專利名稱：生物催化制備6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯及菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株具有R-羰基還原酶活性的菌株——季也蒙畢赤酵母菌(PiChiaguilliermondii)X25,及其在生物催化法制備光學純6-氰基-(3R, 5R)-二輕基己酸叔丁酯中的應用。
背景技術：
手性藥物在許多疾病的防治中具有重要意義，其合成研究受到學術界、企業以及政府的高度重視。具有特定功能基團的手性醇更是許多手性藥物合成的關鍵手性砌塊，并且在制藥、農藥、香料等精細化工方面有著十分廣泛的應用。心血管疾病成為對人類最具威脅的疾病之一，其發病率和死亡率均已超過惡性腫瘤性而躍居第一。據世界衛生組織統計，全世界每年有3000多萬人死于心腦血管疾病。中國每年因心腦血管疾病及并發癥死亡病例超過300萬。積極治療高血脂癥是預防心腦血管疾病的關鍵，降血脂藥物開發已經成為全球藥物研究的重點和熱點。他汀類藥物是目前主要的降血脂藥物，其對膽固醇生物合成過程中的限速酶——3-羥基-3-甲基輔酶A(HMG-CoA)還原酶具有顯著抑制作用，降低細胞游離膽固醇水平，反饋性上調細胞表面低密度脂蛋白受體表達，促進循環血液中極低密度脂蛋白膽固醇殘粒和低密度脂蛋白的清除，最終降低血清中總膽固醇和低密度脂蛋白的水平，有效防止動脈粥樣硬化和冠心病的發生。全球開發和在研的他汀類藥物已有十多個品種。第一代他汀藥物包括辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀，是一類結構類似的真菌代謝物。第二代他汀包括化學合成的外消旋氟伐他汀。第三代他汀是合成的光學純他汀藥物，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀。他汀類降脂藥占世界降脂藥市場的85%以上份額，并仍具有提升空間。手性β，δ - 二羥基己酸(酯)結構是合成他汀藥物的藥效基團、手性砌塊，也是合成他汀藥物的重點和難點。他汀類藥物的最終質量取決于手性側鏈對應異構體的光學純度，各國藥監部門要求ee值大于99.5%，de值大于99%。6_氰基-(3R，5R)- 二羥基己酸叔丁酯是他汀類藥物合成的手性砌塊，合成工藝包括化學不對稱合成和生物不對稱合成。6_氰基-(3R，5R) - 二羥基己酸叔丁酯化學合成方法存在諸多缺陷，合成需要使用劇毒的三乙基硼和-85°C深冷條件，而且非對映誘導不充分，產物6-氰基-(3R，5R) - 二羥基己酸叔丁酯de值低，該反應形成的硼化物廢物處理需要經過繁瑣的反復甲醇淬滅、真空蒸餾等。與化學方法相比，生物合成法具有以下優點(I)立體、區域和化學選擇性高，這主要是因為酶對底物、產物的嚴格的專一性識別；而使用化學合成方法時，只有當羰基兩邊的基團差異很大時才能獲得較高的立體選擇性；(2)安全性與環境相容性好，生物催化安全且反應條件溫和，通常以水溶液作為反應體系，環境友好。 具有羰基還原酶(醇脫氫酶)活性微生物廣泛存在于自然界中，但他們不對稱還原羰基往往遵循Prelog還原規則、產物構型為S構型；具有反-Prelog立體選擇性羰基還原酶活性的微生物在自然界中非常罕見。迄今為止，文獻報道的具有不對稱還原(R)_6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備6-氰基-(3R，5R) - 二羥基己酸叔丁酯活性的微生物菌種有 Saccharomyces cerevisiae,Pichia angusta NCYC 495,Pichia angusta NCYCR320,Pichia angusta NCYC R322, Pichia haplophila CBS 2028,Beauveria bassiana,Pichiapastoris, Pichia membranefaciens, Pichia angusta, Candida humicola, Candidasolani, Candida diddensiae, Candida friedrichii, Kluyveromyces drosophilarum,Debaromyces hansenii。目前，未見 Pichia guilliermondii 具有(R)-6_ 氰基-5-輕基-3-羰基己酸叔丁酯非對映選擇性羰基還原酶活性的報道。
發明內容
本發明目的是克服現有的6-氰基_(3R，5R)_ 二羥基己酸叔丁酯生產技術的不足，提供一種從土壤中富集、篩選具有高立體選擇性羰基還原酶活性微生物菌種——季也蒙畢赤酵母菌(Pichia guilliermondii) X25,及其在生物不對稱還原(R)_6_氰基-5-輕基-3-羰基己酸叔丁酯制備6-氰基-(3R，5R) - 二羥基己酸叔丁酯中的應用。本發明采用的技術方案是一株具有反-Prelog非對映選擇性R-羰基還原酶活性的菌株——季也蒙畢赤酵母菌(Pichia guilliermondii)X25，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏編號為CCTCC No M 2011386，保藏日期為2011年11月11日。經鑒定，該菌株屬于畢赤酵母屬(Pichia)的guilliermondii種,菌株編號為X25。菌株菌落形態菌落呈乳白色，邊緣整齊，圓形，不透明，表面光滑、隆起(細胞掃描電鏡照片見圖I)。細胞形態細胞呈卵圓或瓜子形，大小約I. 4 2. 5 μ mX I. 4 5. O μ m。生理生化特征利用Biolog微生物自動鑒定系統測定菌株X25對65種碳源的代謝情況，經Biolog讀數儀分析代謝指紋，菌株X25能較強利用42種碳源，對其他23種碳源不能利用或利用能力較弱(詳見表I)。表I :利用Biolog微生物自動鑒定系分析菌株X25碳源利用結果
權利要求
1.一株具有R-羰基還原酶活性的菌株——季也蒙畢赤酵母菌(PichiagUillierm0ndii)X25，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏編號為CCTCC No M 2011386，保藏日期為2011年11月11日。
2.如權利要求I所述的季也蒙畢赤酵母菌X25，其特征在于該菌株的18SrDNA核音酸序列如下agataggttg ggccagaggt ttaacaaaac acaatttaattatttttacagttagtcaaattttgaatta atcttcaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctcgcatcgatgaagaacgcagcgaa atgcgataag taatatgaat tgcagatttt cgtgaatcat cgaatctttgaacgcacattgcgccctctg gtattccaga gggcatgcct gtttgagcgt catttctctctcaaacccccgggtttggtattgagtgata ctcttagtcg gactaggcgt ttgcttgaaa agtattggca tgggtagtactggatagtgctgtcgacctc tcaatgtatt aggtttatcc aactcgttga atggtgtggc gggatatttctggtattgttggcccggcct tacaacaacc aaacaagttt gacctcaaat caggtaggaatacccgctga acttaagcatatcaataagc ggagga。
3.如權利要求I所述的季也蒙畢赤酵母菌X25在微生物非對映選擇性催化制備6-氰基-(3R，5R) - 二羥基己酸叔丁酯中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述應用為在以(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物、季也蒙畢赤酵母菌X25經發酵獲得的含酶菌體細胞為催化齊U、磷酸鹽緩沖液為溶劑的反應體系中，于25 35°C下進行轉化反應，于反應液中獲得所述6-氰基-(3R，5R) - 二羥基己酸叔丁酯。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述含酶菌體細胞由如下方法制備得到季也蒙畢赤酵母菌X25接種至發酵培養基中28 30°C培養36 48小時，得到發酵液經分離得到所述含酶菌體細胞；所述發酵培養基終濃度組成如下葡萄糖10 40g/L，酵母膏10 30g/L,葡萄糖 25. O 50. Og/L, Na2HPO4L O 5. Og/L, NaCl O. I lg/L, CuCl2IO 30mg/L, (R) -6-氰基-5-輕基-3-羰基己酸叔丁酯O. 5 5. Og/L，溶劑為水，pH5 9。
6.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述應用為將季也蒙畢赤酵母菌X25經發酵獲得的含酶菌體細胞以O. I 20. Og DCW/L添加量分散到磷酸鹽緩沖液中，加入葡萄糖10 100g/L,加入(R)-6-氰基-5-輕基-3-羰基己酸叔丁酯10 100g/L,充分混合、預熱至15 45°C后，15 45°C反應0. 5 32小時，得到含產物6-氰基-(3R，5R) - 二羥基己酸叔丁酯的轉化液；轉化液經等體積乙酸乙酯、乙酸丁酯萃取，萃取液減壓蒸餾回收溶劑，真空濃縮，得到所述6-氰基_(3R，5R)_ 二羥基己酸叔丁酯。
全文摘要
本發明提供了一種從土壤中富集、篩選具有高非對映選擇性羰基還原酶活性微生物新菌種——季也蒙畢赤酵母菌(Pichia guilliermondii)X25，及其在生物不對稱還原(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備6-氰基-(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯中的應用。該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏編號為CCTCC NoM 2011386，保藏日期為2011年11月11日。利用該菌產生的羰基還原酶轉化(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備光學純6-氰基-(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯，立體選擇性高，反應條件溫和，環境友好。
文檔編號C12N1/16GK102643757SQ20111045144
公開日2012年8月22日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者毛芳芳, 王亞軍, 鄭裕國, 魏積福 申請人:浙江工業大學