并回收純化。具體步驟如下先將PCR產物在(質量體積比)瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下迅速切下要回收的目的條帶。用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的條帶，具體操作如下將單一的目的DNA條帶放入干凈的Eppendorf管中，稱其重量。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液(凝膠重為0. Ig,其體積可視為100 μ 1，以此類推)。 55°C水浴10分鐘，其間每3分鐘溫和上下翻轉Eppendorf管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液取650 μ 1加入到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫O0-25°C以下相同) 放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600 μ 1漂洗液，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入600μ 1漂洗液，12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱放入一個干凈的Eppendorf管中，室溫放置5_10分鐘，徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。 向吸附膜中間位置懸空滴加50 μ 1洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘。實施例3 亞克隆構建用限制性內切酶Nhel，XhoI雙酶切pcDNA3. 1㈠和純化的sgh PCR產物。酶切體系如下依次加入30 μ 1 pcDNA3. 1(-)質粒或純化的PCR產物；4 μ 1 10Xbuffer2 ；1μ 1 NheI ；1μ 1 XhoI ；2μ 1 ddH20。酶切反應條件為37°C，酶切時間3_4個小時。酶切產物經 1% (質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收開環pcDNA3. 1(_)和sgh PCR酶切片段。將sgh PCR酶切片段與開環pcDNA3. 1(_)連接。連接體系如下依次加入2 μ 1開環pcDNA3.1(_) ；6μ 1 sgh酶切片段；1 μ IlOXLigation Buffer ； 1 μ 1 Τ4 DNA Ligase。連接反應體系16°C水浴連接14-16小時，貯于-4°C備用。實施例4 重組質粒轉化大腸桿菌JM109。氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞其步驟是(1)用接種環挑取固體LB平板上新活化的大腸桿菌JM109單菌落，接種到20ml液體LB培養基(將Ig蛋白胨、0. 5g酵母粉、Ig NaCl溶解在75mlddH20中，調整pH值至7. 0， 最后加ddH20定容至IOOml，分裝于五個三角瓶里，115磅滅菌處理20min后備用)中，37°C， 300rpm搖床活化過夜。(2)無菌條件下取60 μ 1上述活化的大腸桿菌于新鮮的20ml液體LB培養基中， 370C，250rpm搖床培養3小時左右至OD6tltl值為0. 4-0. 6。(下述所有步驟均需無菌操作)(3)無菌條件下取1. 5ml上述菌液于無菌Eppendorf管中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至0°c。4000rpm，4°C離心10分鐘，用移液槍吸干上清。
(4)加入300 μ 1冰預冷的0. IM CaCl2溶液重懸菌體沉淀，冰浴30分鐘，4000rpm， 4°C離心10分鐘，用移液槍吸干上清。(5)加入100 μ 1冰預冷的0. IM CaCl2溶液重懸沉淀，即得感受態細胞，置于4°C 保存，24小時內使用為宜。連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞在無菌條件下取過夜連接反應液10 μ 1，加入到100 μ 1大腸桿菌JM109感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。(上述步驟均需無菌操作)42 °C水浴中熱激90秒，迅速移至冰上靜置，冰浴2-3分鐘。加入800 μ 1液體LB培養基，37°C，150rpm輕搖，溫育45分鐘。4000rpm離心10分鐘，吸取800 μ 1上清棄去，將剩余菌液用移液槍輕輕混勻。將上述菌液用無菌三角涂布棒均勻涂布在終濃度為100 μ g/ml Amp的LB平板上，正向放置0. 5 小時，直至液體被全部吸收，倒置平板于37°C培養箱中培養12-16小時。用接種環挑取LB 平板上單菌落于300 μ 1新鮮液體LB培養基(含終濃度100 μ g/ml氨芐青霉素)中，37°C， 300rpm搖床培養3小時，以此菌液為模板，上游引物P6、下游引物P4進行PCR初步鑒定，并送上海生工有限公司測序。由上述方法可以制備得到JM109/pcDNA3. 1 (-)-signal-GH的菌株。實施例5 重組質粒pcDNA3. 1㈠一signal-GH轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌。減毒鼠傷寒沙門氏菌感受態的制備(1)用接種環在LB平板上挑取活化的減毒鼠傷寒沙門氏菌株 Salmonellatyphimurium W0420單菌落,將其接種到5ml液體LB培養基中，37°C，300rpm搖床過夜培養。(2)將培養過夜菌液的以的比例接種到新鮮20mlLB中以300rpm的轉速培養。 待菌液培養至0D600約為0. 6時，取1. 5ml上述菌液于滅菌的Eppendorf小管中，于4°C、 4000rpm離心lOmin，去上清。(3)加入無菌水重懸菌體，4°C、4000rpm離心lOmin，去上清。(4)重復(3) 2次后用100 μ 1冰冷的無菌水重懸菌體。(5)制備的感受態可暫時保存于4°C立即使用。重組質粒轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌(1)將5 μ 1 pcDNA3. 1 (-) —signal-GH質粒加入到制備好的100 μ 1減毒鼠傷寒沙門氏菌&ilmonella typhimurium W0420感受態細胞中混勻。(2)將混合物加入直徑為2mm的電轉化杯底，于1. 5kV，25 μ F的條件下進行電轉。(3)電轉完畢立即加入Iml新鮮LB培養基，于37°C、150rpm溫育45Min。(4)將取100 μ 1菌液均勻涂布于終濃度100 μ g/ml氨芐青霉素的固體LB平板上， 37°C倒置培養過夜。減毒鼠傷寒沙門氏菌陽性重組子的鑒定從平板上挑取單個菌落接種于新鮮液體LB(Amp+)中，37°C、300rpm培養3_4h后， 分別用gh基因特異性引物和沙門氏菌fIiC基因特異性引物進行菌落PCR鑒定，鑒定后重組子命名為 Salmonella typhimuriumff0420/pcDNA3. 1 (-)—signal-GH。實施例6 基因工程口服DNA疫苗的制備及藥效試驗。
將重組菌Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3. 1(-)-signal-GH 和 Salmonellatyphimurium W0420/pcDNA3. 1-于 LB(Amp+)中培養 16h 后 4000rpm、30min 離心收集菌體，菌液稀釋適當倍數后于平板上計數。在37°C水浴鍋中將菌體重懸于含0. 5% (質量體積比)瓊脂的PBS中。克氏鰲蝦商業化飼料與菌懸液以5 1 (g/ml)比例混合包被飼料，保存于4°C備用。將克氏螯蝦按實驗要求分組，8只/盒。飼料以0.4g/只的日劑量投喂克氏螯蝦(相當于IO9CFU/只)，每天投喂一次，共喂食10天。喂食10天后開始每天以0. 4g/只的日劑量投喂商業化飼料20天，在這期間記錄每組幼蝦的生長情況和體重變化。各實驗組每頭克氏螯蝦幼蝦經免疫后平均體重統計
權利要求
1.一種基因工程DNA疫苗，其序列為SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
2.—種基因工程DNA疫苗，其序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
3.一種基因工程DNA疫苗，其特征在于該疫苗為重組基因工程菌株 Salmonellatyphimurium W0420/pcDNA3. 1(-)—signal-GH, CCTCC NO :M2011233。
4.一種用于權利要求3所述的基因工程DNA疫苗的制備方法，包括下列步驟A、鯉魚生長激素成熟肽基因的制備用鯉魚腦垂體，按照RNA提取試劑盒的方法提取其總mRNA后，通過RT-PCR得到總 cDNA，根據GenBank鯉魚生長激素的cDNA序列，設計并合成引物，以得到的總cDNA為模板， PCR擴增得到鯉魚生長激素GH基因，PCR產物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產物并將其克隆到PGEM-T載體中，轉化到大腸桿菌JM109，挑取單菌落培養，用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序，得到的陽性克隆子即為包含gh基因的大腸桿菌，命名為 pGEM-T-GH ；B、融合基因sgh的制備PCR擴增sgh基因通過PCR重疊延伸技術分3次PCR合成sgh，以pGEM-T-GH質粒為模板，上游引物 Pl :5_TTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCATGGGGTCAGACAAC3_，下游引物 P4 5 GCGCTC GAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATCT3 劃線處為 XhoI 位點，退火溫度為 56°C，PCR 擴增目的片段，電泳并作回收；以上一步回收產物為模板，以上游引物P2 :5_GTCTGCCTGGTCTTCT TGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTG3_,下游引物 P4 5 GCGCTCGAGCTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAGGGATC T3_，退火溫度56°C做PCR，電泳并作回收；以上一步回收產物為模板，以上游引物P3 :5_GCG GCTAGCATGGGGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTC3，下游引物 P4 5 GGCCTCGAGCTACTCGGTCTCAGT GCCAGAGTA3_,退火溫度56°C做PCR，PCR擴增目的基因sgh，PCR產物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產物并將其克隆到pGEM-T載體中，轉化到大腸桿菌JM109，挑取單菌落培養，用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序，得到的陽性克隆子即為包含sgh基因的大腸桿菌，為pGEM-T-SGH ；C、融合基因真核表達載體的構建用限制性內切酶NheI，XhoI雙酶切pGEM-T-SGH和pcDNA3. 1 (_)，膠回收開環質粒 pcDNA3. 1 (-)和SGH基因的片段，4°C連接后轉化到感受態JM109中，所得到的陽性克隆子為 JM109/pcDNA3. 1 (-) -signal-GH ；D、質粒轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌將質粒pcDNA3. l(-)—Signal-GH(5l·! 1)轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌 Salmonellatyphimurium W0420感受態細胞中，PCR鑒定篩選出陽性轉化子，所得口服DNA疫苗。
5.權利要求3所述的一種口服DNA疫苗基因工程菌株在克氏螯蝦幼蝦養殖業中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種基因工程口服DNA疫苗及制備方法和應用，其步驟A、鯉魚生長激素成熟肽基因的制備用鯉魚腦垂體，提取其總mRNA后，通過RT-PCR得到總cDNA，設計并合成引物；B、融合基因sgh的制備；C、融合基因真核表達載體的構建用限制性內切酶NheI,　XhoI雙酶切pGEM-T-SGH和pcDNA3.1(-)，膠回收開環質粒pcDNA3.1(-)和SGH基因的片段，連接后轉化到感受態JM109中，得到陽性克隆子為JM109/pcDNA3.1(-)--signal-GH；D、質粒轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌將質粒轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌SalmonellatyphimuriumW0420感受態細胞中，得菌株SalmonellatyphimuriumW0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH，為口服DNA疫苗。易于工業化生產，操作簡單，成本低，安全性好。該疫苗具有轉運促生長的DNA疫苗到克氏螯蝦體內的能力，該DNA疫苗能夠明顯促進克氏螯蝦幼蝦生長；具有水產養殖業的應用前景。
文檔編號C12N1/21GK102389575SQ20111036709
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者孟小林, 徐進平, 王健 申請人:武漢凱肽來生物科技有限公司