專利名稱：食品及飼料中鵝成分的實時熒光pcr檢測方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和核酸檢測技術領域。具體地，本發明涉及食品或飼料中鵝成分的實時熒光PCR檢測方法和試劑盒。
背景技術：
為確保食品成分的真實性，質檢“十二五”規劃綱要明確指出“十二五”期間需重點加強開展食品摻假鑒別技術研究。《中華人民共和國產品質量法》、《中華人民共和國食品衛生法》和《食品標識管理規定》(國家質量監督檢驗檢疫總局令第102號)等法律法規禁止產品的造假摻假行為和正確標識食品標簽。然而，由于經濟利益驅動，一些不法商在食品的加工過程中，常常以價格低廉的原料替代或摻入高價格的原料，或者根本就不添加標注的原料成分。在加工產品的造假摻假過程中，經常會使用有毒有害物質(如染色饅頭等)， 危害人民身體健康。在動物產品原料和加工產品中，經常出現成分的摻假造假和無意污染現象。人為攙假主要是不法商要降低成本或增加品質，以謀取巨額的經濟利益。這種摻假造假、以次充好的行為除了影響我國經濟，另一個最主要的是影響人體健康和畜禽安全。瘋牛病和禽流感的世界性爆發和流行，人們越來越關注食品安全和飼料安全。部分人群因為健康緣故也只食用素食部分。瘋牛病的發生是由于反芻動物食用了含有動物成分的飼料，所以各國禁止含有動物成分的飼料喂養動物。含有禽成分的飼料可能具有傳播禽流感的風險。用這些摻假的飼料喂養動物，會影響畜禽的健康生長及我們的畜牧業安全。因此迫切需要開發有效的鑒定各種禽類成分的方法，以規范市場，保護消費者權
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發明內容
本發明的目的在于提供食品及飼料中鵝成分的實時熒光PCR檢測方法。本發明的另一目的在于提供食品及飼料中鵝成分的實時熒光PCR檢測的試劑盒。在本發明的第一方面，提供一種鑒定鵝成分的方法，所述方法包括以待測樣品的DNA為模板，以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物進行PCR 擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含鵝成分。在一個優選例中，在以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物以及SEQID NO 3所示的Taqman MGB探針進行實時熒光PCR檢測。在另一優選例中，所述的待測樣品是食品或飼料。在另一優選例中，所述方法的檢測靈敏度為10_4ng/y L DNA。在本發明的另一方面，提供一種引物，所述引物是引物對，其序列如SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示。在本發明的另一方面，提供一種Taqman MGB探針，所述的探針序列如SEQ ID NO 3所示。
在本發明的另一方面，提供所述的引物和/或所述的Taqman MGB探針的用途，用于從待測樣品中鑒定鵝成分。在本發明的另一方面，提供一種鑒定鵝成分的試劑盒，其中包括所述的引物；和/ 或所述的iTaqman MGB探針。在一個優選例中，所述試劑盒中還包括含有鵝成分的檢測標準品(該標準品中鵝成分含量是確定的)。在另一優選例中，所述試劑盒中還包括選自以下的試劑DNA提取試劑(或試劑盒)，Taq酶，PCR緩沖液，DNA聚合酶，和/或說明鑒定鵝成分的方法的使用說明書。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1、鵝源性引物探針特異性實時熒光PCR檢測圖譜。僅在鵝DNA中產生擴增產物，而在其它物種DNA樣品中均無擴增。圖2、鵝源性引物探針靈敏度實時熒光PCR檢測圖譜。擴增曲線(平滑的弧形線)由左至右分別對應于10%鵝DNA，1%鵝DNA，0. 鵝 DNA, 0. 01%· ΝΑ，0. 001%鵝 DNA，0. 0001%鵝 DNA。圖3、鵝肉粉重量比的實時熒光PCR檢測靈敏度圖。擴增曲線從左到右(平滑的弧形線)分別(平滑的弧形線)以下樣品的DNA 10% 鵝肉粉；鵝肉粉；0.鵝肉粉；0. 01%鵝肉粉；0. 001%鵝肉粉。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究和試驗，首次揭示一種可特異性鑒定鵝成分的引物，所述引物針對含有鵝成分的DNA可發生特異性擴增(獲得陽性結果)，而對沒有鵝成分的DNA不發生特異性擴增(獲得陰性結果)。為了簡化PCR擴增方法，本發明人還設計了配合所述引物的、用于進行實時熒光PCR的Taqman MGB探針。采用所述的引物配合Taqman MGB探針，可良好地應用于鑒定鵝成分，并且具有良好的再現性、靈敏度。目前開發有效的鑒定各種禽類成分的方法的難點在于這些成分通常在外觀、品質上非常相近，導致人們難分真偽。即使采用一些基因或蛋白水平上的技術，也由于許多禽類在親緣關系上較近，難以找到符合標準的、檢測準確性高、實用性強的檢測靶標。為此，本發明人經過深入的研究和大量的篩選，找到了合適的檢測靶標，基于此開發了實時熒光PCR 檢測鵝成分的方法。本發明人通過對引物的篩選，獲得一類可特異性鑒定鵝成分的引物，其對于鵝的 DNA發生特異性擴增，而對沒有鵝成分的DNA不發生特異性擴增。因此，本發明提供一種引物，所述的引物具SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核
苷酸序列。本發明的這些引物還可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發光物質進行標記。本發明還提供一種探針，所述的探針具SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；較佳地，所述的探針是iTaqman MGB探針，從而便于實時熒光檢測。利用本發明的引物及探針，只需進行常規的PCR反應和/或瓊脂糖凝膠電泳，并通過判斷相應的PCR產物的有無，就可以準確、快速地判斷待測樣品是否含有鵝成分，而且所需的樣品量很少。基于本發明所提供的適用于鑒定鵝成分的特異性引物及探針，本發明還提供了一種鑒定鵝成分的方法，所述方法包括以待測樣品的DNA為模板，以SEQ ID N0:1和SEQ ID NO 2所示的引物進行PCR擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含鵝成分。聚合酶鏈反應(PCR)技術是本領域技術人員熟知的技術，其基本原理是體外酶促合成特異DNA片段的方法。本發明的方法可采用常規的PCR技術進行。作為本發明的優選方式，利用所述引物，采用Taqman MGB實時熒光PCR方法來進行鵝成分的鑒定。TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的 3' -5'外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數量。TaqMan探針根據其3'端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種普通的iTaqMan探針和TaqMan MGB探針。TaqMan MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher)，本身不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB(Minor Groove Binder)修飾基團。獲取待測樣品的DNA的方法是本領域技術人員所熟知的技術，例如可采取傳統的酚/氯仿/異戊醇法，或者可采用一些商購的DNA提取試劑盒，這類試劑盒是本領域技術人員熟知的。本發明還涉及一種用于鑒定鵝成分的試劑盒，所述試劑盒中含有SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2所示的引物；更佳地，所述的試劑盒中還含有SEQ ID NO :3所示的探針。此外，所述的試劑盒還可含有其它鑒定鵝成分的試劑，如(但不限于)(A)各種PCR反應用試劑，例如但不限于Taq酶，PCR緩沖液，dNTP，DNA聚合酶等； 或(B)各種提取DNA(即制備PCR反應模板)所需的試劑，例如但不限于酚、氯仿、 異戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA的試劑盒。此外，所述的試劑盒中還可含有鑒定鵝成分的使用說明書和/或標準操作程序。本發明所述的試劑盒可實現快速檢測、批量檢測鵝成分的目的。本發明的主要優點在于(1)首次揭示一種可特異性鑒定鵝成分的引物，所述的引物特異性良好，對于鵝能夠實現特異性擴增，而對于鵝以外的其它通常用作仿制鵝成分的物質則不能特異性擴增。 并且，所述引物具有良好的再現性、結果穩定可靠。(2)利用所述的引物或含有所述引物的檢測試劑盒，可快速、大批量地檢測鵝成分，從待測樣品中快速準確地區分真假鵝成分，并且所需樣品量少，操作簡單。(3)較佳地，本發明應用Taqman MGB實時熒光PCR技術，可快速實現食品中鵝源性成分的準確鑒定。(4)本發明的方法的推廣應用對保障產品的質量，保護消費者知情權和選擇權，維護正常的經濟秩序等提供了技術支持。
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下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法1. 1樣品收集和制備鵝肉、雞肉、鴨肉、火雞、鴿子、鵪鶉、牛肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、梅花鹿肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、兔肉、野兔肉、野豬肉、貉肉、蛇肉、牛蛙、蛤蟆肉、草蝦、螃蟹、甲魚、牡蠣、貽
貝、蝸牛等27種常見動物材料和大豆、玉米、大麥、小麥、大米、馬鈴薯、番茄、豌豆、棉花、油菜等10種常見植物材料購自上海的農貿市場或超市。6種雞肉和蛋產品，各4種鴨肉、火雞肉、鴿子、鵪鶉肉和蛋產品，15批其他成分食品(肉干、肉醬、餅干等)購自上海的超市。12批進口鵝肝、鵝脯肉，15批禽肉骨粉飼料，20 批其他成分飼料(包括豬腸膜蛋白粉、多福蛋白、乳清粉、寵物飼料等)由上海市海關口岸抽樣提供。1. 2 試齊[J(1)實時熒光PCR檢測的引物和MGB熒光探針序列設計了許多種引物和探針，經過反復比較篩選，獲得了適用于擴增鵝源性成分的特異性PCR引物和探針，序列為正向引物5，-TTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGT-3，(SEQID NO 1)；反向引物5，-CTTGTTAGCGGTGTGCTATTGTGT-3，(SEQID NO 2)；探針5，-FAM-CTAGAGGAGCCTGTTCT-MGB-3，(SEQID NO 3)；(2)液氮；(3)CTAB 提取緩沖液20g/L CTAB，，1. 4mol/L NaCL,0. lmol/L Tris-HCL, 0. 02mol/L Na2EDTA, pH8. 0 ； (4)蛋白酶 K 溶液(20mg/mL)；(5) CTAB 沉淀液5g/L CTAB, 40mmol/L NaCl ；(6) NaCl 溶液(1. 2mol/L)；(7)異丙醇；(8) 70% 乙醇；(9)TE 緩沖液，ρΗ8·0 ；(IO)ABI TaqMan Universal PCR Master Mix(Part Number 4304437)；(11)超純水(ddH20)。1. 3儀器設備ABI 7300實時熒光PCR儀；天平；移液槍；離心機；恒溫孵育器；冷凍碾磨機；DNA 冷凍干燥離心機；核酸蛋白濃度分析儀；Eppendorf離心管；PCR反應管。1.4樣品的DNA提取
將樣品(各種動物或植物材料)研磨后，稱取200mg左右固體樣品或200 μ L液體樣品于 2mL離心管中，加入 1. 5mL CTAB提取緩沖液(20g/L CTAB, 1. 4mol/L NaCL，0. lmol/L Tris-HCL,0. 02mol/L Na2EDTA,pH8. 0)和 10 μ L 蛋白酶 K(20mg/mL)溶液。60°C振蕩過夜后 13000g離心lOmin，轉移上清液到新的離心管中。加入750 μ L氯仿后用力振蕩，13000g離心5min，將上清轉移到新的離心管中。加入2倍體積的CTAB沉淀溶液(5g/L CTAB, 40mmol/ L NaCl)，室溫靜置60min，13000g離心15min，棄去上清。加入350 μ L NaCl溶液將沉淀進行懸浮。再加入350 μ L氯仿，渦旋振蕩進行混勻，13000g離心IOmin。轉移上清后加入0. 6 倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20min，13000g離心lOmin，棄去上清。加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于200 μ L TE溶液中用核酸蛋白含量測定儀測定DNA濃度。也可用等效的商業化DNA提取試劑盒提取模板DNA。其中，鵝肉DNA 溶液分別稀釋成 10ng/yLUng/yL,0. Ing/μ L、0. Olng/μ L、 0. OOlng/μ L、0. OOOlng/μ L、0. OOOOlng/μ L 的 DNA 樣品。用于靈敏度測試。其中，用雞肉粉與鵝肉粉混合，配制成分別含有10%U%>0. 1%,0.01%,0. 001% 和0.0001%鵝肉粉含量(W/W)的混合樣品。上述方法提取DNA。1. 5鵝實時熒光PCR測試1. 5. IPCR 反應體系進行實時熒光PCR檢測的反應體系見表1。表1、實時熒光PCR檢測的反應體系
_試劑名稱_25μ1反應體系(JiL)
2 χ Real Time PCR Buffer12.5
正向引物(5μΜ)1.5 正向引物(5μΜ)1.5
探針(5μΜ)0.5
H2O8.0
模板 DNA(約 IOOng DNA)1.01. 5. 2PCR反應循環參數實時熒光PCR 反應循環參數50°C，2min ;95°C，10min ;95°C 15s, 60°C lmin，循環
40次。1. 618S rRNA基因PCR擴增與檢測使用18S rRNA基因擴增真核生物內源基因，以確保所提取的DNA適合于PCR擴增。 檢測所用18S rRNA基因引物序列為5，-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3，(SEQ ID NO 4)；5，-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3，(SEQ ID NO 5)；18S rRNA 基因引物 PCR 反應體系1XPCR 緩沖液，2. 5mmol/L Mg2+，IU Taq 酶， 200ymol/L dNTPs，引物100nmol/L，模板lOOng，反應體積為25 μ 1。擴增條件為-MV, 3min ；94°C，20s, 54°C，40s, 72°C，40s, 40 個循環；72°C，5min。
取10 μ L PCR產物，加1 μ LlOX上樣緩沖液點樣進行電泳。PCR產物電泳檢測所用的凝膠濃度為1.5-2.0%。II.實施例實施例1、真核生物特異引物18S rRNA引物的檢測結果用真核生物18S rRNA特異引物擴增本實驗提取的所有DNA溶液(包括各種動物或植物材料的DNA溶液)，所有DNA溶液均能出現137bp的特異擴增條帶。上述結果表明，所有抽提的DNA溶液適合于PCR測試。實施例2、鵝成分的實時熒光PCR特異性檢測用本發明建立的實時熒光PCR檢測鵝源性成分的引物和MGB熒光探針，對鵝和供試的其他26種常見動物和10種常見植物進行檢測。結果發現，采用所述的特異性引物和探針，僅在鵝DNA中產生擴增產物，而在其它物種DNA樣品中均無擴增，如圖1。上述結果說明，本發明建立的檢測方法具有物種特異性。實施例3、鵝成分的實時熒光PCR檢測靈敏度對IOng/μ L(10% )，Ing/μ L(1 % ) ,0. lng/μ L(0. 1 % ) ,0. Olng/μ L(0. 01 % ), 0. OOlng/μ L(0. 001% ) ,0. OOOlng/μ L(0. 0001% ),0. OOOOlng/μ L (0. 00001% )鵝 DNA 進行檢測。結果如圖2，在大于0. 0001%的鵝DNA中出現擴增。上述結果表明，鵝源性檢測引物具有物種特異性，且檢測靈敏度為0. OOOlng/ UL(0. 0001% )鵝DNA，可見本發明的檢測引物及檢測方法靈敏度高。用雞肉粉10倍系列混合配制不同含量的鵝肉粉樣品，提取獲得DNA溶液。使用鵝成分引物和探針對對應于10%u%>0. 1%,0.01%,0. 001%和0. 0001%鵝肉粉含量(W/W) 的樣品DNA分別進行檢測。結果如圖3，10%、1 %、0. 1%、0. 01 %和0.001 %鵝肉粉均出現擴增曲線，而 0. 0001%鵝肉粉未出現擴增曲線。上述結果表明，在重量百分比水平上，該方法的檢測靈敏度為0.001%鵝肉粉(W/ W)，可見本發明的檢測引物及檢測方法靈敏度高，不受相近成分的影響。實施例4、食品中鵝成分檢測的應用采用本方法對12批海關口岸的進口鵝肝、鵝脯肉進行檢測，均檢出鵝成分。在6 種雞肉和蛋產品，各4種鴨肉、火雞、鴿子、鵪鶉肉和蛋產品，15批其他成分食品中未檢出鵝成分。在1批美國進口的禽肉骨粉和1批澳大利亞進口的禽肉骨粉飼料檢出鵝成分，在其他的14批禽肉骨粉飼料和20批其他成分飼料未檢出鵝成分。經比較和跟蹤，這些分析檢測結果是準確的。綜上，本發明的食品和飼料中鵝成分實時熒光PCR檢測方法，特異性強，靈敏度高，能準確檢測出食品和飼料中的鵝成分，為食品和飼料中鵝成分檢測方法標準化提供了依據。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種鑒定鵝成分的方法，其特征在于，所述方法包括以待測樣品的DNA為模板，以SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的引物進行PCR擴增； 若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含鵝成分。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在以SEQID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物以及SEQ ID NO :3所示的Taqman MGB探針進行實時熒光PCR檢測。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待測樣品是食品或飼料。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的檢測靈敏度為lOlng/yLDNA0
5.一種引物，其特征在于，所述引物是引物對，其序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2 所示。
6.一種Taqman MGB探針，其特征在于，所述的探針序列如SEQ ID N0:3所示。
7.權利要求5所述的引物或權利要求6所述的TaqmanMGB探針的用途，用于從待測樣品中鑒定鵝成分。
8.一種鑒定鵝成分的試劑盒，其特征在于，其中包括權利要求5所述的引物；和/或權利要求6所述的Taqman MGB探針。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括含有鵝成分的檢測標準品。
10.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括選自以下的試劑 DNA提取試劑，Taq酶，PCR緩沖液，DNA聚合酶，和/或說明鑒定鵝成分的方法的使用說明書。
全文摘要
本發明涉及食品及飼料中鵝成分的實時熒光PCR檢測方法和試劑盒。本發明首次揭示一種可特異性鑒定鵝成分的引物及探針，所述引物及探針針對含有鵝成分的DNA可發生特異性擴增，而對沒有鵝成分的DNA不發生特異性擴增。因而，所述引物可良好地應用于鑒定鵝成分，并且具有良好的再現性、靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK102382897SQ201110403988
公開日2012年3月21日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者張舒亞, 蔣靜, 韓麗, 高琴 申請人:上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心