專利名稱：酶制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及用作生物催化劑的新的酶制劑。
技術背景
微生物和分離的酶廣泛用作化學工業或食品制造中的催化劑。例如A.Liese， K.Seelbach, C. Wandrey, Industrial Biotransformations, Wiley-VCH :2000, ffeinheim, Germany提供了綜述。
為了保證經濟使用這些生物催化劑，必需滿足一些條件生物催化劑必需在反應條件下保持活性足夠長時間，在反應結束之后應容易除去并且應盡可能多次重復使用。理想地，應當在非常廣泛的反應條件(例如溫度范圍、所用溶劑類型、壓力，等)下滿足這些條件，以提供盡可能通用的催化劑。
為了滿足這些條件，通常需要將所用酶或含有酶的微生物固定。
通常，酶或含酶微生物非共價地固定在載體上；所用載體經常是具有適當粒度分布的離子交換樹脂或聚合物顆粒。其實例有市售產品得自Novozymes A/S，Bagsvaerd, Denmark 的 Novozym 435、Lipozym RM IM 或 Lipozym TL IM 或者得自 Amano, Japan 的 Amano PS0這些實例是具有廣泛用途的固定脂肪酶，由于這些固定物在非水系統，即，僅包括有機溶劑(即使有的話)的系統，中也具有工業可利用的活性，例如J. Chem. Soc. ,Chem. Comm. 1989,934-935中所述。然而使用這種固定物的缺陷首先是根據所用反應系統發生的酶或含酶微生物的解吸附，例如在使用表面活性劑組分的情況下。在對比實施例1中顯示與這種解吸附有關的活性損失。此外，這種制劑不具有足夠的機械穩定性，結果，即使能使用，僅可以在接受大大受限制的重復使用性的情況下，在簡單的攪拌反應器中使用。在對比實施例2中顯示了這些制劑的機械不穩定。
為了能夠重復使用這些酶制劑，需要使用其它反應器設計。例如，Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2003，105，601-607描述了使用固定床反應器進行脂肪酶-催化的酯化反應。 然而，該方法的缺陷是限于低粘度均勻反應混合物，這是由于高粘度混合物或懸浮體不能通過固定床運送。
K. Faber “ Biotransformations in Organic Chemistry “ , Springer :2000, Berlir^Germany在第384頁描述了使用加入到海藻酸鹽中的酶。然而，由此獲得的制劑具有極其低的機械穩定性并且在非水系統中僅呈現低的活性。
此外，描述了固定酶與反應物質(例如戊二醛)的隨后交聯。然而，缺陷是與改性之前的活性相比，交聯的制劑的比活經常大大降低。而且，該方法不能改善機械穩定性。
同樣描述了在反應載體上共價固定酶。其缺陷是在酶表面需要有合適的官能團， 其可以與載體反應；此外，結果經常導致酶活損失。
J. Am. Chem. Soc. 1999，121，9487-9496描述了將酶加入到稱之為溶膠-凝膠的硅氧烷基質中。溶膠-凝膠制劑的缺陷是粒度分布低，使通過過濾的有效去除復雜化、缺少機械穩定性、發生解吸附、使用有毒反應物(TE0S的毒性，例如參見Nippon Sanso Giho 1990， 9，68-72 和 Archives of Toxicologyl994,68, 277-283 ；TMOS 的毒性例如參見 Fundamental and Applied Toxicology 1989,13,285-295)；對于無毒溶膠-凝膠的生產，需要大量步驟， 例如貯藏超過6個月或者在350°C下熱處理，如Polimery w Medycynie 2000,30,45-54 ψ 所述，并且其溶脹性能非常大地取決于所用溶劑并且不能通用于不同反應系統(含水和非水)。J.Sol Gel Sci. Technol. 2003，沈，1183-1187通過實例顯示了觀察到的酶活性的溶劑依賴性并因此不能滿足廣泛使用性的需要。
Landbauforschung Volkenrode5 2002, special edition 241，41-46 描述了其中酶首先固定在“細”聚硅氧烷顆粒上然后包封在溶膠-凝膠中的溶膠-凝膠制劑。因此部分解決了機械穩定性的問題，但是所述實驗顯示僅在所選溶劑中獲得足夠的活性；完全沒有描述在無溶劑系統中的使用。此外，這些制劑不是以直接可用的形式獲得，而是首先必需切成適當大小，這僅僅在工業規模可以實施。
J. Mol. Catal. B, 2005，35,93-99描述了通過將酶水溶液加入到稱之為靜態乳劑的機械穩定的聚硅氧烷球中的固定酶。所得制劑的比活盡管高達33U/g，但是與上述在惰性載體上的固定物相比還太低，其中可以容易地獲得大于1000U/g的比活(U=單位或ymol/ min) ο
WO 03/106607A1同樣描述了這種靜態乳劑，但是專門描述了在含水系統中使用； 該應用是洗滌組合物，即不是生物催化，并且所得粒度為約10 μ m,對于從有機反應混合物中有效過濾掉來說太小。
因此一直需要一種酶固定方法，克服現有技術的缺陷，以實現迄今不能實現的生物催化過程。發明內容
因此，本發明的目的是提供沒有現有技術制劑的一種或多種缺陷的酶制劑。具體地說，應提供酶制劑，它相對機械力和解吸附具有高的穩定性，同時優選在不同的含水和非水反應混合物中具有的比活足夠高，以能夠工業應用。基于它們的粒度分布，酶制劑應優選能夠以簡單方式從反應系統中除去并且重復使用。
從下面說明書的內容、實施例和權利要求，沒有具體解釋的其它目的將是顯而易見的。
已出人意料地發現，通過將酶或含酶微生物固定在惰性載體上，然后用通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層涂布獲得的酶制劑能夠實現上述目的。
本發明因此提供了酶制劑以及它們作為工業生物催化劑的用途，該酶制劑可以通過包括固定在惰性載體上的酶或含酶微生物的酶固定物并提供有通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層獲得。
本發明還提供了一種制備本發明酶制劑的方法，其特征在于對包括固定在惰性載體上的酶或含酶微生物的酶固定物提供通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層。
本發明的酶制劑具有相對機械應力和解吸附的穩定性高的優點。除了這些改進的性能，本發明的酶制劑在各種含水反應混合物(例如在三丁酸甘油酯的水解中)和非水反6應混合物(例如在月桂酸丙酯的無溶劑合成中)中具有工業應用的足夠高的比活，本發明的酶制劑也具有通過選擇載體材料和其相關粒度分布來調整粒度，使得能夠從反應系統中簡單地除去酶制劑，并因此也可以重新使用該酶制劑的優點。
具體實施方式
下面通過實例描述本發明的酶制劑及其制備方法，然而本發明決不限于這些描述的實施方案。當下面描述范圍、通式或化合物類時，它們不應僅包括明確提及的相應范圍或基團，而是也包括通過選擇單個值(范圍)或化合物獲得的所有子范圍和次基團。當將文獻引入本說明書時，它們的內容應完全加入到本發明的公開內容中。當可能具有多于一個的不同單元的化合物在本發明的內容中描述時，例如有機改性的聚硅氧烷，它們可以以隨機分布(統計學低聚物)或規則(嵌段低聚物)存在于這些化合物中。至于在這些化合物中的單元的數目的信息應解釋為平均值，所有適合化合物的平均。
本發明的酶制劑顯著的是它們可以通過向固定在惰性載體上的包括酶或含酶微生物的酶固定物提供通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層獲得。
為了制得該酶固定物，可以使用整個細胞、靜止細胞、純化酶或含有相應酶的細胞提取物、或它們的混合物。優選使用水解酶，例如脂肪酶、酯酶或蛋白酶，例如得自皺褶假絲(Candida rugosa) > itIMi^SI# (Candida antarctica)Thermomyceslangosiosus、豬胰腺、米黑毛霉(Mucor miehei), Alcaligines sp.的脂肪酶、得自皺褶假絲酵母的膽固醇酯酶、得自豬肝的酯酶，更優選脂肪酶。因此，酶固定物優選包括得自水解酶類的酶，優選脂肪酶。
所用惰性載體可以是惰性有機或無機載體。所用或者存在于酶固定物中的惰性載體優選是具有其中至少90%的顆粒具有10-5000μπι，優選50μπι-2000μπι的粒度的粒度分布的那些微粒載體。所用有機載體尤其可以是那些包含聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、PTFE和/或其它聚合物或者由它們組成。根據待固定的酶，所用載體材料可以特別是酸性或堿性離子交換樹脂，例如Duolite Α568、Duolite XAD 761、Duolite XAD 1180、 Duolite XAD 7ΗΡ、Amberlite IR 120、Amberlite IR 400、Amberlite CG 50、Amberlyst 15 (都是 Rohm and Haas 的產品)或 Lewatit CNP 105 和 Lewatit VP OC 1600 (Lanxess, Leverkusen, Germany的產品)。所用無機載體可以是現有技術已知的氧化的和/或陶瓷載體。特別是，所用無機載體例如可以是C鹽、沸石、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或其它載體，如 L. Cao, “ Carrier-bound Immobilized Enzymes :Principles, Application and Design"，Wiley-VCH :2005,ffeinheim,Germany中所述。更優選，存在于酶固定物中的惰性載體或者用于制備酶固定物的惰性載體包括聚乙烯基苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸
根據本發明，在顆粒上的固定可以共價或非共價地進行，優選非共價地進行。就非共價固定而言，載體例如可以用酶水溶液(可以任選含有其它組分，例如無機鹽或去污劑) 培養或浸漬。該培養/浸漬例如可以在0°C-50°C，優選0°C-40°C的溫度下進行。優選培養/浸漬進行幾分鐘到幾小時。該培養過程可以隨后通過蛋白質測定的常規方法測定溶液中的酶濃度。達到所需固定度之后，載體可以優選用水洗滌，并且如果需要的話，進行干燥。
其中
N = a+b+c+d+2 = 3-850，優選 6-160，
a = 1-800，優選 2-150，
b = 0-400，優選 2-75，
c = 0-10，優選 0，
d = 0-10，優選 0，
R1各自相同或不同，并且選自以下的組飽和或不飽和的、任選枝化的具有1-30 個碳原子的烷基、具有7-30個碳原子的烷芳基和具有6-30個碳原子的芳基，優選具有1-4 個碳原子的烷基或苯基，特別是甲基；
R2a各自是氫或R1;
R2b各自是氫或R1;
R3各自是相同或不同的通式Ia的基團
以這種方式獲得的酶固定物然后可以提供有本發明的聚硅氧烷涂層。
然而，根據本發明，也可以使用可商購獲得的酶固定物，例如得自Novozymes A/S， Bagsvaerd, Denmark 白勺 Novozym 435、Lipozym RM IM 或 Lipozym TL IM，或者得自 Amano, Japan StJ Amano PS。
根據本發明，聚硅氧烷涂層是通過氫化硅烷化獲得的。為此，優選Si-H-官能的聚娃氧烷在有催化劑，優選過渡金屬催化劑的情況下，與具有至少一個末端碳-碳雙鍵，優選至少兩個碳-碳雙鍵的有機改性的聚硅氧烷反應。
所用Si-H-官能的聚硅氧烷優選是通式I的SiH聚硅氧烷
權利要求
1.酶制劑，通過包括固定在惰性載體上的酶或含酶微生物的酶固定物獲得，所述酶固定物提供有通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層。
2.權利要求1的酶制劑，特征在于所述酶是得自水解酶類的酶，優選脂肪酶類。
3.權利要求1和2任一項的酶制劑，特征在于所述惰性載體具有其中90%的顆粒的粒度為10-5000 μ m的粒度分布。
4.權利要求1-3任一項的酶制劑，特征在于所用的惰性載體包括聚乙烯基苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯。
5.權利要求1-4任一項的酶制劑，特征在于所述聚硅氧烷涂層是通過用含末端碳-碳雙鍵的聚硅氧烷氫化硅烷化SiH-官能的聚硅氧烷獲得的。
6.權利要求5的酶制劑，特征在于所用SiH組分是通式I的聚硅氧烷
7.權利要求6的酶制劑，特征在于所用SiH組分是通式I的聚硅氧烷
8.權利要求5-7中至少一項的酶制劑，特征在于所用含末端碳-碳雙鍵的聚硅氧烷是通式II的聚硅氧烷N = m+n+o+p+2 = 3-1000, m = 1-800， η = 0-20， ο = 0-10， ρ = 0-10，R4各自相同或不同的且選自以下基團飽和或不飽和的、任選枝化的具有1-30個碳原子的烷基、具有7-30個碳原子的烷芳基和具有6-30個碳原子的芳基； R5各自是末端不飽和的烷基或烷氧基或R4 ； &各自是相同或不同的通式IIa的基團
9.權利要求5-8中至少一項的酶制劑，特征在于所用含末端碳-碳雙鍵的聚硅氧烷是通式II的聚硅氧烷
10.權利要求1-7任一項的酶制劑的制備方法，特征在于對包括固定在惰性載體上的酶或含酶微生物的酶固定物提供通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層。
11.權利要求10的方法，特征在于通過將所述酶固定物與含SiH-官能的聚硅氧烷、含末端碳-碳雙鍵的聚硅氧烷和在氫化硅烷化條件下催化氫化硅烷化的催化劑的反應混合物接觸，向所述酶固定物提供聚硅氧烷涂層。
12.權利要求1-9任一項的酶制劑作為工業生物催化劑的用途。
全文摘要
本發明涉及酶制劑，其可以通過固定在惰性載體上的酶或含酶微生物的酶固定物獲得，所述酶固定物提供有通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層，本發明還涉及這種酶制劑的制備方法和酶制劑作為工業生物催化劑的用途。
文檔編號C12N11/08GK102517273SQ201110404869
公開日2012年6月27日 申請日期2008年7月4日 優先權日2007年7月6日
發明者A·布特, L·維曼, M·安佐格-舒馬赫, O·圖姆 申請人:贏創戈爾德施米特有限公司