一種實現細胞集落均質性生長的裝置和方法

專利名稱：一種實現細胞集落均質性生長的裝置和方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞集落生長裝置，特別涉及一種實現全能干細胞集落均質性生長的裝置，同時也涉及利用該裝置調控全能干細胞的自我更新和定向分化的方法。
背景技術：
全能干細胞(totipotent stem cell, TSC)是指具有無限分化潛能,能分化成所有組織和器官的干細胞，主要包括胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESC)和誘導多能干細胞(Induced pluripotent stem cells, iPS)兩類。
胚胎干細胞是從哺乳動物早期胚胎中分離培養出來的，其特點是具有發育的全能性，參與整個生物體的發育，并構成人體的各種組織和器官。胚胎干細胞取自原腸胚期的囊胚，進一步分化可形成專能干細胞。如肝臟祖細胞，骨髓造血干細胞等。從技術角度來說，“全能性”的胚胎干細胞對于治療性克隆來說是最理想的。
然而，由于人類胚胎干細胞研究觸及倫理和道德，在很多國家被法律禁止，相關研究也處于進退兩難的境地。2007年，日本和美國科學家分別宣布發現將普通皮膚細胞轉化為干細胞的方法，這樣得到的干細胞和具有與胚胎干細胞類似的功能，被稱為誘導多功能干細胞，即iPS細胞。這一發現分別被《自然》和《科學》兩大權威科學雜志評為當年重大科學進展。
iPS細胞是“初始化”后的普通體細胞，但具有和胚胎干細胞類似的功能，能分化生成各種組織細胞。更重要的是，它繞開了胚胎干細胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多障礙，醫療領域的應用前景非常廣闊。美國、日本等許多國家更是以極大熱情，或加大投入，或制訂鼓勵政策，推動這一新興的干細胞研究。中國干細胞基礎研究和應用研究起步較早，2001年后，與干細胞相關的重大研究項目不少于二十個。此外，國家還在研發網絡建設、人才建設、研究平臺搭建等方面給予了大力支持，為中國在該研究領域的優勢地位奠定了基礎。中科院動物研究所周琪和北京生命科學研究所高紹榮的研究團隊分別利用iPS細胞克隆出小鼠，從而在世界上首次證明了 iPS細胞的全能性，說明完全通過體外操作可得到與胚胎干細胞具有同樣分化能力的細胞。這項成果是從干細胞研究邁向實際醫療過程中的一大步，對干細胞全能性的機理研究以及器官移植、藥物篩選、基因治療等臨床應用研究具有重要價值。
全能干細胞的集落性生長 對于干細胞全能性的維持具有非常重要的作用。以人胚胎干細胞(hESC)為例，經典培養方法是在以小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)為代表的經過滅活的飼養層細胞上進行的，同時也有研究證實，在合適的化學因素作用下，細胞外基質也能作為培養基底維持hESC的自我更新，如基質膠、膠原、層連接蛋白、纖維連接蛋白中的一種或其混合物。在單細胞狀態下，hESC的存活率較低，因此經典的傳代方法是將其集落消化或切碎成為含有約100個細胞的團簇。無論采用何種傳代技術，操作關鍵是將hESC保持在細胞團簇的狀態。然而，這種方法很大程度上取決于操作人員的素質和手法，并最終形成形狀和大小隨機的、細胞密度隨機的、異質性的hESC集落，但同時過大或者過小的細胞團簇都有更明顯的分化趨勢。正是由于全能干細胞自我更新的特殊要求，現階段的培養和傳代方法很難得到均質性的全能干細胞集落。
目前，越來越多的研究證明，全能干細胞集落的均質性對其自我更新和后續分化都具有至關重要的意義。以hESC為例，集落的尺寸和細胞組成對分化誘導因素和全能性維持因素有調節作用，尤其是與集落尺寸直接相關的Smadl信號是由胚胎干細胞和胚胎干細胞衍生的胚胎內胚層細胞的拮抗作用激發的，介導胚胎內胚層細胞的分泌骨形態發生蛋白-2(BMP2)和胚胎干細胞分泌的生長分化因子-3(⑶F3)發生作用。通過單獨調控Smadl激活可以拯救胚胎干細胞的自發分化，提示hESC集落的大小可以獨立調控干細胞的分化和自我更新，但是在經典培養條件下無法調節集落尺寸大小，在隨機的集落尺寸、細胞密度和分子微環境的共同作用下必然存在不可控的自發分化，影響胚胎干細胞的增殖和自我更新。
全能干細胞集落的異質性和大小差異對于干細胞的分化命運同樣具有重要影響，不可控的初始干細胞集落通常導致不一致或不穩定的分化結果和分化效率，這是全能干細胞分化研究面臨的普遍問題。通過微圖像化(micropatterning)技術研究發現,尺寸較小的集落向心肌細胞分化的趨勢更明顯，而尺寸較大的集落向神經細胞分化的趨勢更明顯全能干細胞培養基底的機械性能對于細胞的自我更新和分化命運也有重要影響。研究證明，基底的彈性模量約為0.6kPa時，對于小鼠胚胎干細胞的自我更新有很好的維持作用，此機械強度與體內組織相似；類似地，在未添加化學信號刺激的條件下，機械強度較高的培養基底具有誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的作用，而機械強度較低的基底能誘導干細胞向脂肪細胞方向分化；更深入的研究證明合適的機械應力能夠抑制hESC的自發分化，并促進其自我更新，當雙向循環應力與化學信號協同作用時能調控hESC的自我更新和分化，對于干細胞分化和細胞治療等領域的研究具有重要意義。
因此全能干細胞最理想的培養平臺應在維持干細胞顯型和核型正常的前提下包含以下三方面的因素:可控的集落形狀和尺寸、物理和化學性質可調的培養基底、合適的傳代方法已實現可調、穩定的細胞種植密度。發明內容
本發明的目的是提供一種細胞集落體外培養裝置。
本發明所提供的細胞集落體外培養裝置包括具有若干微圖形空腔的微圖形化模板和位于所述微圖形化 模板下的粘性水凝膠；所述粘性水凝膠與所述微圖形化模板交聯粘著為整體，所述粘性水凝膠形成所述微圖形空腔的底；所述微圖形化模板的每個所述微圖形空腔的形狀和體積決定細胞集落生長的物理空間。
根據需要，所述細胞集落體外培養裝置還可包括位于所述粘性水凝膠下的基底，或位于所述粘性水凝膠下并嵌入所述微圖形化模板的多孔培養皿。
所述粘性水凝膠用可交聯形成水凝膠的天然生物材料和/或人工合成生物材料制成，所述天然生物材料選自下述材料中的至少一種:明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質酸、層連接蛋白和纖維連接蛋白；所述人工合成生物材料選自下述材料中的至少一種:聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羥基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯。
在本發明的實施例中，用作所述微圖形化模板的材料具體為聚甲基丙烯酸甲酯；用作所述粘性水凝膠的材料，具體由明膠-甲基丙烯酸甲酯和光引發劑Irgacure2959(12959,2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮)組成；所述明膠_甲基丙烯酸甲酯為明膠與甲基丙烯酸甲酯的使用配比為Ig所述明膠比Iml所述甲基丙烯酸甲酯的聚合物。所述明膠-甲基丙烯酸甲酯具體可按照如下方法制備:lg明膠粉末加入IOmL DPBS溶液中，50°C水浴加熱，均勻攪拌至完全融化后，以0.5mL/min緩慢加入ImL甲基丙烯酸甲酯，反應2h后取下，待溶液冷卻至室溫，加入40mL DPBS溶液稀釋，用截留分子量8000-12000的透析袋在去離子水中60°C透析I周，離心取上清液冷凍干燥I周，形成白色蓬松泡沫狀固體，_80°C保存。
所述粘性水凝膠具體可按照包括如下步驟的方法制備:1)將所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶于DMEM培養液，得到明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中所述明膠-甲基丙烯酸甲酯的含量為每IOOml所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中含有5g所述明膠-甲基丙烯酸甲酯；2)將所述光引發劑2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于無水乙醇，得到光引發劑溶液，所述光引發劑溶液中所述2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮的含量為每IOOml所述光引發劑溶液中含有IOg所述2-羥基-4- (2-羥乙氧基)-2_甲基苯丙酮；3)將所述光引發劑溶液與所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液按照體積比1: 20的比例混合。
所述DMEM培養液可由商業途徑獲得，如Invitrogen公司的產品編號為11965092的產品。
在制備所述粘性水凝膠時，根據需要，還可在所述粘性水凝的上表面涂覆細胞外基質成分，所述細胞外基質成分包括膠原、明膠、基質膠、蛋白多糖、糖蛋白、透明質酸、層連接蛋白、纖維連接蛋白。同時，還可以將生長因子和化學信號嵌合于所述粘性水凝膠中。所述粘性水凝膠的厚度通常約為1-10 μ m。
在本發明的實施例中，所述細胞集落體外培養裝置具體是按照如下方法構建的:將所述微圖形化模板裝置于所述多孔培養皿中，將含有交聯劑的粘性水凝膠基溶液沿所述微圖形化模板底面均勻注入所述多孔培養皿，利用所述交聯劑的交聯作用以及所述粘性水凝膠的粘著力作用，將所述微圖形化模板和所述多孔培養皿表面連接成整體，形成由上至下依次為微圖形化模板-基底水凝膠層-培養皿表面的細胞集落體外培養裝置。
利用本發明所提供的細胞集落體外培養裝置，可以實現細胞集落的均質性生長。
本發明所提供的細胞集落體外培養裝置在調控全能干細胞自我更新和/或定向分化中的應用也屬于本發明的保護范圍。
所述全能干細胞為人胚胎干細胞；所述定向分化為人胚胎干細胞分化為肝樣細胞。
本發明與現有研究相比具有 如下優點:
1、本發明所提供細胞集落體外培養裝置整合利用微圖形化模板和粘性水凝膠，可實現對細胞集落的形狀和尺寸、粘附基底的機械強度和化學成分、生長因子和化學信號、共培養細胞等多種因素的調控，且對各因素的調控手段相互獨立，互不干擾。
2、本發明所提供細胞集落體外培養裝置可實現細胞的增殖培養和誘導分化培養的原位進行，使操作大大簡化，同時減小對細胞的處理和損傷。
3、本發明所提供的細胞集落體外培養裝置制備工藝簡便，配合商業化培養皿使用簡便易行，無需改變細胞培養的原有操作步驟和細節且能保持很好的無菌環境。
4、本發明所提供細胞集落體外培養裝置充分利用微圖形化技術，同時可方便地構建多種細胞共培養環境，為高通量和高內涵的模型構建和篩選等研究提供了方便實用的手段。


圖1為微圖形化模板設計示意圖。其中，直徑大小不等的四種圓，根據直徑由小到大的順序依次代表直徑為300 μ m、500 μ mUOOO μ m或1500 μ m的細胞培養空間。
圖2為細胞集落體外培養裝置示意圖。其中，I為培養皿，2為微圖形化模板，3為基底水凝膠層，4為細胞集落。
具體實施方式
本發明所提供的細胞集落體外培養裝置包括具有若干微圖形空腔的微圖形化模板和位于所述微圖形化模板下的粘性水凝膠；所述粘性水凝膠與所述微圖形化模板交聯粘著為整體；所述微圖形化模板的每個所述微圖形空腔的形狀和體積決定細胞集落生長的物理空間。
根據需要，所述細胞集落體外培養裝置還包括位于所述粘性水凝膠下的基底或位于所述粘性水凝膠下并嵌入所述微圖形化模板的多孔培養皿。
上層微圖形化模板可選擇拆卸或固定使用，以適應后期細胞共培養或全能干細胞分化等用途。
所述微圖形化模板可采用本領域熟知的微圖形化方法獲得，如激光切割和雕刻，微圖形化模具成型等，結合計算機輔助設計與制造技術，可調節細胞集落生長空間和所述微圖形化模板整體的形狀 和尺寸。具體而言，通過計算機輔助設計與制造技術可方便地實現各種微圖形空腔的形狀和尺寸，形狀如圓形、正方形、長方形、菱形、梯形和各種不規則形狀等，尺寸為IOym 2cm不等，從而決定細胞集落生長的物理空間；所述微圖形化模板的整體尺寸和形狀通常配合所用培養皿的使用尺寸而定，形狀多為規則圓形，直徑等于或略小于培養皿的使用直徑，可通過計算機輔助設計和制造技術方便地制備所需尺寸和形狀的所述微圖形模板；模板厚度以節省材料方便使用為宜，一般在100 μ m 2cm不等。
所述粘性水凝膠是支持培養細胞(如全能干細胞)或飼養層細胞(如小鼠胚胎成纖維細胞)的生長基底。所述粘性水凝膠用可交聯形成水凝膠的天然生物材料和/或人工合成生物材料制成，所述天然生物材料如明膠及其衍生物、藻酸鹽及其衍生物、瓊脂、基質膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質酸、層連接蛋白、纖維連接蛋白等，合成生物材料包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羥基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等，形成基底(下層粘性水凝膠)的材料可以是上述材料中的一種或幾種的混合物。交聯劑的種類和使用量視基底生物材料的種類和用量而定，以充分交聯為前提。
用作所述微圖形化模板的材料具體可為聚甲基丙烯酸甲酯；用作所述粘性水凝膠的材料，具體可由明膠-甲基丙烯酸甲酯和光引發劑Irgacure 2959 (12959，2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮)組成；所述明膠-甲基丙烯酸甲酯為明膠與甲基丙烯酸甲酯的使用配比為Ig所述明膠比Iml所述甲基丙烯酸甲酯的聚合物。所述明膠-甲基丙烯酸甲酯具體可按照如下方法制備:lg明膠粉末加入IOmL DPBS溶液中，50°C水浴加熱，均勻攪拌至完全融化后，以0.5mL/min緩慢加入ImL甲基丙烯酸甲酯，反應2h后取下，待溶液冷卻至室溫，加入40mL DPBS溶液稀釋，用截留分子量8000-12000的透析袋在去離子水中60°C透析I周，離心取上清液冷凍干燥I周，形成白色蓬松泡沫狀固體，_80°C保存。
所述粘性水凝膠具體可按照包括如下步驟的方法制備:1)將所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶于DMEM培養液，得到明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中所述明膠-甲基丙烯酸甲酯的含量為每IOOml所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中含有5g所述明膠-甲基丙烯酸甲酯；
2)將所述光引發劑2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2_甲基苯丙酮溶于無水乙醇，得到光引發劑溶液，所述光引發劑溶液中所述2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮的含量為每IOOml所述光引發劑溶液中含有IOg所述2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮；
3)將所述光引發劑溶液與所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液按照體積比1: 20的比例混合。
所述DMEM培養液可由商業途徑獲得，如Invitrogen公司的產品編號為11965092的產品。
根據需要，可以在所述粘性水凝膠的上表面涂覆細胞外基質成分；所述細胞外基質成分包括膠原、明膠、基質膠、蛋白多糖、糖蛋白、透明質酸、層連接蛋白或纖維連接蛋白；也可以在所述粘性水凝膠中嵌合生長因子和化學信號。
所述粘性水凝膠材料的使用量視培養皿的使用面積而定，以均勻覆蓋培養皿或硬質基底表面為前提，一般為I μ I IOmi不等。
本發明所述細胞集落體外培養裝置的構建方法包括但不局限于以下四種:
I)設計和制備出需要尺寸和形狀的微圖形化模板后，裝置于多孔培養皿中，將基底生物材料沿模板底面均勻注入培養`皿后交聯，利用交聯劑的交聯作用和粘性水凝膠的粘性作用，將微圖形化模板和多孔培養皿表面連接形成整體，待交聯充分后洗去多余交聯劑和氣泡，即時使用或低溫保存待用。
2)先將基底生物材料均勻注入培養皿后交聯形成基底水凝膠層，再利用壓力將微圖形化模板與基底水凝膠層連接成為整體，充分洗去殘余交聯劑和氣泡后即時使用或低溫保存待用。
3)將玻璃片、塑料片等硬質基底加工成與微圖形化模板一致的整體尺寸，在硬質基底上形成基質水凝膠層，然后利用壓力將微圖型化模板結合于水凝膠層表面成為整體，形成由下至上依次為硬質基底-水凝膠-模板的三層整體結構，將三層整體結構嵌入培養M中，充分洗去殘余交聯劑和氣泡后即時使用或低溫保存待用。
4)先將片狀硬質基底與微圖形化模板由下自上對齊或粘連，再將基底生物材料沿兩者間隙均勻注入并交聯，形成由下至上依次為硬質基底-水凝膠-模板的三層整體結構，將三層整體結構嵌入培養皿中，充分洗去殘余交聯劑和氣泡后即時使用或低溫保存待用。
本發明提供的細胞集落體外培養裝置可實現細胞集落的均質性生長，可用于調控全能干細胞的自我更新和定向分化。這主要包括對于集落形狀、尺寸、基底機械強度等物理因素，基底成分、生長因子、化學信號等化學要素和共培養細胞等生物要素的調控。
本發明調控集落形狀、尺寸、基底機械強度等物理因素的實現方法具體如下:切除模板材料形成微圖形空腔，構成全能干細胞集落生長的物理空間，因此集落的形狀和尺寸由微圖形化模板空腔的特征形狀和尺寸決定。通過計算機輔助設計和制造技術可方便地實現各種微圖形空腔的形狀和尺寸，并可通過在一個模板上切割不同物理屬性的空腔實現同一培養條件下不同集落形狀、尺寸和分布的的比較，對于高通量研究和篩選具有重要意義。以上所述模板空腔的形狀如圓形、正方形、長方形、菱形、梯形和各種不規則形狀等，尺寸為10 μ m 2cm不等。
基底機械強度主要由基底水凝膠的材料(粘性水凝膠的材料)種類、用量及其交聯程度決定，一般而言，基底水凝膠的材料用量越大、交聯程度越高，則其機械強度越大。特別地，基底機械強度可在細胞集落體外培養裝置使用過程中通過人為調控或自發調控等過程來進行干預，人為調控基底機械強度主要通過基底水凝膠材料的二次或多次交聯實現，如采用明膠-甲基丙烯酸甲酯作為基底水凝膠材料時，可分別通過紫外光、藍光等物理交聯方式和京尼平、戊二醛等化學交聯方式，方便地在需要時間和原位實現二次或多次交聯，其結果通常是基底水凝膠材料機械強度的提高；自發調控基底水凝膠材料的機械強度主要是通過細胞培養過程中細胞-材料相互作用和材料降解實現的，其結果通常是基底水凝膠材料機械強度的降低。自發調控和人為調控的結合可實現基底水凝膠材料的機械強度原位、隨時、多次地調節和控制，以適應全能干細胞自我更新和定向分化的要求，如在全能干細胞培養初期，較低的基底機械強度有利于干細胞的自我更新和全能性的維持，當全能干細胞增殖形成均質性集落后可進行定向分化誘導培養，如向肝樣細胞、心肌細胞、胰腺細胞等方向分化，此時較高的基底機械強度有利于干細胞的定向分化。通過本細胞集落體外培養裝置及其調控方法可在原位實現全能干細胞集落的自我更新和定向分化誘導培養。上述基底水凝膠材料的使用量視培養皿的使用面積而定，以均勻覆蓋培養皿或硬質基底表面為前提，一般為1μ I IOmi不等，交聯劑的種類和使用量視 基底生物材料的種類和用量而定，以充分交聯為前提。
本發明調控基底成分、生長因子、化學信號分子等化學要素的具體方法如下:由于上層微圖形化模板和下層粘性水凝膠的不同的生物和理化屬性、不同的垂直高度以及吹打抽吸等后續操作，基底水凝膠材料表面一般是全能干細胞或飼養層細胞生長的直接附著表面，可通過在基底水凝膠表面涂覆各種生物材料實現基底成分的改性和調控，如涂覆膠原、明膠、基質膠、蛋白多糖、糖蛋白、透明質酸、層連接蛋白、纖維連接蛋白等各種細胞外基質成分，以提高細胞粘附、更好地維持干細胞的自我更新、或促進全能干細胞的定向分化。此處所述涂覆材料不限于以上種類材料，具體使用種類和用量視培養細胞的種類和培養目的而定。
本發明可以方便地實現各種生長因子和化學信號分子在細胞集落體外培養裝置中的復合和緩釋。通過因子固定技術(immobilization)可將生長因子和化學信號分子嵌合于基底水凝膠層中，實現各種因子仿生、高效、可控的緩釋，提高因子的作用效率和作用時間，對于體外模擬體內發育提供了一種方便實用的模型，并具有重要的經濟效益。同時，生長因子和化學信號分子也可以可溶分子的形式參與細胞培養過程，可方便地進行時序性可控的因子添加，以適應程序性誘導分化培養的要求。此處所述生長因子和化學信號分子的選用視培養細胞的種類和培養目的而定，是本領域的公知方法。
本發明可適于全能干細胞的增殖培養和誘導分化培養等多種用途，方便的細胞共培養途徑是實現以上功能的重要保證，本發明在調控共培養細胞等生物要素的具體方法包括但不局限于如下兩類:
I)維持全能干細胞自我更新的飼養層共培養。在細胞集落體外培養裝置中可先選擇性種植飼養層細胞，使其貼附于微圖形空腔的基底水凝膠表面或微圖形模板上，其后在細胞集落體外培養裝置上種植全能干細胞，形成與飼養層細胞共培養的生理環境，有利于全能干細胞的自我更新和全能性的維持。此處所述飼養層細胞的選擇和種植密度是本領域的公知，具體選擇視全能干細胞的種類而定。
2)促進全能干細胞定向分化的輔助細胞共培養。在細胞集落體外培養裝置形成全能干細胞均質性集落后可原位進行干細胞定向分化誘導培養，此時可選擇性進行輔助細胞共培養，共培養方法包括保留微圖形化模板和拆卸微圖形化模板兩種。
在保留模板的情況下可直接將輔助細胞種植于細胞集落體外培養裝置，此時輔助細胞優先貼附于微圖形化模板上非空腔表面，形成輔助細胞與全能干細胞集落非接觸式共培養環境；另外，可在形成全能干細胞均質性集落后拆除上層微圖形化模板，保留全能干細胞集落、基底水凝膠層和/或硬質基底，此時所種植的輔助細胞優先貼附于基底水凝膠層上未被全能干細胞集落占位的空白表面，形成輔助細胞與全能干細胞集落接觸式共培養環境。以上兩種方式的選擇可根據基底水凝膠材料種類、全能干細胞誘導分化方向和輔助細胞的類型等因素而定。輔助細胞的種類和種植密度是本領域的公知，主要由全能干細胞集落的數量、細胞密度和干細胞誘導分化方向等因素決定。
本發明所述細胞集落體外培養裝置尤其適用于全能干細胞的培養，同時也可用于其它各種細胞的培養。
下面結合具體實施例對本發明加以闡述，應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、細胞集落體外培養裝置的制造
一、微圖形化模板的制備
利用激光切割法制備上層微圖形化模板。具體操作如下:采用Rayjet激光雕刻機切割厚度為0.5cm的聚甲基丙烯酸甲酯平板(尊寶科技)形成上層微圖形化模板。按照圖1所示，由軟件AutoCAD設計完成微圖形化模板:模板為圓形，直徑尺寸為22.1mm，中央呈正方形均勻分布8X8個直徑為300μπι、500μπι、1000μπι或1500μπι的空腔作為微圖形化的細胞(如全能干細胞)培養空間，相鄰兩個空腔圓心的距離為1500μπι。激光雕刻機的主要加工參數為:切割能量100%，切割次數2，切割線速度10%。
將加工成型的聚甲基丙烯酸甲酯模板用去離子水漂洗兩次，超聲清洗30min，然后進行熱處理以改善平整度:取平整清潔的加熱板，溫度設置90°C，在受壓狀態下熱處理聚甲基丙烯酸甲酯模板45min。
將熱處理后的微圖形化模板用無菌三蒸水浸泡漂洗30min，并用無菌清潔紙擦拭干凈，于安全柜中雙面照射紫外45min滅菌備用。
二、細胞集落體外培養裝置的制造
用無水乙醇將光引發劑(12959,2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2_甲基苯丙酮，106797-53-9，英力，中國)配制成濃度為0.lg/ml的光引發劑溶液，0.2 μ m濾膜過濾除菌后分裝成Iml/管并避光4°C低溫保存。
按照如下方法制備明膠-甲基丙烯酸甲酯:lg明膠(G6144, Sigma,美國)粉末加AlOmL DPBS溶液中，50°C水浴加熱，均勻攪拌至完全融化后，以0.5mL/min緩慢加入ImL甲基丙烯酸甲酯(276685，Sigma，美國)，反應2h后取下，待溶液冷卻至室溫，加入40mL DPBS溶液稀釋，用截留分子量8000-12000的透析袋在去離子水中60°C透析I周，離心取上清液冷凍干燥I周，形成白色蓬松泡沫狀固體，為明膠-甲基丙烯酸甲酯聚合物，_80°C保存。
將上述制備好的明膠-甲基丙烯酸甲酯溶于DMEM培養液(11965092，Invitrogen,美國)中，60°C助溶3小時，形成濃度為0.05g/ml明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，用0.2 μ m濾膜過濾后分裝成Iml/管備用。
使用時將上述配制好的濃度為0.lg/ml的光引發劑溶液與濃度為0.05g/ml的明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液以1: 20均勻混合后避光 保存，并且之后的相關操作均在避光的條件下進行。
在安全柜中按照無菌操作規范將步驟一中所述微圖形化模板1:1嵌入12孔板培養皿(Corning公司)的培養孔中，在避光條件下沿微圖形模板底面緩慢注入70 μ I無菌的明膠-甲基丙烯酸甲酯/光引發劑溶液，此時在模板底面與培養皿表面之間形成一層均勻的基底生物材料層。利用紫外光交聯明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，紫外光能量約為5.4mff/cm2,作用時間40s，形成厚度為1_10 μ m的基底水凝膠層(下層粘性水凝膠)。此時在交聯劑的交聯作用和明膠-甲基丙烯酸甲酯水凝膠粘著力的共同作用下形成由上至下依次為微圖形化模板-基底水凝膠層-培養皿表面的細胞集落體外培養裝置(如圖2所示)。然后用Iml/孔DMEM溶液潤洗細胞集落體外培養裝置兩次，立即使用或低溫無菌保存。
實施例2、利用實施例1的細胞集落體外培養裝置培養人胚胎干細胞
1、人胚胎干細胞增殖培養
MEF 培養液:每 250ml MEF 培養液含 DMEM (11965092，Invitrogen) 225ml，胎牛血清(10099141, Invitrogen) 25ml,谷丙氨酸二妝(Glutamax I) (35050061, Invitrogen) 2.5ml,MEM非必需氨基酸(MEM NEAA) (11140050, Invitrogen) 2.5ml,青霉素/鏈霉素(Pen/strep)(100X(15140122, Invitrogen)2.5ml。
人胚胎干細胞培養液:每250ml培養液含knock out DMEM(10829018,Invitrogen) 200ml, Knockout serum replacer (10828028, Invitrogen) 50ml,谷丙氨酸二肽(Glutamax I) (35050061，Invitrogen) 2.5ml，MEM 非必需氨基酸(MEM NEAA) (11140050，Invitrogen) 2.5ml，青霉素 / 鏈霉素(Pen/strep) (15140122, Invitrogen) 2.5ml,人喊性成纖維細胞生長因子(hbFGF) (25 μ g/ml) (233-FB-025, R&D) 0.08ml。
一、小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的獲取
獲取小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的具體操作步驟如下:
(I)用孕馬血清促性腺激素(H0R-272，上海高創)處理小鼠，使其同期發情和超數排卵。
(2)將雌雄小鼠按照2: I的比例合籠過夜。
(3)第二天，取出有陰道栓(即乳白色或淡黃色凍膠狀物，確定其已經懷孕)的雌性小鼠。此時，小鼠懷孕時間記錄為0.5天。
(4)取出妊娠12.5-14.5天的雌性小鼠為下述進一步實驗的材料。
(5)頸椎脫臼法處死步驟⑷的懷孕小鼠，放于盛有75%酒精的燒杯中消毒，拿到超凈工作臺上解剖，先剖開腹部皮膚，暴露子宮，然后換另外一套手術器械，用眼科鑷提起近子宮頸端，分離子宮系膜，剪斷子宮角，取出子宮，置于裝有PBS的培養皿中。
(6)取出胎鼠，在 PBS中洗滌數次。去除頭、尾、內臟和四肢，僅留軀干部。在PBS中充分漂洗，棄除紅細胞。
(7)在新的培養皿中加入少量PBS，放入軀干部分，用眼科剪刀剪成Imm3以下的組織塊碎片。
(8)加入2 4ml 0.25%胰蛋白酶，培養箱中消化10_15min，消化結束后加入等體積MEF培養液終止消化反應，輕輕吹打，使細胞分散。
(9)將收集的細胞懸液離心，1500rpm, 4min,棄上清，加入紅細胞裂解液(3 5倍體積的細胞體積)，輕輕吹打lmin，離心除上清，若仍有紅細胞殘留，則須繼續進行前述的紅細胞裂解步驟。
(10)離心，棄上清，重懸細胞，過濾(200目篩網)并收集濾液，離心除去上清。
(11)用MEF培養液洗滌沉淀，離心除上清，重懸細胞并鋪板后置于37°C、5% 0)2飽和濕度恒溫培養箱中培養。
(12)第二天換液，隨后每2天換液一次。培養2 4d后，MEF接近匯合，即可按I: 3比例傳代培養。
(13)收集細胞進行X射線滅活，劑量為70戈瑞(Gy)。
將滅活的MEF (以下簡稱Ιη-MEF)以2.5 X IO4個/cm2的細胞密度均勻種植于實施例I構建的細胞集落體外培養裝置中，如為低溫無菌保存的細胞集落體外培養裝置，則PBS潤洗兩次后37°C孵育IOmin使用。細胞集落體外培養裝置種植In-MEF后，置于培養箱中靜置lOmin，稍傾斜吸出上清，沿培養皿的孔壁加入Iml/孔MEF培養液潤洗兩次，以去除模板表面的細胞，留下微圖形化空腔中的In-MEF細胞。沿培養皿的孔壁加入1.5ml/孔MEF培養液，在培養箱中進行In-MEF細胞培養。
24h后，吸去細胞集落體外培養裝置中的MEF培養液。將在六孔板培養皿中常規培養的匯合度約為60-70%的人胚胎干細胞H9 (Wicell)均勻傳代至細胞集落體外培養裝置中，將六孔板一個培養孔中的人胚胎干細胞H9，傳到上述含有In-MEF細胞集落體外培養裝置12孔板的一個培養孔中，即人胚胎干細胞H9約為3:1種植。將細胞集落體外培養裝置置于培養箱中靜置lOmin，稍傾斜吸出上清，以去除模板表面的人胚胎干細胞H9，留下微圖形化空腔中的人胚胎干細胞H9。沿培養皿的孔壁加入1.5ml/孔人胚胎干細胞H9培養液，在培養箱中進行MEF和人胚胎干細胞H9共培養，每天換液、觀察，采用堿性磷酸酶活性測定、特異性表面抗原表達檢測(如SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60)、核轉錄因子檢測(如0CT4)等方法鑒定人胚胎干細胞H9的生物學特性。
In-MEF和人胚胎干細胞H9在實施例1的細胞集落體外培養裝置中共培養約3 4天后，人胚胎干細胞H9形成與微圖形化模板的空腔形狀一致的，8X8個直徑為300 μ m、500 μ m、1000 μ m 或 1500 μ m 均一集落。
上述MEF細胞培養和傳代、人胚胎干細胞H9的常規培養、傳代和檢測方法是本領域的公知，優先采用目前經典操作規范進行。
2、原位人胚胎干細胞定向誘導分化
I)原位人胚胎干細胞程序性定向誘導分化
約3 4天后，可觀察到上述步驟I培養的人胚胎干細胞H9，在微圖形化空腔中形成8X8個直徑為30(^111、50(^111、100(^111或150(^111的均質性人胚胎干細胞!19集落(經所述生物學特性鑒定較好)，之后在細胞集落體外培養裝置中進行原位人胚胎干細胞H9誘導分化培養，此處所述以肝樣細胞程序性誘導分化為例。
程序性誘導分化以體內肝臟發育為指導，依次分為限定性內胚層誘導、肝祖細胞特化誘導和肝細胞成熟誘導等階段。各個階段的誘導培養液是基于成分培養液配制的，成分培養液配方為:50% IMDM 培養基(Iscove，s modified DulbeccoJ s medium)與 50%F12NUT-MIX,添加7 μ g/ml胰島素、15 μ g/ml轉鐵蛋白、450 μ mol/L硫代甘油和5mg/ml牛血清白蛋白。以誘導起始時間記為第I天，誘導分化方法為:第 I 2天，采用添加IOng/mL活化素(activin)和12ng/ml人成纖維細胞生長因子2 (FGF2)的成分培養液培養干細胞，每天換液；第3 5天，采用添加100ng/mL activin, 20ng/mL FGF2,10ng/mL骨形態發生蛋白(BMP4)和10 μ mol/L LY294003 (PI3K抑制劑)的成分培養液誘導人胚胎干細胞H9向內胚層細胞分化,每天換液；第6 8天,采用添加50ng/mL人成纖維細胞生長因子IO(FGFlO)的成分培養液誘導向前部限定性內胚層的定向分化，每天換液；第9 10天，采用添加 50ng/mL FGF10,10_7mol/L 視黃酸和 10 μ mol/L SB431542 (TGF-Smads 信號通路抑制劑)的成分培養液誘導向肝祖細胞的定向分化，每天換液；第11 20天，采用添加30ng/mL人成纖維細胞生長因子4(FGF4)，50ng/mL肝細胞生長因子(HGF)和50ng/mL上皮生長因子(EGF)的成分培養液誘導向肝樣細胞的定向分化，每2 3天換液。以上培養過程都將細胞集落體外培養裝置置于37°C、5% CO2飽和濕度培養箱中進行，每次每孔加液1.5ml。
經上述誘導后人胚胎干細胞H9分化的細胞能夠表達肝臟特定基因AFP，分泌白蛋白，由此判定人胚胎干細胞H9定向分化為了肝樣細胞。
2)原位人胚胎干細胞共培養定向誘導分化
觀察到上述步驟I培養的人胚胎干細胞H9，在微圖形化空腔中形成8X8個直徑為1000 μ m的均質性人胚胎干細胞H9集落后，在細胞集落體外培養裝置中進行原位共培養誘導分化培養，此處所述以肝樣細胞共培養誘導分化為例。
將人來源的肝星狀細胞系(HumanHepatic Stellate Cells, cat#5300,Sciencell)培養于37°C、5% CO2飽和濕度培養箱中，培養條件為添加10% FBS和200U/mL青鏈霉素的DMEM培養液。
開始肝星狀細胞共培養前用鑷子揭下上層微圖形化模板，用人胚胎干細胞H9全培養液潤洗培養皿兩次，此時培養皿中留下基底水凝膠層和微圖形化的人胚胎干細胞H9集落。將肝星狀細胞重懸于人胚胎干細胞H9全培養液中，以2.5X IO4個/cm2的細胞密度均勻種植于培養皿中，一天后換液，此時星狀細胞優先貼附于基底水凝膠層，圍繞人胚胎干細胞H9集落形成兩種細胞共培養環境。
其后6天，采用誘導培養液誘導人胚胎干細胞H9向肝樣細胞定向分化，誘導培養液的成分為:50% IMDM培養基與50% F12NUT-MIX，添加7 μ g/ml胰島素、15 μ g/ml轉鐵蛋白、450 μ mol/L 硫代甘油、5mg/ml 牛血清白蛋白、50ng/mL FGF4, 50ng/mL HGF 和 50ng/mLEGF,每2 3天換液。以上培養過程都將細胞集落體外培養裝置置于37°C、5% CO2飽和濕度培養箱中進行，每次每孔加液1.5ml。
經上述誘導后人胚胎干細胞H9分化的細胞能夠表達肝臟特定基因AFP，分泌白蛋白，由此判定人胚胎干細胞H9定向分 化為了肝樣細胞。
權利要求
1.細胞集落體外培養裝置，包括具有若干微圖形空腔的微圖形化模板和位于所述微圖形化模板下的粘性水凝膠；所述粘性水凝膠與所述微圖形化模板交聯粘著為整體；所述微圖形化模板的每個所述微圖形空腔的形狀和體積決定細胞集落生長的物理空間。
2.根據權利要求1所述的細胞集落體外培養裝置，其特征在于:所述細胞集落體外培養裝置還包括位于所述粘性水凝膠下的基底。
3.根據權利要求1所述的細胞集落體外培養裝置，其特征在于:所述細胞集落體外培養裝置還包括位于所述粘性水凝膠下并嵌入所述微圖形化模板的多孔培養皿。
4.根據權利要求1-3中任一所述的細胞集落體外培養裝置，其特征在于:所述粘性水凝膠用可交聯形成水凝膠的天然生物材料和/或人工合成生物材料制成，所述天然生物材料選自下述材料中的至少一種:明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質酸、層連接蛋白和纖維連接蛋白；所述人工合成生物材料選自下述材料中的至少一種:聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羥基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯。
5.根據權利要求1-4中任一所述的細胞集落體外培養裝置，其特征在于:用作所述微圖形化模板的材料為聚甲基丙烯酸甲酯；用作所述粘性水凝膠的材料由明膠-甲基丙烯酸甲酯和光引發劑2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮組成；所述明膠-甲基丙烯酸甲酯為明膠與甲基丙烯酸甲酯的使用配比為Ig所述明膠比Iml所述甲基丙烯酸甲酯的聚合物。
6.根據權利要求5所述的細 胞集落體外培養裝置，其特征在于:所述粘性水凝膠按照包括如下步驟的方法制備: 1)將所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶于DMEM培養液，得到明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中所述明膠-甲基丙烯酸甲酯的含量為每IOOml所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中含有5g所述明膠-甲基丙烯酸甲酯； 2)將所述光引發劑2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于無水乙醇，得到光引發劑溶液，所述光引發劑溶液中所述2-羥基-4- (2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮的含量為每IOOml所述光引發劑溶液中含有IOg所述2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮； 3)將所述光引發劑溶液與所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液按照體積比1: 20的比例混合。
7.根據權利要求1-6中任一所述的細胞集落體外培養裝置，其特征在于:所述粘性水凝膠的上表面涂覆有細胞外基質成分；所述細胞外基質成分包括膠原、明膠、基質膠、蛋白多糖、糖蛋白、透明質酸、層連接蛋白或纖維連接蛋白；和/或， 所述粘性水凝膠中嵌合有生長因子和化學信號分子。
8.根據權利要求1-7中任一所述的細胞集落體外培養裝置，其特征在于:所述粘性水凝膠的厚度為1-10 μ m。
9.權利要求1-8中任一所述的細胞集落體外培養裝置在調控全能干細胞自我更新中的應用。
10.權利要求1-8中任一所述的細胞集落體外培養裝置在調控全能干細胞定向分化中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種細胞集落生長裝置。本發明所提供的裝置包括具有若干微圖形空腔的微圖形化模板和位于所述微圖形化模板下的粘性水凝膠，兩者交聯粘著為整體；每個所述微圖形空腔的形狀和尺寸決定細胞集落生長的物理空間。用作所述粘性水凝膠的材料由可交聯形成水凝膠的天然生物材料和/或人工合成生物材料，以及交聯劑組成。本發明所提供的平臺制備工藝簡單，配合培養皿使用簡便易行；利用微圖形化技術構建多種細胞共培養環境，為高通量模型構建和篩選提供了方便實用的手段；同時還可實現對細胞集落形狀和尺寸、粘附基底機械強度和化學成分、生長因子和化學信號、共培養細胞等多種因素的獨立調控；以及原位進行細胞增殖培養和誘導分化培養。
文檔編號C12M3/00GK103146572SQ20111040398
公開日2013年6月12日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者杜亞楠, 姚睿, 王婧宇 申請人:清華大學