一種適用于纖維堆囊菌的新型talen載體及其構建方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于生物化學和分子生物學領域，具體涉及一種適用于纖維堆囊菌的 TALEN載體及其構建方法。
【背景技術】：
[0002] TALE是來自于植物致病細菌黃色單胞桿菌屬的一類具有高度特異性的DNA結合 S[=l (Sanjana NE, Cong L, Zhou Y, Cunniff MM, Feng G, Zhang F. A TAL effector toolbox for genome engineering. Nature Protocols, 2012, 7:171-192.)，其特異性是由其重復單 元中的重復可變區（Repeat Variable Diresidue，RVD)決定的。TALE元件主要包括TALEN 元件和TALE-TF元件，TALEN元件由于基因敲除效率高、幾乎無脫靶作用等優點已經在哺乳 動物細胞、干細胞和植物等真核細胞的基因組編輯方面有著十分廣泛的應用，而由于相應 載體的缺乏，TALEN在原核生物中的應用尚未見報道。由于纖維堆囊菌其次級代謝產物豐 富，構建其基因改造體系對于其代謝產物種類和產量十分重要，但由于相關載體的缺乏及 纖維堆囊菌成團生長的特性導致纖維堆囊菌的基因工程改造進展緩慢。因此，構建適用于 纖維堆囊菌的TALEN載體將擴大TALEN技術的應用范圍，提高原核生物的基因組編輯效率， 促進基因組編輯技術的發展。
【發明內容】
：
[0003] 本發明的目的是提供一種適用于纖維堆囊菌的新型TALEN載體及其構建方法。
[0004] 本發明的適用于纖維堆囊菌的新型TALEN載體，其特征在于，其是通過以下方法 構建的：根據目的基因的堿基序列確定靶標序列，再確定靶標序列上下游的靶標識別域堿 基序列，根據上下游的靶標識別域堿基序列設計TAL重復單元，分別得到上游的TALE重復 單元和下游的TALE重復單元，將上游的TALE重復單元連接至Ptalen L48載體上，下游的 TALE重復單元連接至Ptalen R36載體上；再用內切酶Hindlll和Spel酶切Ptalen L48載 體和上下游含有內切酶Hindlll和Spel位點的P43啟動子，再進行連接反應，使P43啟動 子代替啟動子PGPD插入到酶切位點Hindlll和Spel之間，得到載體P43LTALEN ;再用內切 酶AscI和Spel酶切Ptalen R36載體和上下游含有內切酶AscI和Spel位點的P43啟動 子，再進行連接反應，使P43啟動子代替啟動子pGPD插入到酶切位點AscI和Spel之間，得 到載體P43RTALEN ;載體P43LTALEN和載體P43RTALEN即為適用于纖維堆囊菌的新型TALEN 載體。
[0005] 所述的纖維堆囊菌優選為纖維堆囊菌So ce M4,也可以是纖維堆囊菌So ce 90、 So ce 56 和 So ce M6。
[0006] 目前，關于TALEN技術在原核生物中的應用幾乎未見報道，本發明首次將適用于 大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的啟動子P43替換適用于真核生物的啟動子，將構建成功的靶標 目的基因的左右臂TALEN元件和靶標基因共同轉入纖維堆囊菌，用Western blot驗證重組 蛋白是否表達，從而驗證所構建的載體能在纖維堆囊菌中行使基因敲除的功能，進一步拓 寬TALEN技術的應用范圍，促進生物技術的發展。
【附圖說明】：
[0007] 圖1為ADH2基因擴增及pET22b-ADH2雙酶切鑒定圖；
[0008] 圖2為TALEN靶標序列圖及TALEN重組載體測序鑒定圖；
[0009] 圖3為P43LTALEN及P43RTALEN雙酶切鑒定圖；
[0010] 圖4為P43LTALEN、P43RTALEN及pET22b-ADH2導入纖維堆囊菌后的質粒及PCR鑒 定圖；
[0011] 圖5為敲除成功重組菌測序結果與ADH2基因比對圖；
[0012] 圖 6 為導入 P43LTALEN、P43RTALEN 和 pET22b-ADH2 后的總蛋白 Western blot 鑒 定圖。
【具體實施方式】：
[0013] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0014] 實施例1 :pET22b-ADH2重組質粒的構建：
[0015] 一、ADH2基因的獲取。
[0016] 1?設計引物：
[0017]上游引物：GGAATTCCATATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAG
[0018]下游引物：GCCCTCGAGITTAGAAGAGTCAACAACGT
[0019] 2.用試劑盒提取啤酒酵母As2. 4的基因組，按如上引物PCR擴增得到長度約為 1024bp的帶酶切位點的ADH2基因并測序驗證（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，ADH2基因的堿基序列的Genbank登陸號為NM_001182812. 1)，
[0020] PCR反應體系如下：
[0021]
【主權項】
1. 一種適用于纖維堆囊菌的新型TALEN載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 根據目的基因的堿基序列確定靶標序列，再確定靶標序列上下游的靶標識別域堿基序列， 根據上下游的靶標識別域堿基序列設計TAL重復單元，分別得到上游的TALE重復單元和下 游的TALE重復單元，將上游的TALE重復單元連接至Ptalen L48載體上，下游的TALE重復 單元連接至Ptalen R36載體上；再用內切酶Hindlll和Spel酶切Ptalen L48載體和上下 游含有內切酶Hindlll和Spel位點的P43啟動子，再進行連接反應，使P43啟動子代替啟 動子PGPD插入到酶切位點Hindlll和Spel之間，得到載體P43LTALEN ;再用內切酶AscI 和Spel酶切Ptalen R36載體和上下游含有內切酶AscI和Spel位點的P43啟動子，再進 行連接反應，使P43啟動子代替啟動子pGPD插入到酶切位點AscI和Spel之間，得到載體 P43RTALEN ;載體P43LTALEN和載體P43RTALEN即為適用于纖維堆囊菌的新型TALEN載體。
2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的纖維堆囊菌為纖維堆囊菌So ce M4〇
3. -種按照權利要求1或2所述的制備方法制備得到的適用于纖維堆囊菌的新型 TALEN載體。
【專利摘要】本發明公開了一種適用于纖維堆囊菌的新型TALEN載體及其構建方法。本發明首次將適用于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的啟動子P43替換適用于真核生物的啟動子，將構建成功的靶標目的基因的左右臂TALEN元件和靶標基因共同轉入纖維堆囊菌，用Western blot驗證重組蛋白是否表達，從而驗證所構建的載體能在纖維堆囊菌中行使基因敲除的功能，進一步拓寬TALEN技術的應用范圍，促進生物技術的發展。
【IPC分類】C12N15-55, C12N15-74, C12N15-66
【公開號】CN104673820
【申請號】CN201510083348
【發明人】葉偉, 章衛民
【申請人】廣東省微生物研究所
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月13日