專利名稱：水稻立枯絲核菌effector基因AG1IA06910及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體地說，涉及一種水稻立枯絲核菌effector基因AG1IA06910及其應用。
背景技術：
由立枯絲核菌引起的水稻紋枯病是一種真菌病害，和稻瘟病、白葉枯病并列水稻三大病害。立枯絲核菌侵染范圍廣，包括水稻、玉米、小麥、土豆、牧草、大豆等多種作物。立枯絲核菌能夠引起如此多種作物發生病害是與其分泌effector (效應因子)分子密切相關的。這種分子可以調節宿主的先天免疫并增強寄生感染。現在已普遍認為這些effector 是增強寄生感染的關鍵的致病性決定因素(Kamoun，2007 ；Hogenhout et al.，2009)。立枯絲核菌通過分泌effector分子，緊密的與其宿主植物聯系并精密的操控植物細胞。Effector靶向植物分子，改變植株進程。在植物病原菌相互作用中，effector是主要的致病性決定因素，他們調解植物的先天免疫并且加強寄生感染。現在，在國際會議上， 絲狀病原菌effector的染色體組組織、進化、交換及功能研究已經成為很活躍的研究探討領域。絲狀病原菌分泌蛋白質以擾亂它們侵入的宿主的概念并不是特別新穎，但是這方面的研究正在加快，因為它使生成某個特定病原菌物種中的整套分泌蛋白目錄成為可能 (Dean et al.，2005 ；Kamper et al.，2006 ；Haas et al. , 2009)。這一方面的研究被基因組測序時代的到來以及伴隨的分泌信號的云計算預測和其它的effector序列基序診斷程序所推動。一些病原真菌effector家族的特征之一是含有線性基序或是含有與特定功能相關的短序列模式，比如轉位到宿主細胞內或是靶向宿主細胞核。RXLR是這些effector分子中最突出的例子，它定義了卵菌RXLR家族中的一個宿主運輸結構域。預測的RXLR也被用在高通量的篩選中，以盡快并有效的確定它們的新的功能活性。ATRl和ATR13是模式植物擬南芥的卵菌病原菌Hyaloperonospora arabidopsidis 的具有無毒基因活性的兩個effector。ATRl和ATR13是分泌型的RXLR effector長度分別為310和150個氨基酸，并分別誘發RPPl-Nd/ffsB和PP13_Nd介導的抗性(Allen et al.， 2004 ；Rehmany et al.，2005)。這種相互作用的共調解已經形成了不同的、快速進化的無毒基因和抗性基因的同位基因(Allen et al. ,2008 ；Hall et al.，2009)。ATR13除了具有信號肽和RXLR基序的特征外，還包含一個保守的7亮氨酸/異亮氨酸重復序列，這個重復序列是被RPP13識別所必須的(Allen et al.，2008)。事實上這個重復序列的突變并沒有進化意味著它是發揮毒性作用所必須的(Allen et al.，2008)。另外，無毒活性也依賴于ATR13C-端的可變氨基酸(Allen et al.，2008)。值得注意的是在RPP13家族中至少有一個基因以迄今為止都不知道的方式識別ATR13的等位基因，這強調了無毒基因和抗性基因復雜的相互作用網絡(Hall et al. ,2009) ATRl和ATR13在H. arabidopsidis中的高度可變性及它們在擬南芥中的同源基因的多樣性意味著這些effector可能極其有助于病原菌的適應性。ATRl和ATR13在抑制基礎的抗性通路中的作用已經通過在細菌植物病原菌I^seudomonas syringae DC3000中進行異源表達并運輸到宿主細胞中建立起來(Sohn et al.，2007)。當被P. syringae DC3000運輸到擬南芥中時，ATRl和ATR13都增加了毒性，并且減少了擬南芥中胼胝質的積累(Sohn et al.，2007)。AVR3a 是 Phytophthora infestans 的細胞質 RXLR effector 蛋白。AVR3a 的一個有趣特征是它在致病機制中的雙重活性。AVR3a在表達R3a基因的植物中誘發過敏反應 (HR) (Armstrong et al.，2005)。但是在缺少 R3a 基因的植株中，AVR3a 抑制 P. infestans INFl隱地蛋白誘導的細胞死亡(Bos et al.，2006)。這些不同的活性可以在結構水平上分離。在C-端氨基酸殘基酪氨酸147處發生了刪除或突變的AVR3a保留了 R3a介導的過敏反應，但是不能抑制INFl誘導的細胞死亡(Bos et al. ,2006 ；2009) 0另外，AVR3a的兩個主要的等位基因編碼的蛋白質在effector結構域處只有兩個氨基酸的差別，但是卻有著很明顯的活性差別。是AVR3aK8°m°3而不是AVR3aE8(lAn°3活化了 R3a并且是INFl誘導的細胞死亡的比較強的抑制子((Bos et al.，2006)。除了 RXLR effector外，對P. infestans的分泌蛋白的研究又確認了另一個細胞質effector家族，即Crinkler。Crinkler是卵菌的另外一個大的、多樣化的effector 家族。高通量的功能篩選揭示了兩個細胞死亡誘導蛋白CRm和CRN2(Crinkling and necrosis)，當它們在植株中系統性的表達時會引起葉片的皺縮表型(Torto et al., 2003)。隨著P. infestans基因組序列的可利用性，對基因稀有區域的研究揭示了除了 RXLR effector基因外，CRN基因家族共定位于重復富集區域，并且跟其它的Wiytophthora基因家族相比，在P. infestans中CRN基因家族已經戲劇性的擴張(193個預測的基因)(Haas et al.，2009)。這個基因家族的擴充已經通過多基因復制和基因內部重組事件發生，這一事件最終導致了一個大的、多樣化的嵌合effector系統(Haas et al.，2009)。CRN effector是以一個預測的N-端分泌信號肽為特征的模塊化的蛋白質，后面是一個被保守的但并不是不變的LXLFLAK基序(CRN蛋白的主要的定義特征)定義的結構域(Haas et al.，2009)。大多數CRN在LXLFLAK結構域后攜帶一個以HVLVXXP基序結尾的DWL結構域(Haas et al.， 2009) 0 Haas et al. O009)提出CRN之間的重組，尤其是HVLVXXP基序后的重組，產生了極其多樣化的C-端結構域(在P. infestans中是由36個相異的氨基酸決定的)。類似于好幾個RXLR蛋白，一些CRN C-端(因此缺少預測的N-端轉移結構域)的在植物細胞內的表達誘導了細胞死亡(Haas et al.，2009)。然而，在病害中CRN誘導的細胞死亡的相關性仍然是不清楚的。Yoshida et al. (2009)發現了從稻瘟病菌lnal68特有序列中挖掘到的三個候選 effector 基因 Pex22，Pex31 和 Pex33，分別與三個無毒表型 Avr-Pia，Avr-Pik/km/kp 和 Avr-Pii有著完美的聯系。隨后的遺傳轉化實驗證實了是effector Pex22,Pex31和Pex33 賦予了分別表達Pia Pik/km/kp和Pii抗性基因的水稻培養系的無毒性。通過定位克隆得知被鑒定為是 Avr-Pia 的 Pex22 是獨立的(Miki et al.，2009)。Pex22，Pex31 和 Pex33 都很小，在長度上分別為85，70和113個氨基酸，包含分泌信號，并且在水稻細胞中的細胞質中被識別，這意味著在感染的過程中它們被運輸到植物細胞中。有趣的是Pex22形成一個包含四個同源物的小家族，這個小家族以兩個序列基序的出現為特點基序1是[LI]xAR[SE] [DSE]，類似于Avr-Piz-t的LxAR基序，能夠抑制BAX介導的細胞死亡(Li et al. ,2009)； 基序2是[RK]CXXCX12H，表現出與蛋白質-蛋白質相互作用有關的C2H2鋅指基序的相似性(Yoshida et al. ，2009)。來自亞麻銹病菌Melampsora Iini的轉移effectorAvrL567家族是通過與亞麻的抗性蛋白L5，L6和L7直被接的相互作用被認識到的(Dodds et al.，2006)。這個系統是特別的，因為AvrL567-A和AvrL567-D的晶體結構已經得到闡明(Wang et al.，2007)。這就允許在蛋白質結構背景下，在基因對基因基礎上跟分子識別事件有關的多態性殘基的作用進行檢測(Wang et al.，2007)。兩種蛋白都沒有接近已知的結構同源物。四個重要的高度多態性殘基在AvrL567的50、56、90和96位置處，它們對于激活R蛋白是關鍵的，并定位在這些effector蛋白的表面。有趣的是AvrL567的四個殘基的分布橫跨整個蛋白質表面，表明AvrL567和R蛋白的富亮氨酸重復結構域之間的相互作用，要求對于整體相互作用有累積效應的多重連接點。這在協同進化中保持或發展毒性功能(對于病原體來說是有利的)但同時規避宿主的檢測可能是重要的。蛋白的結構也揭示了結合DNA的兩個正電荷表面點，隨后的體外實驗表明這些蛋白結合到核酸上。這表明當從最初序列中幾乎不能得到有用線索時，結構生物學是怎樣促進effector的功能研究的。使用圖位克隆策略克隆從L印tosphaeria maculans中得到了 AvrLml，AvrLm6 and AvrLm4-7 三個無毒基因(Gout et al. ,2006 ；Fudal et al. ,2007 ；Parlange et al., 2009)。它們編碼預測的小的從122到205個氨基酸的分泌蛋白，與公共數據庫中的任何蛋白都沒有相似性。AvrLm6和AvrLm4-7分別包含6個和8個半胱氨酸殘基。這些半胱氨酸可能在質體外能穩定AvrLm6和AvrLm4_7蛋白。然而，AvrLml只有一個半胱氨酸殘基，考慮到目前為止所有被描述的質體外effector都是富半胱氨酸蛋白，所以AvrLml很可能轉運到宿主細胞內(KamOUn，2007)。盡管我們很清楚它們有無毒性的活性，但是AvrLm識別的機制，相應的Rlm抗性基因和它們的作用位點仍然是不清楚的。跟目前克隆到的大多數其它真菌的effector真菌相比，這三個L. maculans基因有著較低的GC含量。它們都是單拷貝基因，位于富AT和富轉座子的60kb (AvrLm4-7)，133kb (AvrLm6)，269kb (AvrLml)的類異染色質區域。這些effector定位在獨特的基因組環境中，是真菌有條件的獨立于染色體 (van der Does and R印，2007)，Plasmodium 的亞端粒區域(Pain et al.，2008)，或者在 P. infestans中基因稀有區域(Haas et al. ,2009)的遺跡。這被認為能夠加快基因進化并加速病原體對宿主的適應性(van der Does and Rep, 2007 ；Pain et al.，2008 ；Haas et al.，2009)。絲狀植物病原菌已經進化出了具有抑制蛋白酶活性以保護幾種宿主水解酶活性的 effector 蛋白(Kamoun，2006)。近來 Misas-Villamil 禾口 van der Hoorn 已經對這些 effector和它們的宿主靶標做了評價O008)。寄主專化性毒素(HST)是具有化學多樣性的effector分子，它是由植物致病真菌產生的作為毒性因子發揮功能。這些致病性決定因子只有在對產生這種毒素的病原菌敏感的宿主植物中才有活性(Wolpert et al.，2002)。有趣的是，好幾種蛋白質HST，比如腐質營養真菌物禾中 Pyrenophora tritici-repentis 禾口 Stagonospora nodorum 白勺 PtrToxA, SnToxl, SnTox2和SnToX4都表現出光依賴模式的壞死誘導并促進了毒素敏感性的宿主小麥植株的感病性(Liu et al.，2004 ；Friesen et al.，2007 ；Abeysekara et al.，2009 ； Manning et al.，2009)。這些effector發揮功能所必須的，相應的顯性的宿主基因Tsnl， Srml，Srm2，Snn4被繪制在毒素敏感宿主的染色體圖譜上，并且這些基因的產物被認為是跟HST直接或間接相互作用的受體(Liu et al. ,2004 ；Friesen et al. ,2007 ；Abeysekara et al. ,2009 ；Manning et al.，2009)。值得注意的是，在HST中表現出與基因對基因不同的相互作用，在HST中受體分子是必須的而不是在經典的無毒-抗性基因相互作用中的抗性 (ffolpert et al.，2002)。PtrToxA 是在 P. triticirepentis 禾口 S. nodorum 的 HST 中研究的最透徹的。它有一個含N-端分泌信號的模塊結構，分泌信號被切除以形成成熟蛋白，分泌信號后是宿主轉運所必須的R⑶結構域和一個C-端effector結構域(Sarma et al. ,2005 ； Manning et al. ,2007) 據報道PtrToxA定位在葉綠體并且跟葉綠體蛋白ToxABPl相互作用(Manning et al.，2007)。一旦它轉運到葉綠體中，PtrToxA就以光依賴的方式，通過干擾光系統I和光系統II促進毒力并最終誘導活性氧物質積累(Manning et al.，2009)。類^pl蛋白(NLP)是誘導雙子葉植物壞死的細菌、真菌和卵菌毒素(Pemberton and Salmond, 2004 ；Ottmann et al. ,2009) 盡管它們在不同的分類群中的分布多種多樣，NLP具有一個共同的折疊特征，S卩，有一個七肽(GHRHDWE)基序和兩個保守的半胱氨酸，表現出與海洋生物產生的海葵溶細胞素和溶細胞毒素的結構相似性(Gijzen and Nurnberger，2006 ；Ottmann et al. ,2009) 在半活體營養的卵菌病原體 P. so jae 和 P. infestans中NLP基因(NPP1和PiNPPl. 1)的表達在宿主感染的后期腐質營養階段是上調的(Qutob et al. ,2002 ；Kanneganti et al. ,2006) 這些NLP在它們的溶細胞活性作用下可能有助于宿主組織的死亡，并因此在腐質營養病原體生長過程中促進其侵入(Qutob et al. ,2002 ；Kanneganti et al.，2006)。盡管現在已經清楚一些NLP作為毒素促進毒力， 并不見得這一家族的所有成員在它們的宿主中都有溶細胞毒素的活性。目前我們仍然不清楚很多effector的生物化學活性以及它們是如何增強病原體的成功生殖的。我們也幾乎不知道絲狀病原體effector的靶標，特別是轉移到宿主細胞內部的 effector。
發明內容
本發明的目的是分離克隆立枯絲核菌菌株AGlIA中攜帶的effector基因和包含調控這個基因的啟動子的DNA片段。本發明的另一目的是提供該基因在設計農藥分子靶點中的應用。本發明的進一步目的是提供該基因在建立分子檢測體系，檢測植物紋枯病發病情況中的應用。本發明的更進一步目的是提供該基因在提高水稻抗病育種中的應用。本發明分離克隆的立枯絲核菌菌株AGlIA中的effector基因AG1IA06910，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。該核苷酸序列在立枯絲核菌菌絲中呈組成型表達。上述基因的蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。應當理解，在不影響蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本領域技術人員對SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響蛋白表達的條件下，對編碼上述蛋白的基因序列進行修飾。因此，本發明還包括對編碼上述蛋白的基因序列進行的替換、添加和/或缺失一個或多個氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸序列。本發明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達載體、含有所述載體的宿主細胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉化的植物細胞核轉基因載體。本發明同樣包括將該基因的編碼區和一個誘導型啟動子連接，該啟動子可以在 IPTG誘導下，在大腸桿菌細胞中表達這個基因。誘導型啟動子包括組織特異性表達的啟動子和精確環境誘導的啟動子。本發明還包括將該基因的編碼區和一個組成型表達的啟動子連接，該啟動子可以在任何條件下及在侵入組織的不同時期表達。這種組成型的啟動子包括花椰菜花葉病毒35S的啟動子等，該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。AG1IA06910與誘導型啟動子連接后加入誘導劑后表達，不加誘導劑不表達；與組成型啟動子連接后不需加入任何誘導劑便可持續表達。表達。其中環境條件包括植株的生長狀況、溫度、濕度等，侵入植株的不同時期包括孢子萌發、附著胞形成、侵入釘分化和侵染菌絲擴展等。本發明提供的立枯絲核菌effector基因具有重要的應用價值。應用之一是根據該基因的結構及其功能來設計新型農藥的分子靶點。應用之二是將所述基因序列連接到任何一種含有熒光蛋白基因的轉化載體，用任何一種轉化方法effector基因和熒光蛋白基因共價導入水稻或其它植物細胞。利用熒光共聚焦透射電鏡可以觀察到在水稻或其它植物細胞中與熒光蛋白融合表達的effector蛋白在植物細胞中的遷移及定位。利用此effector為誘餌蛋白釣出水稻或其它植株中與該 effector蛋白結合的受體蛋白。應用之三是利用基因工程方法敲除水稻或其它植物細胞中該受體基因或刪除、 添加、突變該受體基因的一個或多個堿基以缺失或改變受體基因的功能，得到抗某一 effector的抗性植株。本發明提供的effector基因的另一個應用是根據所述基因序列信息產生特異性的分子標記，包括但不限于SNP (單核苷酸多態性)、SSR(簡單序列重復多態性)、RFLP (限制性內切酶長度多態性)、CAP (切割擴增片段多肽)。用這些標記可檢測田間立枯絲核菌群體的生理小種及其遺傳結構的動態變化，以及該effector基因在田間自然群體中的分布情況；有助于水稻品種的抗病性鑒定和立枯絲核菌小種的鑒定；也有助于抗病品種的合理布局和輪換，以便有效地控制紋枯病的發生。本發明能夠進一步提供或應用利用上述DNA片段獲得的無相應effector基因功能的轉基因菌株，以及用本發明的基因轉化的菌株。也可以用有性雜交的方式將本發明的基因轉入其它的菌株。本發明的有益效果本發明通過對立枯絲核菌effector基因的克隆及其功能分析，有助于揭示立枯絲核菌小種與水稻品種間特異性互作及其進化的分子機理。在實踐上可以根據該基因的結構及其功能設計新型農藥的分子靶點；可以將水稻等宿主細胞中該 effector蛋白的受體蛋白基因敲除或突變，以得到持久抗病品種；有助于建立立枯絲核菌自然群體致病性變異的分子檢測體系，研究立枯絲核菌effector基因在田間自然群體中的分布情況，揭示立枯絲核菌群體中小種的組成和變異特點；也有助于水稻品種的抗病性鑒定及其合理布局和輪換，以便有效地控制紋枯病的發生。
圖1為立枯絲核菌effector基因AG1IA06910的圖位克隆示意圖；圖2為立枯絲核菌effector基因AG1IA06910的PCR檢測結果圖；圖3為立枯絲核菌effector基因AG1IA06910表達蛋白的SDS-PAGE檢測結果圖；其中，圖2 中 M 為分子量標記，依次為 5000bp，3000bp，2000bp，IOOObp，750bp (加亮帶)，500bp, 250bp, IOObp ；泳道1，3，4為AG1IA06910的PCR產物；泳道2為陰性對照 (CldH2O2)；泳道5-8為AG1IA06910基因的轉化子菌株的PCR產物，其中5，6為假陽性轉化子菌株。圖3中泳道M為分子量標記，依次為80kD，60kD, 40kD (加亮帶)，30kD，20kD, 12kD ； 泳道1、2為誘導后的蛋白條帶，在30kD處出現目的帶；泳道3為未誘導的菌液蛋白條帶。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。這些實施例除另有說明外，本申請中的所有科技術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常采用常規條件例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。實施例1 預測的effector基因的克隆AGlIA菌株是由四川農業大學水稻所自行從田間水稻紋枯病發病植株上分離純化的，為水稻植株上普遍存在的真菌菌株，廣泛分布在水稻栽培的地區。(AG1IA菌株已公開發表于四川農業大學，碩士論文，立枯絲核菌AGlIA誘導玉米差異蛋白的分析，作者李蕓)在超凈工作臺下，用鑷子挑取少量AGlIA的菌絲，接入50ml PDA培養基中，把菌絲搗碎，280C，200r/m培養兩天后，用四層紗布過濾收集菌絲，用液氮研磨提取總RNA。用 oligodT做引物，反轉錄得到cDNA。根據預測的序列設計引物如下5， ATGTGCAGCGCACTTGTGTCCAGACCATGTGATA AGATCTGG3，5，TCACGTGGCCGTCGAGTCGGCAGGTTTCGGAGGTGCATGCGGAAT3，以 cDNA 為模板克隆得到目的基因，克隆到的基因如圖2。實施例2 :effector基因原核表達載體的構建、轉化和表達PCR得到的目的基因電泳檢測沒有雜帶，即可根據TransGen Biotech Peasy-Elkit說明，把目的基因連接到表達載體pEASY_El上，經過測序基因AG1IA06910與預測序列完全相同，堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。轉化條件與常規大腸桿菌轉化條件相同，挑取陽性轉化子，37°C培養至OD值為0. 6后，轉入28°C, IPTGlmM誘導7到11個小時， 表達effector蛋白。表達蛋白的SDS-PAGE檢測圖如圖3。實施例3 表達蛋白的致病性檢測收集AG1IA06910表達后的菌體超聲波破碎得到粗蛋白，破碎過程中注意勿使蛋白變性(破碎時間5S為宜，功率不超過200W，破碎過程中始終保持樣品在冰浴條件下)。選取生長一致的溫室培養的三葉期的水稻葉片，放在內置兩層濾紙的滅菌培養皿中保持濾紙濕潤以使葉片保濕。用滅菌的牙簽在水稻葉片中央打一個小孔，用三層滅菌的 0. 5cmX0. 5cm的濾紙片覆蓋在小孔上，接種粗蛋白的量為50微升。侵染后的葉片放在28
8攝氏度光照培養箱，光照12h，黑暗12h，RH(病情指數)80%。連續數天觀察葉片發病情況并拍照，記錄病程。侵染后6天對照蛋白侵染的葉片沒有肉眼可見的變化，effector蛋白產物侵染的葉片小孔周圍發黃且孔變大；侵染后7天effector蛋白產物侵染的葉片明顯比對照蛋白侵染的葉片黃，且局部區域出現黑色；侵染后8天對照蛋白侵染的葉片仍然保持綠色，而effector蛋白產物侵染的葉片則大面積發黃、壞死(PCD)。實施例4 effector基因的表達特性分析利用RT-PCR技術對AG1IA06910基因的表達模式進行了分析。從接種水稻葉片和接種水稻葉片的菌絲提取的總RNA，反轉錄得到cDNA后，利用預測序列設計引物(引物序列同實施例1中的引物序列)，均能克隆到目的基因，如圖2。PCR程序為94°C預變性^iin; 94°C變性50sec，55°C退火50sec，72°C延伸lmin，;35個循環；72°C后延伸lOmin。說明該基因為組成型表達的基因。實施例5 :effector基因AG1IA06910基因的應用利用本發明提供的AG1IA06910基因的序列信息，根據該基因的結構及功能設計新型農藥的分子靶點；該新型農藥的主要成分可以是AG1IA010188基因蛋白產物的結構類似物，可以與AG1IA010188基因蛋白產物競爭性結合到水稻中的靶位點，但卻不會使水稻發病的信號通路進一步向下游傳遞，從而使AG1IA010188基因蛋白產物不能結合到水稻中的靶位點，使發病信號通路阻斷在受體蛋白部位。還可以將該基因蛋白產物在水稻中的受體蛋白基因或信號通路中的其它基因沉默或敲除掉，培育抗紋枯病的水稻新品種，使紋枯病菌只能在植株表面形成附著胞或侵染墊，卻不能進一步侵入到植株組織內部；或者即使侵入植株組織內部，因為受體蛋白基因或信號通路中的其它基因被沉默或敲除掉而使過敏反應等發病信號通路阻斷，使病癥減輕并且只能局限在某一小部分區域內而不是發展到整株植株。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種水稻立枯絲核菌effector基因AG1IA06910，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所不。
2.權利要求1所述基因編碼的蛋白。
3.如權利要求2所述的蛋白，其氨基酸序列是1)SEQID No. 2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。
4.含有權利要求1所述基因的載體和宿主細胞。
5.如權利要求1所述的基因，其特征在于，其功能是通過啟動子與轉錄因子結合來調控的。
6.如權利要求5所述的基因，其特征在于，所述啟動子為誘導型啟動子或組成型啟動子。
7.權利要求1所述基因在設計農藥分子靶點中的應用。
8.權利要求1所述基因在建立分子檢測體系，檢測植物紋枯病發病情況中的應用。
9.權利要求1所述基因在水稻抗病育種中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述抗病育種是將權利要求1所述基因的蛋白產物在水稻中的受體蛋白基因或信號通路中的其它基因沉默或敲除掉。
全文摘要
本發明提供了一種水稻立枯絲核菌effector基因AG1IA06910，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。對本發明基因的研究，在實踐上可以根據該基因的結構及其功能設計新型農藥的分子靶點；可以將水稻等宿主細胞中該effector蛋白的受體蛋白基因敲除或突變，以得到持久抗病品種；有助于建立立枯絲核菌自然群體致病性變異的分子檢測體系，研究立枯絲核菌effector基因在田間自然群體中的分布情況，揭示立枯絲核菌群體中小種的組成和變異特點；也有助于水稻品種的抗病性鑒定及其合理布局和輪換，以便有效地控制紋枯病的發生。
文檔編號C12N5/10GK102517297SQ201110434809
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者張丹華, 朱軍, 李雙成, 李平, 王世全, 鄧其明, 鄭愛萍 申請人:四川農業大學