專利名稱：一種檢測水稻線粒體組型的srap分子標記方法
技術領域：
本發明涉及分子標記檢測技術領域，更具體涉及一種定性檢測水稻不育系和種質資源中線粒體組型的方法，適用于各種常規水稻品種、雜交稻組合和不育系的鑒定、檢測。
背景技術：
水稻線粒體屬于母系遺傳，因而通過線粒體標記可以追蹤水稻細胞質的來源。線粒體雖然被認為突變速率慢于細胞核，但由于線粒體基因間區域容易發生重組或者發生細胞內基因組的交流，因而變異也非常豐富。這種差異在遺傳水平可作為線粒體基因組的特異分子標簽。利用線粒體分子標簽可以標記線粒體組型，因而能有效區分不同的水稻品種。 由于分子標記具有唯一性，可以通過簡單的PCR擴增技術跟蹤特定的基因組型。具有操作簡單、結果可靠、效率高、不依賴表型等優點，在遺傳育種上已被廣泛應用，具有非常廣闊的應用前景。在農作物雜種優勢利用中，細胞質雄性不育系是最常用的不育類型，創建某一類型細胞質雄性不育系的分子標記有助于區分不同類型雜交品種。蓋樹鵬等曾試圖發展洋蔥細胞質雄性不育系線粒體基因組的特異性SCAR分子標記。由于其獲取的A、B之間兩條 RAPD差異條帶在轉化成SCAR標記后，一條沒有特異性擴增，而另一條不能與細胞質雄性不育株發生共分離(蓋樹鵬，孟祥棟，徐麗娟。大蔥雄性不育分子標記輔助選擇的研究。分子植物育種，2004，2 (2) =223-228)，缺乏特異性，在實際生產中沒有應用價值。而何光華等利用RAPD技術篩選了水稻野敗型珍汕97A和珍汕97B葉綠體基因組的差異，在A、B之間找到了一條特異性的穩定擴增條帶，測序發現該序列位于葉綠體 tRNA-Leu gene的上游，其中A較B中多了一段包含AGAAAA六堿基的重復片段單元，據此序列將其轉換成SCAR標記后，該片段在5個野敗不育系中可以穩定擴增，而保持系中沒有。 因此，他們認為該片段可以作為篩選野敗型不育系的特異性分子標記(He GH, Hou L，Xiao YH et al. Euphytica, 2003,131 :269-274)。此外，日本的Ichii等在野敗型不育系珍汕97A 中發現一條I. 6Kb的差異性擴增帶。進一步提取不育系、保持系和恢復系的線粒體基因組 DNA進行PCR驗證，發現該片段為不育系線粒體所特有，而保持系和恢復系線粒體均不含此片段。對雜種Fl和F2的驗證表明該片段與不育株共分離，說明該標記的確為野敗型不育系所特有。但若以該標記引物對DA型不育系線粒體DNA進行擴增，其擴增帶為兩條，一條為 0.7Kb, 一條為 IKb,與野敗型的不同(Ichii M, Hong DL, Ohara Y et al. Euphytica, 2003， 129 =249-252)。以上兩種方法均建立在野敗型不育系珍汕97A中特異性擴增的DNA片段基礎之上，只能跟蹤具有與珍汕97A完全相同的細胞質，因而主要適用于野敗型雜種及其細胞質線粒體組型的鑒定。在配子體型細胞質雄性不育系中，包臺型細胞質雄性不育的相關基因orf79和紅蓮型細胞質雄性不育相關基因atp6-orfH79，屬于等位基因變異(Kadowaki KT, Suzuki T， Azama S.Mol Gen Genet，1990，224 :10-16 ；Yi P,Wang L，Sun QP，ZhuYG. Chinese Science Bulletin，2002，47 :744-747)。而且以orf (H) 79作為PCR分子標記在水稻中篩選到一系列攜帶該基因的種質資源，說明該基因分布廣闊，不為包臺和紅蓮所特有。因此，利用不育基因orf (H)79作為分子標記不足以有效區分某一類型的細胞質，需要有更多其他分子標記的參與。與此同時，植物線粒體基因組中積累了大量的非編碼DNA序列，他們并不編碼與細胞質雄性不育相關的功能基因，這些特定的DNA序列雖然在某一水稻生態型中具有唯一性，可以作為某一個或某一類野生稻和農家種細胞質線粒體組型標記。為了便于鑒定水稻線粒體組型，并通過線粒體組型進一步鑒定水稻品種和雜交稻組合，我們根據水稻線粒體基因組重復序列區的分子特征設計引物，通過大量篩選，建立了一套多態性豐富、穩定可靠的分子標記，可以有效區分不同的水稻線粒體組型。用于不育系和水稻品種的遺傳鑒定。
發明內容
本發明公開了一種定性檢測水稻線粒體組型的一套SRAP分子標記的方法，它以水稻線粒體基因組遺傳變異為基礎，通過對線粒體重復序列區的廣泛篩選，建立了一套多態性豐富、檢測靈敏的分子標記。快速、準確地通過實驗手段檢測水稻品種和種質資源。本發明方法操作簡便、穩定可靠，可用于不同細胞質雄性不育系鑒定和水稻品種的鑒定，具有準確、聞效、快速的特點，提聞了不育系和新品種鑒定的效率。為了實現上述目的，本發明涉及以下技術措施一種檢測水稻線粒體組型的SRAP分子標記方法(定性檢測水稻線粒體組型的一套SRAP分子標記方法)，其步驟是A、線粒體 SRAP (Sequence-related Amplification Polymorphism)分子標記 PCR 引物及其參數
權利要求
1.一種檢測水稻線粒體組型的SRAP分子標記方法，其步驟是A、線粒體SRAP分子標記PCR引物及其參數
全文摘要
本發明公開了一種檢測水稻線粒體組型的SRAP分子標記方法，其步驟是首先是SRAP標記引物設計及其特征參數；其次是PCR擴增體系的建立；選擇水稻細胞質雄性不育系材料，生長至兩葉一心時，材料取幼苗在液氮中研磨成粉狀提取總DNA；第三是PCR擴增體系的建立標準的PCR擴增反應體系為25μl；第四是線粒體組型分子檢測結果的統計分析。本發明以水稻線粒體基因組遺傳變異為基礎，通過對線粒體重復序列區的廣泛篩選，建立了一套多態性豐富、檢測靈敏的分子標記。快速、準確地通過實驗手段檢測水稻品種和種質資源。方法操作簡便、穩定可靠，可用于不同細胞質雄性不育系鑒定和水稻品種的鑒定，具有準確、高效、快速的特點，提高了不育系和新品種鑒定的效率。
文檔編號C12Q1/68GK102586417SQ20111039309
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月1日 優先權日2011年12月1日
發明者朱英國, 李紹清, 謝紅衛, 錢明娟 申請人:武漢大學