專利名稱：一種3-羥基丙酸高產菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種3-羥基丙酸高產菌株及其應用，尤其是一種是經物理化學復合誘變得到的酵母菌Candida sp.及其應用于轉化丙酸為3_羥基丙酸。
背景技術：
3-輕基丙酸(3-Hydroxypropionic acid ；又稱 β-Hydroxypropionic acid ；縮寫為3-HP ；分子式C3H6O3 ；CAS號503-66-2 ；pK4. 51 ；分子量90 ；密度1. 08)是一個三碳無手性有機酸，與乳酸互為同分異構體。3-ΗΡ具有羥基和羧基兩個官能團，是很多光學活性物質的前體。它脫水可以生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，還原生成1，3_丙二醇，聚合生成高分子材料，是一種重要的化工平臺產品。2004年美國能源部將其列為當今世界12種最具潛力的化工廣品之一。目前，3-ΗΡ的生產方法是化學合成法，主要有水合丙烯酸法和丙烯腈轉化法。 但在碳末端引入功能團有很大的難度，且其產品不易分離提純，生產成本較高，生產過程存在不安全因素，而微生物發酵方法生產3-ΗΡ可以有效的避免這些不利因素。微生物轉化法生產3-ΗΡ的研究始于上世紀60年代但一直處于實驗室階段。主要包括構建基因工程菌法和野生菌發酵法。基因工程法生產3-ΗΡ主要有兩條途徑以葡萄糖為底物和以甘油為底物的生物轉化路線。目前，已知的可發酵產3-ΗΡ的野生菌株主要有Hansenula miso ； Fusarium merismoides ；Candida rugosa ；Byssochlamys sp. ；Rhodococcus erythropolis LG12 ；Klebsiella terrigena。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種3-羥基丙酸高產菌株，為假絲酵母變種 (Candida sp.)，通過紫外-亞硝基胍-鈷60復合誘變獲得，于2011年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏委員會管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5344，其催化丙酸轉化為3-羥基丙酸的能力增強，同時，耐受丙酸的性能增強。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種應用所述菌株轉化丙酸為3-羥基丙酸的方法，菌株經過種子培養活化后，以4-10%接種量接種發酵培養基，在下發酵培養得到含有3-羥基丙酸的發酵液。為提高3-羥基丙酸的產率，控制發酵培養基PH為6. 5，不限于在發酵培養基中加入濃度為10-30% (V/V)，pH為6. 5的磷酸鹽緩沖液；優選20% (V/V)的磷酸鹽緩沖液 (6. 5)。為了進一步提高3-羥基丙酸的產率，對發酵過程進行優化，發酵M小時后，流加含有葡萄糖/甘油的緩沖液或葡萄糖/甘油水溶液控制發酵過程中葡萄糖濃度在15_25g/ L ；其中優選的添加為發酵48-84h內補加含有葡萄糖/甘油的緩沖液或葡萄糖/甘油水溶液以維持發酵過程中葡萄糖濃度在20g/L。此外，發酵對小時后，流加丙酸-氫氧化鈉-氫氧化鉀-氫氧化銨(8 1 1 1)或丙酸溶液控制發酵過程中丙酸濃度為10-20g/L ；其中優選的添加為在發酵4 后，流加丙酸-氫氧化鈉-氫氧化鉀-氫氧化銨(8 :1:1: 1)或丙酸溶液以維持發酵過程中丙酸濃度為15g/L。3-羥基丙酸的測定方法高效液相色譜法，色譜柱=Ecosile C18柱 (250mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動相3 %甲醇，用H3PO4調pH至2. O ；檢測條件紫外檢測器，柱溫 350C，流速 0. 8mL/min,進樣量 20 μ L0本發明提供的3-羥基丙酸產量較高的突變菌株，其產量高且遺傳性狀穩定。此外，本發明還提供了一種該菌株以丙酸為底物生物轉化3-羥基丙酸的方法，利用此方法 3-羥基丙酸的產量達到23g/L，具有廣闊的前景。
具體實施例方式
實施例1新菌株CGMCC No. 5344的獲得(a)將野生菌Candida sp. CCTCC NO =M 93018用含有丙酸的培養基馴化，挑選得到的出發菌株a;(b)將出發菌株a經紫外-亞硝基胍-鈷60復合誘變，得到混合種子液b ；(c)將b涂布完全培養，得到單菌落點種篩選培養基；(d)培養篩選單菌落，發酵檢測驗證，得到誘變高產株CGMCC No. 5344。步驟(a)中丙酸馴化的濃度為0. 5% -3%。步驟(b)中用15W的紫外燈輻照70s，加入亞硝基胍溶液使其終濃度為25mg/mL， 鈷60劑量為IOOOGy誘變效果最佳。步驟(c)中完全培養基配方為(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏10，瓊脂粉 20;篩選培養基配方為(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏10，瓊脂粉20，丙酸2%。步驟(d)中發酵檢測方法為高效液相色譜法，色譜柱Ecosile C18柱 (250mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動相3 %甲醇，用H3PO4調pH至2. 0 ；檢測條件紫外檢測器，柱溫 350C，流速 0. 8mL/min,進樣量 20 μ L0實施例2突變株CGMCC No. 5344發酵產3-ΗΡ(1)種子液培養將活化的菌落接種種子培養基，220r/min，3(TC培養20h。種子培養基(g/L)葡萄糖 / 甘油 20，酵母膏 10，(NH4) 2S0415，KH2P049，K2HP043, MgSO4 · 7H20 1. 5， FeSO4 · 7H20 0. 03，pH 6. 8 士 0. 2。(2)發酵培養發酵培養基(g/L)酵母膏10，(NH4) 2S0415，KH2P049，K2HP043, MgSO4 · 7H20 1· 5， FeSO4 · 7H20 0. 03，CaCl2O. 04，丙酸 15，TES 5mL，用 KOHAl2SO4 調節 pH 至 6. 0士0. 2，115°C, 滅菌15min，與50g/L葡萄糖/甘油混合。以4%接種量接種，220r/min，30°C培養，發酵96h，將發酵液離心，稀釋，微孔濾膜過濾后，HPLC測定野生菌與突變株CGMCC No. 5344的3-羥基丙酸產量分別為3. Og/L和 23g/L0實施例3靜息細胞對3-羥基丙酸產量的影響無外源碳源存在的情況下，3-HP會被菌體反耗供能用于維持菌體的正常代謝，相比較而言野生菌Candida sp.的3_羥基丙酸降解速率要高于CGMCC No. 5344(如表1所示)°靜息細胞的制備與培養發酵培養基中培養7 后，離心收集菌體，用0. 2M磷酸鹽 緩沖液洗滌菌體兩次。轉接到含有1 %的3-羥基丙酸的磷酸鹽緩沖液中，回轉式搖床220r/ min, 30°C培養48h。每1 取樣檢測菌體濃度及3-HP的含量。表1出發菌Candida sp.與CGMCC No. 5344的靜息細胞對3-HP的降解
權利要求
1.一種3-羥基丙酸高產菌株，為假絲酵母變種(Candida sp.)，于2011年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏委員會管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5344。
2.權利要求1所述的菌株，其特征在于催化丙酸轉化為3-羥基丙酸的能力增強，同時， 耐受丙酸的性能由0. 2%增強到3%。
3.權利要求1所述的菌株，其特征在于通過紫外-亞硝基胍-鈷60復合誘變獲得。
4.一種應用權利要求1所述菌株轉化丙酸為3-羥基丙酸的方法，其特征在于種子培養后，以4-10%接種量接種發酵培養基，在下發酵培養96小時得到含有3-羥基丙酸的發酵液。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于發酵培養基中加入濃度為10-30%，pH為 6. 5的磷酸鹽緩沖液控制發酵過程中的pH，所述百分比為體積百分比。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于發酵M小時后，流加含有葡萄糖/甘油的緩沖液或葡萄糖/甘油水溶液控制發酵過程中葡萄糖濃度在15-25g/L。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于發酵M小時后，流加丙酸-氫氧化鈉-氫氧化鉀-氫氧化銨(8 1 1 1)或丙酸溶液控制發酵過程中丙酸濃度為10-20g/L。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于優選發酵48-84小時內流加含有葡萄糖/ 甘油的緩沖液或葡萄糖/甘油水溶液控制發酵過程中葡萄糖濃度在20g/L。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于優選發酵4 后，流加丙酸-氫氧化鈉-氫氧化鉀-氫氧化銨(8 :1:1: 1)或丙酸溶液控制發酵過程中丙酸濃度為15g/L。
全文摘要
本發明公開了一種3-羥基丙酸高產菌株，是Candida sp.的復合誘變菌株，所得菌株遺傳性狀穩定，產量性狀穩定，適合工業推廣，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.5344。本發明還公開了一種轉化丙酸為3-羥基丙酸的方法。通過在菌體生長達到穩定期時，限制性補加葡萄糖使其濃度在15-25g/L，控制菌體濃度OD600為18-20，流加丙酸-氫氧化鉀-強氧化鈉-氨水(8∶1∶1∶1)，使丙酸濃度維持在10-20g/L，發酵培養96h，即可得到含有3-羥基丙酸的發酵液，在優化后培養基上3-羥基丙酸的產量提高到30g/L。
文檔編號C12P7/42GK102382778SQ20111037160
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月21日 優先權日2011年11月21日
發明者方慧英, 范俊英, 諸葛健, 諸葛斌 申請人:江南大學