具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法、包含由其制造的具有導引器的移植用再 ...的制作方法
【專利摘要】本發明旨在提供一種移植用再生器官原基的制造方法，所述移植用再生器官可確保移植后與受體的連續性，且使移植操作容易進行。本發明提供了一種具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法，所述方法包括：通過使實質上由間葉細胞所構成的第1細胞集合體與實質上由上皮細胞所構成的第2細胞集合體緊密地接觸，并在支持體內部對這些細胞集合體進行培養，以制造再生器官原基的步驟；以及將所述導引器插入所述再生器官原基的步驟。
【專利說明】具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法、包含由其制造的具有導引器的移植用再生器官原基的組合物和具有導引器的移植用再生器官原基的移植方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種移植用器官原基的制造方法以及含有通過所述方法所制造的具有導引器的移植用再生器官原基的組合物、和具有導引器的移植用再生器官原基的移植方法，在使用再生器官原基的器官更換和再生醫療的技術中，其中，使再生器官原基與受體側的上皮組織適當地連接而發揮功能。
【背景技術】
[0002]再生醫療是將因各種疾病或外傷而變得功能不全的臟器或器官更換為再生的臟器或器官的技術，其有希望作為下一代醫療技術以對移植醫療進行補充(非專利文獻I)。在目前的再生醫療研究中，在干細胞移植療法方面已取得進展，該方法是在受傷的組織或部分功能障礙的器官移入干細胞或前體細胞而恢復其功能。
[0003]另外，在由單一種類細胞所構成的二維組織的再生方面，一種組織再生技術也已接近實際應用階段，在該技術中通過使用細胞片層技術將細胞培養成片層形式來對皮膚或角膜上皮細胞、心肌細胞等進行組織化。其中，通過使作為間葉細胞的成纖維細胞與皮膚表皮細胞分層化以人為地再現組織學上所適合的層狀構造，能夠使功能性的皮膚組織再生，該技術已臨床應用于重度燙傷的治療方面。
[0004]另一方面，已知的是，在器官中，多種功能細胞是呈三維配置的，以表現出獨特的功能。幾乎全部的器官都是通過胚胎期的上皮細胞與間葉細胞的相互作用所產生，從而展現特有的形態和器官功能。在目前的再生醫療技術中，難以將多種細胞以三維的形式進行配置，能夠在活體外立即發揮功能的再生器官構造目前還沒被開發出來。
[0005]最近，在如牙齒和唾液腺等上皮附屬器官、和如毛囊等皮膚附屬器官方面正在進行一種以器官再生為目標的研究，通過使器官原基再生而再現出發展的過程。這些器官不會直接關系到生命的維持，但已知它們會陷入器官喪失或功能不全的狀況。作為這樣的例子可列舉由齲齒、損傷或牙胚發育不全造成的牙齒的喪失、或者隨著老齡化而發生的唾液分泌障礙、男性型脫發癥或毛囊發育不良造成毛發的喪失等。這樣的器官喪失或功能不全會對QOL (生活品質)造成很大的影響，因此通過器官再生而進行的功能恢復受到很高的期待。特別是在牙齒的再生方面，已證實通過移植其中來自胚胎牙胚的上皮細胞與來自胚胎牙胚的間葉細胞以三維的方式進行適當的配置的再生牙胚、移植在活體內異位再生的再生牙齒單元和移植包含牙齒、牙槽骨和牙周膜的功能性單元而再生的功能性牙齒具有牙齒全部的生理功能(參照例如專利文獻I)。進一步，還有文獻證實，當將口腔內上皮細胞或其初代培養細胞用作上皮細胞時(參照例如專利文獻2)、當將來自羊膜的細胞用作間葉細胞時(參照例如專利文獻3)、或當將全能性干細胞分化誘導所得到的細胞用作間葉細胞時(參照例如專利文獻4)，能夠得到具有相似特征的細胞配置與方向性的再生牙胚或再生齒單元。[0006]根據這些研究成果，可以說，通過再生器官原基、或由再生器官原基所再生出的器官的移植所進行的功能性的器官再生有實現的可能性，使用再生器官原基的器官更換和再生醫療技術現正在尋找其它的上皮附屬器官。
[0007][文獻列表]
[0008][專利文獻]
[0009][專利文獻I]國際公開第2006/129672號小冊子
[0010][專利文獻2]日本特開2008-29756號公報
[0011][專利文獻3]日本特開2008-206500號公報
[0012][專利文獻4]日本特開2008-200033號公報
[0013][非專利文獻]
[0014][非專利文獻 I] Sharpe PT, Young CS.Test-tube teeth.Sc.Am.293, 34-41，2005
【發明內容】
[0015](本發明要解決的技術問題)
[0016] 眾所周知，毛囊或皮脂腺、淚腺、唾液腺等上皮性附屬器官，是在胚胎期的時候通過來自外胚層或來自內胚層的上皮細胞與來自中胚層或神經嵴的間葉細胞的相互作用而產生。
[0017]作為皮膚附屬器官，毛囊會在個體的整個生命期重復成長與退化(毛發周期)。已知在成長期的毛球部位的再生，是由與毛囊器官發生期時的相似的分子機理所誘導出來。另外還認為在這樣的毛周期中，毛球的再生是通過作為間葉細胞的毛乳頭細胞所誘導出來。此外，認為在成長期中，作為間葉細胞的毛乳頭細胞分化誘導毛囊上皮干細胞以再生出毛球。另外由于在隆突(bulge)區域及下方區域中，存在有來自神經嵴的干細胞的龕(niche),因此認為毛囊會保持住多個干細胞龕并發揮干細胞庫的功能。關于保持誘導毛囊形成的能力的毛乳頭細胞，已有文獻報道其培養法。盡管關于毛囊間葉細胞的干細胞龕，目前還沒有明確的報道，但從毛乳頭中含有能夠分化成為軟骨細胞、血細胞、脂肪細胞的細胞，以及由成體皮膚真皮組織能夠得到使毛囊及皮膚的真皮再生的SKIPs細胞這些現象看來，表明了毛囊間葉干細胞的存在。綜上所述，表明了通過來自成體的細胞來進行完整器官再生的可能性，而這在其他器官尚未實現，因此有希望對可臨床應用的毛囊再生技術進行實際應用。
[0018]為了建立滿足臨床應用的毛囊再生醫療技術，必須使再生毛囊具有正常的組織構造且具有適合于移植部位的毛干的毛發形成、伸長。進一步，期望通過毛囊所特有的干細胞龕進行的干細胞的維持與因為毛發周期而進行的毛囊的誘導能夠發生，以及期望毛囊具有附隨的皮脂腺或立毛肌、并且是功能性的，具有通過交感神經使毛發豎立的反應性。至目前為止，已進行了一些關于毛囊再生的嘗試，如通過取代間葉細胞(毛乳頭細胞及真皮毛根鞘細胞)以進行毛囊可變區域的再生、通過具有毛囊誘導能力的間葉細胞進行毛囊新生、通過上皮/間葉細胞進行毛囊的再構建等。其中，毛囊的再構建和毛囊原基的再生被認為是臟器更換和再生醫療的模型，最近證實:通過本發明的發明人開發出的器官原基法再構建的再生毛囊原基能夠模仿正常的發生以使毛囊與毛發再生。然而，能夠再生出在活體內具有完整功能的毛囊的、可臨床應用的毛囊再生模型，目前還沒有報道。[0019]作為皮膚附屬器官的毛發是由皮膚變化形成的，并且它是由兩種大致劃分的細胞群，即上皮細胞與間葉細胞的相互作用所形成的毛囊所產生。所以基本的策略是將這兩種細胞移植至目標皮膚區域，以使毛囊再生。在已報道的用于實現此基本策略的方法中，通過將培養的毛乳頭細胞與大鼠新生兒表皮細胞混合，并移植至通過將裸小鼠背部皮膚全層除去所形成的移植傷口的方法(植入物腔室(graft chamber)法),使包含毛囊的全部皮膚再生。但是在此方法中，為了使全部皮膚再生，必須形成很大的移植傷口，侵襲性非常高，因此難以將其作為一種醫療技術而廣泛實施。 [0020]另外還有文獻報道了另一種方法，在該方法中，同樣地將上皮細胞與間葉細胞混合并移植至皮下組織或腎被膜下，以使毛囊再生，然后將異位再生的毛囊再移植至皮內。在此方法中，根據基于現有的毛發移植技術的方法，可以將再生的毛囊移植至目標受體的皮膚內，然而需要其它的臟器或器官作為用于使毛囊再生的場所。另外已知的是，若將上皮細胞移植至皮下組織等時，會頻繁形成胞囊，這些胞囊會壓迫周邊組織，并隨著發炎會引起疼痛,因此該技術本身含有新的疾病風險。
[0021]為了解決上述問題，已有在先專利就器官原基法提出申請(專利文獻I)。此在先專利中提供了一種方法，通過該方法可由人工制造的微小器官原基來再生器官。在牙齒的再生方面，已顯示在口腔內，具有正常功能的再生牙齒可萌發自移植至頜骨內的再生牙齒原基。認為由于再生牙齒的生長而自動地進行萌發，再生牙齒的上皮細胞與口腔黏膜上皮沒有任何直接的連接。然而，在如毛囊般必須與皮膚表皮層連結的情況中，需要使毛發由再生的毛囊長出體表，如果毛發不能從所移植的毛囊生長，就會有形成胞囊的問題。
[0022]毛發、皮脂腺等皮膚附屬器官遍布于皮膚，并且大量地存在。尤其是毛發在特定部位大量存在，因此其具有審美和功能方面的價值。進一步，作為產生毛發的小器官，毛囊在皮膚內以適當的方向性透過毛孔與表皮層連接，而發揮使毛發(毛干)由體表生長出來的功能。
[0023]另外，在通過例如唾液腺或淚腺等具有導管的外分泌腺的移植而進行的再生技術中，只有使所移植的唾液腺或淚腺等與受體側的唾液等通過的導管進行正確地結合，才能夠使其發揮功能。然而，當移植具有導管的唾液腺等時，會因其無法與受體側的導管正確地結合，而產生其無法發揮功能的問題。
[0024]換而言之，可以理解為:當進行如毛囊或唾液腺等上皮附屬器官的再生時，使受體側的上皮組織與再生的器官以適當的方向性及形式進行連接，對于發揮再生的器官功能而言是極為重要的。
[0025][用于解決問題的方法]
[0026]如以上所述，為了使毛囊、皮脂腺、唾液腺、淚腺等上皮附屬器官再生，并且發揮既定功能，必須使多數的移植體與受體適當地連接。為了解決上述問題，本發明的發明人等經過仔細研究發現了一種上皮組織間連接形成法(inter-epithelial tissue-connectingplastic method)，在該方法中，通過器官原基法所再生出的器官原基與受體組織通過導引器進行連接。本發明的發明人等進一步發現，該方法能夠確保再生器官原基的極性方向和提升移植后與受體側的粘附性，并且能夠使再生的器官適當地與受體結合以功能性地再生。
[0027]亦即，本發明涉及具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法，其包括:通過使實質上由間葉細胞所構成的第I細胞集合體與實質上由上皮細胞所構成的第2細胞集合體緊密地接觸，并在支持體內部對這些細胞集合體進行培養，來制造再生器官原基的步驟，以及將所述導引器插入到所述再生器官原基的步驟。[0028]這里，在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，所述方法包括在插入所述導引器之后，進一步對所述再生器官原基進行多日培養的步驟。[0029]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，所述第I細胞集合體與所述第2細胞集合體中至少一方是來自作為再生對象的器官。[0030]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，所述第I細胞集合體和所述第2細胞集合體皆來自作為再生對象的器官。[0031]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，所述再生器官原基為上皮附屬器官原基。[0032]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，其中所述再生器官原基是選自由再生毛囊原基、再生汗腺原基、再生皮脂腺原基、再生唾液腺原基、再生乳腺原基、再生腎臟腎元原基、再生淚腺原基、和再生內分泌腺原基所組成的組中的任一種器官原基。[0033]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，所述再生器官原基為再生毛囊原基，所述上皮細胞是隆突區域上皮細胞或毛母基底部上皮細胞。[0034]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，所述再生器官原基為再生毛囊原基，所述間葉細胞為毛乳頭細胞或真皮毛根鞘細胞。[0035]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，所述再生器官原基為再生唾液腺原基，所述上皮細胞是來自唾液腺的上皮細胞，所述間葉細胞是來自唾液腺的間葉細胞。[0036]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，所述再生器官原基是再生淚腺原基，所述上皮細胞是來自淚腺的上皮細胞，和所述間葉系細胞是來自淚腺的間葉細胞。[0037]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，其中所述導引器是化學纖維。[0038]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，其中所述導引器是生物可吸收的。[0039]在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法的一個實施方案中，其中所述導引器是尼龍線。[0040]另外，根據本發明的另一個實施方案，本發明涉及包含具有導引器的移植用再生器官原基的組合物，其中所述具有導引器的移植用再生器官原基是由所述制造具有導引器的移植用再生器官原基的方法所制造。[0041]此外，根據本發明的另一個實施方案，本發明涉及移植用再生器官原基的移植方法，所述方法包括將具有導引器的移植用再生器官原基移植至對象的部位的步驟，其中所述具有導引器的移植用再生器官原基是用所述制造具有導引器的移植用再生器官原基的方法所制造。
[0042]這里，在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的移植方法的一個實施方案中，通過將所述導引器維持在突出于移植部位的狀態，使所移植的再生器官原基的上皮細胞側的部分與所述對象的上皮細胞沿著導引器伸長并連接。
[0043]另外，在本發明的具有導引器的移植用再生器官原基的移植方法的一個實施方案中，其中所述再生器官原基是以再生具有導管的器官為目的的器官原基，在移植所述再生器官原基時，將所述導引器插入存在于所述對象部位的導管內，使所述再生器官原基的上皮細胞側的部分與所述導管相連，使所述再生器官原基的上皮細胞側的部分沿著導引器伸長，并連接至所述對象部位的導管。
[0044](發明效果)
[0045]本發明能夠提供移植用再生器官原基，所述移植用再生器官原基在能夠確保所述再生器官原基的極性方向，以及在移植后相對于受體側的上皮組織維持適當的方向性的同時，還能夠提升粘附性。另外，由于本發明所制造出的移植用再生器官原基具有導引器，因此能夠簡化移植時的操作，并能夠容易地調整移植時的深度和移植的方向等。
[0046]另外，由于使再生器官原基的上皮細胞與受體側的上皮層(上皮細胞)沿著導引器進行連結，因此特別是在毛囊的形成過程中，能夠阻止由再生器官原基形成胞囊。另外，在如唾液腺等具有導管的外分泌腺等中，由于上皮細胞沿著所述導引器伸長，因此可提高與受體側的導管的連接效率。
[0047]進一步，根據本發明所制造出的再生器官原基，能夠適用于包括毛囊、汗腺、唾液腺等的上皮附屬器官，且并不限于體表的再生，也能夠適用于通過管腔構造連接至口腔內、腸道、或內分泌組織等內腔的器官的再生。由于本發明也能夠應用于這些器官和組織的再生，因此其提供了一種不僅能夠應用于皮膚附屬器官，而且還能夠應用于其他各種器官和組織的再生醫療的技術。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0048]圖1表示本發明的一個實施方案，是使用來自小鼠胚胎上皮的上皮細胞和來自小鼠胚胎上皮的間葉細胞而制造移植用再生毛囊原基的流程示意圖。
[0049]圖2表示將由來自小鼠胚胎上皮的上皮細胞與間葉細胞所制造的移植用再生毛囊原基移植至受體上皮后，在剛移植完的時候、第3天、及第10天的狀態。上排表示的是上皮的照片，下排表示將移植部位的切片進行HE (蘇木精-伊紅)染色，并用熒光顯微鏡進行觀察的結果。
[0050]圖3表示本發明的一個實施方案，是使用來自小鼠成體胡須的隆突區域上皮細胞和來自小鼠成體胡須的培養的乳頭細胞而制造移植用再生毛囊原基的流程示意圖。
[0051]圖4A表示在培養時，向再生毛囊原基插入導引器的狀態。圖4B表示再生毛囊原基剛移植完的時候的移植部位(箭頭所指示的)。圖4C表示移植后第21天的移植部位。
[0052]圖5表示通過來自小鼠成體胡須的再生毛囊原基的移植所再生的毛囊，將其組織切片進行HE染色的結果(上排)、及觀察再生毛囊組織切片中的GFP熒光的結果(下排)。
[0053]圖6a表示本發明的一個實施方案中，對來自小鼠成體胡須的移植用再生毛囊進行移植之后，通過光學顯微鏡拍攝所再生的再生胡須的剖面所得到的照片。圖6b表示通過，電子顯微鏡拍攝再生胡須的毛干表面所得到的照片。
[0054]圖7表示本發明的一個實施方案中，通過移植用再生毛囊的移植所生長成的小鼠再生胡須，在移植后第27天、第31天、第41天、及第46天的狀態。分別追蹤各個再生毛發(將有區別的再生毛發以箭頭和三角形標志表示)的生長。
[0055]圖8表示再生胡須的毛發周期的圖形，分別對第一次的毛發生長至第三次的毛發生長的各個成長期及退化期進行了舉例說明。此外，“對照組”表示將小鼠的天然胡須移植至裸小鼠背部，并使其再生長之后所追蹤到的3次毛周期的平均值。
[0056]圖9表示本發明的一個實施方案，是使用來自小鼠胚胎頜下腺上皮組織的上皮細胞和來自小鼠胚胎頜下腺間葉組織的間葉細胞而制造出的移植用再生唾液腺原基的流程示意圖。圖9中，將從所摘出的頜下腺原基分離出的上皮組織顯示在上排的照片中，將由頜下腺原基分離出的間葉組織顯示在下排的照片中。圖9中，在表示所制造出的再生唾液腺原基的照片中，E表示上皮細胞的細胞集合體，M表示間葉細胞的細胞集合體。此外，如圖9所示，從胎齡13.5天的小鼠胚胎可得到發育階段不同的頜下腺原基(初期、中期、后期)。
[0057]圖10表示在對從小鼠胚胎所摘出的頜下腺與使用來自小鼠胚胎頜下腺上皮組織的上皮細胞和來自小鼠胚胎頜下腺間葉組織的間葉細胞所制造出的移植用再生唾液腺原基進行器官培養時，通過光學顯微鏡拍攝所得到的描述唾液腺原基和再生唾液腺原基在各個時間(培養開始時、培養12小時后、培養24小時后、培養36小時后、培養48小時后、培養60小時后、培養72小時后)的照片。另外還顯示了將培養72小時后的再生唾液腺原基進行HE染色的結果。
[0058]圖11表示在 使用來自小鼠胚胎頜下腺上皮組織的上皮細胞和來自小鼠胚胎頜下腺間葉組織的間葉細胞所制造出的移植用再生唾液腺原基中插入生物可吸收性絲線作為導引器，進行60小時器官培養時，通過光學顯微鏡拍攝各時間經過時(培養12小時后，培養24小時后,培養36小時后,培養44小時后,培養60小時后)的再生唾液腺原基的狀態所得到的照片。另外，最下排的照片表示進行器官培養60小時后的再生唾液腺原基。其中，再生唾液腺原基的上皮細胞側開始沿著導引器絲線移動、伸長，而呈現導管狀的結構(箭頭所標記的部分)。
[0059]圖12表示將使用來自小鼠胚胎頜下腺上皮組織的上皮細胞和來自小鼠胚胎頜下腺間葉組織的間葉細胞所制造出具有導引器的移植用再生唾液腺原基，移植至成體小鼠的耳下腺導管部分時，各步驟(固定、耳下腺導管部的露出、耳下腺的摘出、膠體的固定、和縫合)的照片。另外，圖12中，el表示淚腺，ma表示嚼肌，p表示耳下腺，od表示脂肪組織，Pd表示耳下腺導管，RO表示再生頜下腺。
[0060]圖13上排表示對于使用來自小鼠胚胎頜下腺上皮組織的上皮細胞和來自小鼠胚胎頜下腺間葉組織的間葉細胞所制造出的具有導引器的移植用再生唾液腺原基，通過光學顯微鏡拍攝的即將要移植之前的狀態、及移植至其耳下腺被除去的成體小鼠的耳下腺導管部之后第34天的狀態所得到的照片。此外，在這些照片中，A表示從所移植的再生唾液腺原基所伸出的導管，B表示所移植的再生唾液腺原基，pd表示耳下腺。另外，圖13下方表示對于移植34天后的再生頜下腺進行HE染色的結果。此外，圖中的箭頭表示漿液性腺泡細胞樣的細胞。
[0061]圖14表示對于移植至成體小鼠之后第30天的再生唾液腺原基，從導管側將伊文思藍注入再生唾液腺原基時所拍攝的照片。另外，圖14中的A表示注入伊文思藍的部位，B表示再生頜下腺的移植部位。
[0062]圖15表示將唾液腺全部除去的唾液腺缺損小鼠，與將唾液腺全部除去之后，將本發明的具有導引器的再生唾液腺原基移植至頜下腺部位的小鼠之間就體重及生存率變化進行比較的圖形。
[0063]圖16表示本發明的一個實施方案，使用來自小鼠胚胎淚腺上皮組織的上皮細胞和來自小鼠胚胎淚腺間葉組織的間葉細胞來制造移植用再生淚腺原基的流程的示意圖。此外，左方的照片是在實體顯微鏡下拍攝的，顯示了從胎齡16.5-17.5天的小鼠胚胎所摘出的淚腺原基。另外在實體顯微鏡下拍攝的其它的照片顯示了從淚腺原基所分離出的上皮組織(中間欄上方的照片)、從淚腺原基所分離出的間葉組織(中間欄下方的照片)、與使其進行再構建的再生淚腺原基(右邊的照片)。
[0064]圖17表示在對從小鼠胚胎所摘出的淚腺原基與使用來自小鼠胚胎淚腺上皮組織的上皮細胞和來自小鼠胚胎淚腺間葉組織的間葉細胞所制造出的移植用再生淚腺原基進行器官培養時，通過光學顯微鏡拍攝各個時間(培養開始時、培養I天后，培養2天后，培養3天后，培養4天后)的淚腺原基和再生淚腺原基的狀態所得到的照片。
[0065]圖18表示使用來自小鼠胚胎淚腺上皮組織的上皮細胞和來自小鼠胚胎淚腺間葉組織的間葉細胞所制造出的具有導引器的移植用再生唾液腺原基，通過光學顯微鏡拍攝即將要移植之前的狀態、及移植至將淚腺的腺泡部分除去的成體小鼠的淚腺導管部之后第20天的狀態所得到的照片。此外，圖中的A表示所移植的再生唾液淚腺原基所粘附的部分，B表示眼睛的方向，dt表示淚腺的導管。
【具體實施方式】
[0066]以下針對本發明的實施方案進行詳細說明。
[0067]根據本發明所述制造方法的第一個實施方案，其是用于移植至哺乳動物(例如人類)的移植用再生器官原基的制造方法，所述方法包括:在培養時，將導引器插入通過對間葉細胞與上皮細胞進行器官培養所制造出的再生器官原基中。
[0068]本說明書中，“間葉細胞”是指來自間葉組織的細胞和對這樣的來自間葉組織的細胞進行培養所得到的細胞，“上皮細胞”是指來自上皮組織的細胞和對這樣的來自上皮組織的細胞進行培養所得到的細胞。
[0069]另外，在本說明書中，“上皮附屬器官”是指通過來自外胚層或來自內胚層的上皮細胞與來自中胚層或來自神經嵴的間葉細胞的相互作用所形成的器官，例如來自內胚層性上皮的器官、外胚層附屬器官、內分泌腺和通過導管與其他上皮組織連接的外分泌腺等器官。更具體地，“上皮附屬器官”是指例如毛囊、汗腺、淚腺、和皮脂腺等表皮附屬器官，以及通過管腔構造連接至口腔內、腸道、或內分泌組織等內腔的器官。
[0070]另外在本說明書中，“外胚層附屬器官”是指“上皮附屬器官”中來自外胚層的器官，如毛囊、汗腺、淚腺、皮脂腺等表皮附屬器官等。
[0071]接下來針對本發明的方法所使用的再生器官原基進行說明。
[0072]所述再生器官原基可以通過一種方法制造出來，該方法包括:使實質上由間葉細胞所構成的第I細胞集合體與實質上由上皮細胞所構成的第2細胞集合體緊密地接觸，并在支持體內部對這些細胞集合體進行培養的步驟。
[0073]“使實質上由間葉細胞所構成的第I細胞集合體與實質上由上皮細胞所構成的第2細胞集合體緊密地接觸，并在支持體內部對這些細胞集合體進行培養的步驟”記載在例如專利文獻I至4以及特開2008-29757號公報，將所有這些文獻的公開內容的全部以引用的方式并入本說明書中。
[0074]此外，在本說明書中，當通過上述方法制造出例如毛囊原基時，將所制造出的毛囊原基稱作“再生毛囊原基”。
[0075]所述第I細胞集合體與第2細胞集合體各自實質上僅由間葉細胞，或僅由上皮細胞所構成。在本發明中，“實質上僅由間葉細胞所構成”是指該細胞集合體與僅由間葉細胞所構成的細胞集合體發揮相同的功能。更適當地來說，是指所述細胞集合體除了包含作為間葉細胞的細胞外盡量不包含其他任何物質的狀態。另外，所述細胞集合體可以含有不同種類的細胞，只要它們是間葉細胞即可。“實質上僅由上皮細胞所構成”的情況也是同樣的。
[0076]這里，細胞集合體是指細胞緊密地接觸的狀態，所述細胞集合體可以是組織或由分散的細胞所制備的細胞凝集塊。使用組織是有利的，因為這樣可以容易地得到細胞配置和形狀正確的器官，但能獲得的量可能是有限的。制備細胞凝集塊時也可以使用培養的細胞，當使用培養細胞時相對較容易獲得細胞集合體，使得培養細胞至少在這點上是優選的。
[0077]優選地，本發明所使用的間葉細胞和上皮細胞，至少一方是來自作為再生對象的器官(包括屬于該器官的組織)。因此，使用已經定位于目標器官方向的細胞，能夠容易形成目標器官。另外，為了更可靠的制造目標器官，最優選的是，間葉細胞與上皮細胞都來自作為再生對象的器官。
[0078]作為本發明的對象的再生器官原基的一個范例可以是上皮附屬器官的器官原基，但本發明并不受其所限定，其它的例子還可以包括再生毛囊原基、再生汗腺原基、再生皮脂腺原基、再生唾液腺原基、再 生乳腺原基、再生腎臟腎元原基、再生淚腺原基和再生內分泌腺原基等。在制造這些再生器官原基時，可以使用來自對象器官的間葉細胞或上皮細胞，另外還可使用通過未分化細胞的誘導所得到的間葉細胞或上皮細胞。例如在制造再生毛囊原基時，間葉細胞可采用毛乳頭細胞、真皮毛根鞘細胞、發育期的皮膚間葉細胞、和由iPS細胞或ES細胞所誘導的毛囊間葉細胞，上皮細胞可采用隆突區域的外毛根鞘最外層細胞、毛母基底部的上皮細胞、和由iPS細胞或ES細胞所誘導的毛囊上皮細胞。另外，在制造再生汗腺原基時，間葉細胞可采用處于發育期的皮膚間葉細胞或毛囊的真皮團塊細胞、和由iPS細胞或ES細胞所誘導的皮膚間葉細胞，上皮細胞可采用處于發育期的皮膚上皮細胞和由iPS細胞或ES細胞所誘導的汗腺上皮細胞。另外，在制造再生唾液腺原基時，間葉細胞可采用處于發育期的唾液腺原基的間葉細胞或由iPS細胞或ES細胞所誘導的唾液腺間葉細胞，上皮細胞可采用唾液腺閏管部位的上皮細胞和由iPS細胞或ES細胞所誘導的唾液腺上皮細胞。另外，在制造再生淚腺原基時，間葉細胞可采用處于發育期的淚腺原基的間葉細胞或由iPS細胞或ES細胞所誘導的淚腺間葉細胞，上皮細胞可采用處于發育期的淚腺原基的上皮細胞和iPS細胞或ES細胞所誘導的淚腺上皮細胞。
[0079]另外，從細胞分化階段的幼年性與均質性的觀點看來，從中采集間葉細胞和上皮細胞的器官優選可以在正常的成體內保持再生能力。也可以使用通過人工手術操作、給藥、基因導入而具有再生能力的器官。[0080]作為除了來自再生對象的器官以外其他地方的間葉細胞，也可使用來自活體內的其他間葉組織的細胞。優選地，這樣的細胞為不含血細胞的骨髓細胞或間葉細胞，進一步優選地，為口腔內的間葉細胞或頜骨內部的骨髓細胞、來自顱神經嵴細胞的間葉細胞、可分化成這樣的間葉細胞的間葉前體細胞或其干細胞等。間葉細胞采用來自羊膜的細胞的例子被記載于專利文獻3，采用通過全能性干細胞分化誘導所得到的細胞的例子被記載于專利文獻4，將其全部的公開內容以引用方式并入本說明書。
[0081]作為除了來自再生對象的器官以外其他地方的上皮細胞，也可使用來自活體內的其他上皮組織的細胞。優選地，這樣的細胞為皮膚或口腔內的黏膜和齒齦的上皮細胞，進一步優選地，為未成熟的上皮前體細胞，例如能夠分化成角化或角化不全的上皮細胞的非角化上皮細胞或其干細胞，如皮膚或黏膜等。上皮細胞采用口腔內上皮細胞或其原代培養細胞的例子被記載于專利文獻2，在此將其全部的公開內容以引用方式并入本說明書中。此外，從利用自體組織的角度來說，優選的是使用來自移植對象的間葉細胞和上皮細胞或含有這些細胞的組織。
[0082]用于制造再生器官原基的間葉細胞和上皮細胞或包含這些細胞的組織，可以從如靈長類(例如人類、猴子等)、有蹄類(例如豬、牛、馬等)、小型哺乳類如嚙齒類(例如小鼠、大鼠、兔子等)等哺乳動物中進行采集、也可以從犬和貓等各種其它哺乳動物中進行收集。間葉細胞和上皮細胞或含有這些細胞的組織的收集，可直接使用通常收集組織所使用的條件，在無菌條件下提取并保存在合適的保存液即可。
[0083]再生對象的器官(包括屬于該器官的組織)的間葉細胞和上皮細胞的制備，可通過例如先將由周圍的組織分離出的器官(包括屬于該器官的組織)根據形狀分離成間葉組織及上皮組織來進行。此時為了促進分離可使用酶。作為所述酶，例如可以提及分散酶(Dispase)、膠原蛋白酶、胰蛋白酶等已知的酶，本領域技術人員可以選擇地使用適合的酶。
[0084]本發明中的細胞凝集塊是指來自間葉組織或上皮組織的細胞凝集所得之物，其可以通過凝集通過分散間葉組 織或上皮組織后所得到的細胞，或凝集由該細胞的原代或繼代培養所得到的細胞來制備。
[0085]為了使細胞分散，可以使用如分散酶、膠原蛋白酶、胰蛋白酶等酶。為了得到足夠的細胞數，在制備細胞凝集塊之前，對分散的細胞進行原代或繼代培養時，培養所使用的培養基可使用通常動物細胞培養所使用的培養基，例如達爾伯克氏改良伊格爾培養基(DMEM)等。為了促進細胞增殖可添加血清，或血清替代物，例如FGF、EGF、PDGF等細胞生長因子或轉鐵蛋白等已知的血清成分。此外，在添加血清時，可根據添加時的培養狀態而適當地改變濃度，而通常可設定為10%左右。細胞的培養可采用通常的培養條件，例如在溫度約為37°C, CO2濃度為5%的培養箱內進行培養。進一步，還可以適當地添加鏈霉素等抗生素。
[0086]為了使細胞凝集，例如可將細胞懸浮液進行離心處理。在間葉細胞與上皮細胞的細胞凝集塊中，為了確保二者在緊密地接觸時，細胞彼此確實發生相互作用，優選所述細胞各自為高密度的狀態。高密度的狀態是指具有與構成組織時相同密度的程度，例如為5X IO7個細胞/ml-1 X IO9個細胞/ml，優選的是I X IO8個細胞/ml-1 X IO9個細胞/ml，最優選的是2X IO8個細胞/ml-8X IO8個細胞/ml。獲得高密度的細胞凝集塊的方法并未受到特別限定，例如可以通過對細胞進行離心處理，然后使其凝集沉淀的方法來實現。優選的是進行離心處理，因為它不會損及細胞的活性，并且能夠容易地實現高密度。離心處理可以在提供300Xg-1200Xg的離心力的轉速下，優選的是在提供500Xg-1000Xg的離心力的轉速下進行3分鐘-10分鐘。在低于300Xg的離心處理中，會有無法使細胞密度達到足夠高的傾向，另一方面，在高于1200Xg的離心處理中，則細胞可能會受到損傷。
[0087]通過離心分離制備高密度細胞凝集塊時，通常先在用作細胞離心分離的試管等容器內配制好細胞懸浮液，然后再進行離心。離心分離之后，將細胞以沉淀物的形式留下，并將上清液盡量除去。此時，優選地，目標細胞以外的成分(例如培養液、緩沖液等)小于等于細胞的量，最優選的是不含目標細胞以外的成分。這樣的高密度的細胞集合體只要通過后述方法在支持載體內進行緊密地接觸，即可使細胞彼此緊密接觸并有效地發揮細胞間的相互作用。
[0088]所述支持載體并未受到特別限定，只要可以在其內部進行所述細胞培養即可。例如優選的是膠狀、纖維狀、固體狀的支持載體。通過使用該支持載體，可進一步防止對活體內再生器官原基造成過度的壓力。
[0089]本發明所使用的支持載體可以是例如膠原蛋白、瓊脂糖凝膠、羧甲基纖維素、明膠、瓊脂、水凝膠、Cell Matrix (商品名)、Mebiol Gel (商品名)、Matrigel (商品名)、彈性蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白、細胞外基質混合物、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA)等。其中，優選的是具有適當硬度和保持力的膠原蛋白、瓊脂糖凝膠、羧甲基纖維素、明膠、瓊脂、水凝膠、Ce 11 Matr i x、Meb i ο I Gel、Matr i ge 1、細胞外基質混合物、彈性蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白。
[0090]例如可使用液態的支持載體，于其中配置再生器官原基后再將其硬化。例如通過在培養皿上制備膠原蛋白凝膠液滴，并將所述再生器官原基置于所述膠原蛋白液滴內，然后在37 °C的CO2培養箱內進行培養，可使膠原蛋白凝膠化。
[0091]以培養第I和第2細胞集合體為目的所使用的支持載體，優選的是具有不使細胞分散，而能夠保持細胞集合體緊密接觸狀態的保持力。緊密接觸狀態是指上述高密度的間葉細胞和上皮細胞的細胞集合體，即使是在間葉細胞與上皮細胞的接觸面附近也維持相同程度的高密度的狀態。能夠保持緊密接觸狀態的支持載體，可以是例如在使用膠原蛋白時，通過使用最終濃度為2mg/ml-3mg/ml的膠原蛋白，來提供適當的硬度,亦即通過以JIS-K6503-1996為基準的方法(用12.7mm直徑的柱塞壓下4mm所需要的荷重來進行測定)測得的凝膠強度為120g-250g的濃度。其他種類的支持載體，只要通過同樣的評估方法測得具有相似的強度，也可作為本發明的支持載體優選使用。另外，通過將I種或多種支持載體混合，也可得到硬度相當于目標凝膠強度的支持載體。
[0092]將第I和第2細胞集合體配置于支持載體內的方法并未受到特別限定，當細胞集合體為細胞凝集塊時，例如 可將上述離心分離所得到的沉淀物用微量注射器等插入支持載體內進行配置。當細胞集合體為組織時，可使用注射器的針尖等將其配置于支持載體內的任意位置上。
[0093]在本發明中，使第I與第2細胞集合體在支持載體內緊密接觸地進行配置的方法并未受到特別限定。例如可通過先將其中一種細胞集合體配置于支持載體內，然后以對其按壓的方式配置另一種細胞集合體，從而使兩者緊密接觸(密著)。具體地，在支持載體中，通過適當地改變上述注射器的針尖位置，可以將其中一種細胞集合體按壓至另一種細胞集合體上。此外，當所述細胞集合體采用上皮組織或間葉組織時，優選地，通過使該組織在原本的器官(包括屬于該器官的組織)中分別與間葉組織或上皮組織接觸的面與另一方細胞集合體接觸的方式進行配置。
[0094]另外，優選的是，在配置所述細胞集合體后，包括固化支持載體的步驟。這樣能夠使細胞進一步凝集而達到更高密度的狀態。例如在使用膠原蛋白凝膠時，可通過在培養溫度下靜置數分鐘至數十分鐘進行固化。此時在細胞集合體內，細胞以外的成分越少，則越能夠實現高密度的狀態。 [0095]培養時間隨著配置于支持載體內部的細胞數、細胞集合體的狀態、培養的條件、動物種類等而有所不同，本領域技術人員可適當地進行選擇。另外培養時間還可根據作為再生對象的器官適當地進行調整。
[0096]通過延長培養時間，可進一步促進再生器官原基的形成。為了得到所希望的狀態，例如可進行6天以上、30天以上、50天以上、100天以上、或300天以上的培養，亦可在培養過程改變培養基或培養條件。
[0097]例如在移植再生毛囊原基時，為了得到功能性的毛發，對所述再生毛囊原基，優選地，培養至少I天，更優選地，培養2天以上。
[0098]在移植再生唾液腺原基或再生淚腺原基時，為了得到功能性的唾液腺或淚腺，對再生唾液腺原基或再生淚腺原基，優選地，培養至少I天，更優選地，培養2天以上。
[0099]對于在支持載體內部的培養步驟，可對內部包含第I和第2細胞集合體的支持載體單獨進行培養，也可在其他動物細胞等的存在下進行培養。
[0100]當單獨培養支持載體時，培養條件可以使用通常用于培養動物細胞的條件。另外，在培養中還可添加來自哺乳動物的血清，此外還可添加已知對于這些細胞的增殖或分化為有效的各種細胞因子。這樣的細胞因子的例子包括FGF、BMP等。
[0101]從對細胞集合體進行氣體交換或營養供給的角度來看，以及不與其它動物細胞接觸或混合、且全部的步驟都能夠在活體外進行這樣的角度來看，優選地，器官培養是在支持載體內部進行培養。器官培養一般是使多孔性的膜浮在適合使動物細胞增殖的培養基上，再將內含第I和第2細胞集合體的支持載體裝載在該膜上進行培養。此處所使用的多孔性的膜優選具有多個約0.3-5 μ m的孔,例如可以為Cell Culture Inserts (商品名)或Isopore Filter (商品名)。
[0102]按照上述方式由上皮細胞和間葉細胞構建再生器官原基之后，將導引器插入再生
器官原基。
[0103]本發明所使用的“導引器”并未受到特別限制，只要其能夠插入通過器官培養而構建的、培養中的再生器官原基，并在再生器官原基的移植后能夠促進再生器官原基的上皮細胞側部分與受體側的上皮細胞的連接即可。例如可以為由尼龍等聚合物或合成的或天然的生物可吸收的聚合物所制造出的纖維、不銹鋼等金屬纖維、碳纖維、玻璃纖維等化學纖維、以及天然的動物纖維或植物纖維等。更具體地，例如可以為尼龍線或不銹鋼線等。特別是當使用用于再生毛囊原基的導引器時，也可以使用來自活體的毛發作為導引器。另外，本發明所使用的導引器亦可以具有中空絲線的形狀。導引器的直徑和長度可以根據成為再生對象的器官進行適當的設計。例如對于用于再生毛囊原基的導引器，其直徑優選為5-100 μ m,更優選為20-50 μ m。另外對于用于再生毛囊原基的導引器，其長度優選為1-1Omm,更優選為 4_6mm。[0104]另外，如果移植時必須將所述導引器插入受體側的導管時，如在再生唾液腺原基中的情況，則所述導引器的直徑例如優選地為5 μ m-60 μ m,更優選地為20 μ m-40 μ m。另外，導引器的長度優選地為更優選地為2_-3_。進一步優選地,所述導引器的表面是光滑的從而能夠將它容易地插入導管，以及優選地，所述導引器保持不傷及組織的程度的硬度。作為這樣的導引器，單絲的材料優于如編織物等復絲材料。
[0105]所述導引器的插入，是以不破壞成為再生器官原基的細胞集合體的結構，特別是上皮細胞與間葉細胞的接觸面，且以垂直貫穿上皮細胞部分與間葉細胞部分的方式，從成為再生器官原基的細胞集合體的上皮細胞側插入。
[0106]另外，導引器可在器官培養開始后立即插入至成為再生器官原基的細胞塊，亦即將上皮細胞與間葉細胞的細胞集合體配置于培養基內之后立刻插入。另外，由于再生毛囊原基的上皮細胞的強度會因器官培養時的細胞粘附而增加，因此可以通過使用強度大的材料的導引器(例如使用不銹鋼線等)以及將導引器的前端變銳利等來增加穿透力，可在培養開始后第1-2天插入。優選地，在制造好器官原基后立即將導引器插入，因為這個時候能夠使用尼龍線等對活體造成的異物應答性低的柔韌材料。
[0107]另外，往再生器官原基插入導引器之后，可在插入導引器的狀態下培養再生器官原基。導引器插入后的培養時間，可根據作為再生對象的器官而適當地進行設定，例如在制造再生毛囊原基時，優選培養1-4天，更優選培養1.5-2天。此外，在導引器插入后，通過進行2天的培養，導引器與再生器官原基之間的粘附性變強，從而有助于防止在移植時容易發生的偏差。另外，優選地，在導引器插入后進行培養，因為這樣可以使上皮細胞側的再生器官原基沿著導引器伸長。在進行再生器官原基移植后，這樣的伸長能夠提高再生器官原基的上皮細胞側部分與受體的上皮細胞之間的自主接附的效率和穩定性。
[0108]另外根據本發明的另一個實施方案，通過本發明的制造方法所制造出的具有導引器的移植用再生器官原基，可以被移植至目標部位。
[0109]本領域技術人員可以通過已知的方法將插入了導引器的移植用再生器官原基移植至目標部位。例如在移植再生毛囊原基時，可采用使用ShapiiO毛發移植術或Choi式毛發移植設備的毛發移植，或利用空氣壓力的植入機等進行移植。Shapiro毛發移植術是一種在移植部位用微手術刀等制造出移植傷口之后，使用鑷子鉗進行移植的方法。在應用這種毛發移植術時，由于本發明所提供的移植用再生器官原基具有導引器，因此可以通過將導引器摘除，而不直接接觸再生毛囊原基來進行操作，所以能夠很容易地進行所述操作。
[0110]再生器官原基的移植深度，可根據作為再生對象的器官而適當地變更。例如在移植再生毛囊原基時，深度優選地為0.05-5mm，更優選地為0.1-lmm，最優選地為0.3-0.5mm。特別是在將再生毛囊原基移植至受體時，優選的是將其移植至真皮層內，更優選的是移植至真皮和皮下組織的交界面的上方，在該處毛囊的形成以及隨后的毛發生長效率更優異。另外，優選地，調節移植深度以使再生毛囊原基的上皮細胞部分的上端部露出于移植傷口的上端，因為這樣能夠提高與受體的上皮細胞的連續性。
[0111]另外，例如在進行需要將導引器插入受體側的導管的器官原基的移植時，例如在進行再生唾液腺原基的移植時，優選的是長久地保存受體側的導管，因為這樣可以防止導引器在移植后脫落。另外，從提升營養供給的角度來看，優選的是移植部位在大靜脈附近。這樣做時，如果長久地保存受體側的導管，則很容易調節移植部位。[0112]此外還可以在移植再生器官原基后，利用皮膚接合用的膠帶或帶子、縫合等將導引器固定到移植的對象部位，從而使所述導引器不會脫落。 [0113]移植再生器官原基之后，所述導引器在確保受體側的上皮細胞與來自再生器官原基的上皮細胞的一側的連續性一段時間后，可從移植部位抽除。抽除的時機可根據再生器官原基而進行適當的設定，例如在移植再生毛囊原基時，優選的是在移植后3天-7天從移植部位抽除。或者，也可以將導引器留下，從而使它自然地從移植部位脫落。可以將生物可吸收性材料的導引器留下以自然地從移植部位脫落，或可將其放置至直到其分解或被吸收。特別是在移植之后，當所述導引器與所述再生器官原基一起被埋入受體的皮下時，例如在再生唾液腺原基中的情況，優選的是使用生物可吸收的導引器。
[0114]用這樣的方式，通過對移植用的再生器官原基配備以導引器，可使來自再生器官原基的上皮細胞的細胞沿著所述導引器伸長。因此可提高移植后的受體側的上皮細胞與再生器官原基的上皮細胞側之間的連續性。特別是當所述導引器維持在移植部位的表皮的外側時，如在毛囊或汗腺中的情況，可進一步提高連續性，因為受體側的上皮細胞會沿著所述導引器而伸長至移植部位的內側，從而將異物排除。另外，優選的是插入導引器，因為這樣在培養時，在再生器官原基中，還可以提升上皮細胞和間葉細胞的極性維持。因此，可提高再生器官形成的效率，而且能夠促進移植時的方向的定位。特別是在將導引器用于再生毛囊原基時，在能夠確保再生毛囊原基與受體側的上皮細胞之間的連續性的前提下，可以向預期的方向促進毛囊的形成。結果可以提高再生毛囊原基的毛發生長率，而且還可控制毛發生長的方向。
[0115]此外，在本說明書中所使用的述語，是為了說明這里所描述的特定的實施方案，而并沒有試圖限制本發明。
[0116]另外，在本說明書之中所使用的“包含/包括/含有”這一術語，除了根據上下文應該作明顯不同的理解的情況以外，是指存在所記載的事項(部件、步驟、要素、數字等)，且不排除存在其它的事項(部件、步驟、要素、數字等)。
[0117]除非提供不同的定義，這里所使用的全部的術語(包括技術術語及科學術語)都與本發明所屬【技術領域】的技術人員所廣泛理解的意思是一樣的。這里所使用的術語，只要沒有明示出不同的定義，應解釋為與本說明書及相關【技術領域】中一致的意思，不應該被理想化，或者解釋為過度形式化的意思。
[0118]本發明的實施方案會有參照示意圖而同時說明的情形，在這種情況下，為了能清楚地進行說明，示意圖可能會被夸張地描繪。
[0119]使用第一、第二等術語是為了描述各種要素，應該理解這些要素并不被這些術語所限定。使用這些術語僅是為了將一種要素與其他要素區別開，例如由第一要素標識的要素也可以記作第二要素，同樣的，可將第二要素記作第一要素，這樣也未超出本發明的范圍。
[0120]以下參照實施例對于本發明進行更詳細的說明。然而，本發明可以通過各個方面而具體化，不應被理解為被限定于這里所記載的實施例。
[0121]實施例
[0122](1.再生毛囊的制造)
[0123]1.材料與方法[0124](I)實驗動物
[0125]從7-8 周齡的 C57BL/6 小鼠(日本 CLEA)和 C57BL/66_TgN (act-EGFP)小鼠中收集毛囊。另外，從胎齡18.0-18.5天的C57BL/66-TgN(act-EGFP)小鼠(SLC)收集含有體毛發原基的皮膚。此外，通過下述實驗方法，將所制造出的再生毛囊原基移植至6-8周齡的Balb/c nu/nu小鼠(SLC)。動物的飼養和實驗遵守相關法律、行政法規和規章，在東京理科大學動物實驗倫理委員會的批準下進行實施。
[0126](2)毛乳頭細胞的培養
[0127]通過頸椎脫白使C57BL/6的EGFP小鼠安樂死之后，以不傷及毛球部的方式收集頰部皮膚全層及皮下組織。在除去頰須周圍的皮下組織之后，將毛囊分離。選擇成長期為I~IV期的頰須毛囊，使用25G注射針從中去除膠原蛋白鞘，使毛囊露出。將毛球部分離以摘出毛乳頭。將所摘出的毛囊和毛乳頭保存在含有10%牛胎血清與1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養基(DMEMlO)中。將所分離的毛乳頭接種至3.5cm塑料培養皿(日本BectonDickinson公司)，在5%C02、37°C、濕度為95%的環境下，在含有10ng/ml的FGF2 (和光純藥公司)的DMEMlO中進行原代培養。在原代培養毛乳頭細胞的第4天和第8天更換培養基，在培養9天之后取用。將原代培養的毛乳頭細胞用PBS ( —)洗滌3次之后，用含有0.05%胰蛋白酶的IOmM EDTA溶液(GIBCO)進行剝離，并在DMEMlO中以胰蛋白酶中和，在充分洗滌之后，在冰溫下保存至使用時。
[0128](3)毛囊隆突上皮細胞的獲得
[0129]使用25G注射針將膠原蛋白鞘從所摘出的頰須組織去除，并將所述組織細分成隆突區域。在37°C使隆突區域組織在最終濃度4.8U/ml的分散酶II (Becton Dickson)和100U/ml的膠原蛋白酶(Worthington，Lakewood, NJ)溶液中反應4分鐘，然后使用25G注射針以外科方式將所述隆突區域組織分離成隆突區域上皮組織和隆突周圍的間葉組織。對于所分離出的隆突區域上皮組織在 培養箱用0.05%胰蛋白酶(Invitrogen, Carlsbad, US)進行I小時酶處理，并使其通過35 μ m孔的細胞過濾器，以獲得單一化的細胞。另外，(2)所得到的所培養的毛乳頭細胞也用0.05%胰蛋白酶(Invitrogen，Carlsbad, US)進行收集，然后通過35 μ m孔的細胞過濾器，以獲得單一化的細胞。
[0130](4)再生毛囊原基的制造與器官培養
[0131]再生毛囊原基是通過器官原基法而制造。詳細的步驟如下:分別將上述所獲得的來自隆突區域上皮組織的單一化的隆突區域細胞和培養的毛乳頭細胞，分別移至各個涂布有硅脂的1.5ml微型離心管(Eppendorf)，然后通過離心分離以沉淀的形式收集。使用0.5ml-20ml的GELoader Tip (Eppendorf)將離心后的培養液中的上清液完全除去。接下來，通過在涂布娃脂(Dow Corning Toray)的培養皿上滴入Cellmatrix type1-A(Nitta gelatin, Osaka, Japan) 30ml,來制造膠原蛋白凝膠液滴。使用0.1-1Oml的吸管尖頭(Quality Scientific plastics)將約0.2ml的上述制備出的培養毛乳頭細胞注入膠原蛋白凝膠液滴，來制造細胞凝集塊。接下來，使用0.1ml-1Oml的微量移液器(QualityScientific plastics)將約0.2ml的上述制備出的隆突區域上皮細胞注入到相同的膠體液滴內，從而使其與培養的毛乳頭細胞的凝集塊緊密接觸，以制造培養的毛乳頭細胞和隆突區域上皮細胞的細胞凝集塊。進一步在用實體顯微鏡進行確認的前提下，從培養的毛乳頭細胞與隆突區域上皮細胞的細胞凝集塊的隆突區域上皮細胞側，以不破壞細胞凝集塊的結構(特別是上皮細胞與間葉細胞的接觸面)，且以垂直貫穿培養毛乳頭細胞部分與隆突區域上皮細胞部分的接觸面的方式，插入全長5mm的尼龍線(松田醫科工業)，然后將所述凝膠液滴在37°C靜置5分鐘以使其固化，從而使上皮細胞與間葉細胞的結合更加堅固，以制造具有導引器的再生毛囊原基。
[0132](5)胚胎皮膚上皮細胞和間葉細胞的獲得
[0133]從胎齡18.0-18.5天的EGFP小鼠胚胎收集背部皮膚，基于Nakao等所報道的方法(Nakao K et al.，Nat.Methods, 4 (3)，227-30，2007)，對其進行部分地改變，通過在 4°C 以55rpm振蕩條件進行I小時的分散酶處理，使上皮層與真皮層分離。進一步在37°C用100單位/ml的膠原蛋白酶I對真皮層進行兩次40分鐘的處理，然后進行單一化處理，以獲得間葉細胞。另外，在37°C用100單位/ml的膠原蛋白酶I對上皮層進行兩次40分鐘的處理，然后將混入其中的間葉細胞除去，進一步用含有100單位/ml的膠原蛋白酶I的0.25%胰蛋白酶溶液，在37°C進行處理10分鐘，然后進行單一化處理，以獲得上皮細胞。
[0134]另外，通過與以上(4)中所記載的相同的方法，來制造具有導引器的胚胎皮膚間葉細胞和胚胎皮膚上皮細胞的細胞凝集塊，在該方法中用胚胎皮膚間葉細胞代替培養的毛乳頭細胞而注入膠原蛋白凝膠液滴中，然后用胚胎皮膚上皮細胞代替隆突區域細胞注入膠原蛋白凝膠液滴中，從而使其與胚胎皮膚間葉細胞塊緊密接觸。
[0135]將在膠體中制造出的上皮細胞與間葉細胞的細胞凝集塊，連同膠原蛋白凝膠一起移至 0.4ml 孔大小的 Cell Culture Insert (Becton Dickinson 公司)上，該 Cell CultureInsert設置有6孔板(Becton Dickinson公司),將Iml DMEM10加入該6孔板中，然后在37°C、5%C02和95%的濕度條件下進行2天的器官培養，以制造再生毛囊原基。
[0136](6)再生毛囊原基的裸小鼠皮內移植
[0137]將由胚胎皮膚上皮細胞和間葉細胞所制造的再生毛囊原基，以及由來自成體胡須的隆突區域上皮細胞和培養的毛乳頭細胞所制造的再生毛囊原基，以下述的方式移植至裸小鼠的皮內。
[0138]依照常規的方法對裸小鼠進行戊巴比妥麻醉，對背部進行聚碘(isodine)消毒之后，使其成自然橫躺的姿勢。使用V字矛型微手術刀(日本Alcon)對小鼠進行穿刺，以形成由皮膚表皮層至真皮層下層部的移植傷口。移植傷口在垂直方向從體表面伸至約400 μ m的深度，在水平方向為約1_。從插入了由尼龍線制造的導引器(相當于8-0尼龍縫合線，長度約5mm)的再生毛囊原基將膠原蛋白凝膠除去，以上皮細胞成分朝向移植傷口的體表側的方式，使用銳利的5號小鑷子(夏目制作所)將再生毛囊原基插入。調節移植深度，以使再生毛囊原基的上皮細胞成分的上端部露出移植傷口上端部，并以使由尼龍線制造的導引器露出體表的方式放置再生毛囊原基。用以免縫膠帶(Steritest Strip;3M)將尼龍線導引器固定在接近移植傷口的皮膚表面，然后用保護洋創膏(Nurseban)和手術膠帶(SurgicalTape) (3M)保護移植傷口。在移植后5_7天將保護膠帶除去，而尼龍線制導引器被留在移植部位，若尼龍線在I天后還殘留著，則將其除去。以肉眼或熒光實體顯微鏡確定移植體的植入后，觀察移植位點隨時間的變化。
[0139](7)毛發生長過程的觀察和組織學的分析
[0140]用肉眼和熒光實體顯微鏡觀察再生毛囊原基的移植部位，并評估毛發生長狀況。在毛發開始生長后，通過定期拍攝照片，對毛發生長與退化進行評估。將所摘取到的組織用MildformlON(和光純藥)固定之后，依照常規方法通過石蠟包埋塊或凍結制成塊。制造出連續切片，并通過HE染色或Hoechst熒光核染色，進行組織學的分析。
[0141]2.結果
[0142](I)通過再生毛囊原基的皮內移植而進行的毛發生長
[0143]為了分析移植至皮內的再生毛囊原基的移植位置，由胎齡18.5天的小鼠皮膚細胞制造出再生毛囊原基，并移植至裸小鼠皮膚內。在移植后將皮膚摘出，制造其石蠟切片并進行HE染色。結果確定了移植位置在皮膚真皮層內，由體表算起的深度平均為393 μ m。將剛移植完的、移植后第3天、和第10天的結果顯示于圖2中。如圖2所示，在將再生毛囊原基移植至皮膚內時，在導引器突出體表的狀態下將導引器進行固定(O天上排的照片，箭頭表示導引器)。另外在移植時，再生毛囊原基與受體上皮并未連接(圖2中，O天下方的HE染色后的切片照片)。到移植后第3天，再生毛囊原基的上皮成分與受體皮膚表皮層通過導引器而連接(圖2中3天下方的HE染色后的切片照片，箭頭表示連接的部分)。到移植后第10天再生出毛囊，在平均第14天再生的毛發開始從體表生長(圖2中，10天)，其毛發生長頻率為90%。
[0144]另外，以與上述相同移植深度的方式將來自成體頰須的再生毛囊原基移植至裸小鼠背部，將結果顯示于圖4。圖4A表示向再生毛囊原基插入導引器的照片，E表示來自隆突區域上皮細胞的部分，DP表示來自培養的毛乳頭細胞的部分，G表示導引器。圖4B表示以熒光實體顯微鏡追蹤移植部位的照片。在移植來自成體頰須的再生毛囊原基后，在平均第21天再生的毛發開始從體表生長(圖4C)，其毛發生長頻率為74%。
[0145](2)再生毛囊的組織分析
[0146]摘取再生的毛囊并且進行組織分析。將結果表示于圖5。照片中間欄和右欄是將左方的低倍放大顯微鏡像中的方形框部分放大的結果。利用GFP熒光將再生毛囊從周圍的裸小鼠毛囊中識別出來(圖5左 下方的照片)。將再生出的毛囊的上皮組織連接至受體皮膚表皮層，在連結部分的表皮基底層主要是來自受體的細胞。另外在再生毛發上部的放大照片中，確認了皮脂腺的再生(在圖5中間欄的上下的照片中標記箭頭的部分)。來自再生毛囊原基的皮脂腺與來自受體細胞的皮脂腺混合存在著，但再生毛囊的皮脂腺下方的皮脂腺是來自所移植的再生毛囊原基。此外，圖5右側的照片表示毛球部，而在右下的照片中，由于可確認出在毛乳頭(DP)部位的GFP熒光，因此證明了毛乳頭是來自所移植的再生毛囊原基。以這種方式，再生毛囊表現出了組織學上正常的毛囊結構，另外，來自成體頰須的再生毛囊明顯比體毛大。
[0147](3)再生毛干的分析
[0148]來自胚胎體毛的再生毛發100%為黑色毛發，來自成體頰須的再生毛發95.5%為白色毛發。圖6表示通過光學顯微鏡及掃描式電子顯微鏡進行觀察所得到的照片。在虛線部內觀察到以胡須般的硬毛為特征的螺旋狀毛干髓質(M)(圖6a)，并且觀察到與正常的頰須相似的表皮構造(圖6b)。以這種方式，再生胡須呈現了與天然毛發同等的毛干髓質和皮質，并且還呈現出明顯的胡須狀結構。
[0149](4)再生毛發的毛發周期
[0150]追蹤再生胡須的毛干成長與退化的結果，毛干隨著毛發周期的進行而退化，并從脫毛的毛孔部位成長出新的毛干(圖7)。另外，此毛發周期的持續時間與天然胡須的毛發周期是同等的，并未觀察到顯著差異(圖8)。由此結果可知，再生毛發即使經過了毛周期，也會與受體表皮層保持連結，以重復毛發的成長與退化。
[0151](I1.再生唾液腺的制造)
[0152](I)再生唾液腺原基的制造和器官培養
[0153]以唾液腺的再生為目的，使用器官原基法進行唾液腺原基的制造。
[0154]從胎齡13.5-14.5天的C57BL/6小鼠胚胎，以外科方式將頜下腺原基摘出。在25°C，使所摘出的頜下腺原基在最終濃度為50U/ml的分散酶II (Becton Dickson)溶液中反應1.5分鐘，然后使用25G注射針將頜下腺原基分離成頜下腺上皮組織與頜下腺間葉組織。進一步對于間葉組織以最終濃度50U/ml的膠原蛋白酶(Worthington, Lakewood, NJ)溶液與最終濃度0.25%的胰蛋白酶(Invitrogen，Carlsbad, US)溶液在37°C溫浴進行10分鐘酶處理，并使其通過22 μ孔的細胞過濾器，以獲得完全單一化的間葉細胞。對于上皮組織以最終濃度為100U/ml的膠原蛋白酶(Worthington，Lakewood，NJ)溶液在37°C溫浴進行15分鐘酶處理兩次之后，以最終濃度0.25%的胰蛋白酶(Invitrogen, Carlsbad, US)溶液在37°C溫浴進行5分鐘酶處理，并使其通過22 μ孔的細胞過濾器，以獲得完全單一化的上皮細胞。
[0155]使用所得到的上皮細胞和間葉細胞，通過器官原基法，在膠原蛋白凝膠中制造出再生唾液腺原基(圖9)。詳細的步驟如下:分別將所取得的單一化上皮細胞與單一化的間葉細胞，移至各個涂布有硅脂的1.5ml微型離心管(Eppendorf)，并進行離心分離。使用0.5ml-20ml的GELoader Tip (Eppendorf)將離心分離后的培養液中的上清液完全地除去，以沉淀的形式，分別收集單一化的上皮細胞和單一化的間葉細胞。接下來，通過在涂布娃脂(Toray Do w Corning)的培養皿上滴入Cellmatrix type 1-A(Nittagelatin, Osaka, Japan) 30 μ I,來制造膠原蛋白凝膠液滴，使用0.1-1Oml的吸管尖頭(Quality Scientific plastics)注入上述所制備出的單一化間葉細胞0.3 μ I左右,而制造出細胞凝集塊。接下來，使用0.1ml-1Oml的微量移液器(Quality Scientific plastics)將約0.2μ I的上述制備出的單一化上皮細胞注入到相同的膠體液滴內，從而使其與間葉細胞的凝集塊緊密接觸以制造出來自頜下腺原基的上皮細胞與間葉細胞的細胞凝集塊。
[0156]將在膠體中所制造出的來自頜下腺原基的上皮細胞與間葉細胞的細胞凝集塊，連同膠原蛋白凝膠一起移至0.4ml孔大小的Cell Culture Insert (Becton Dickinson公司)上，該 Cell Culture Insert 設置有 6 孔板(Becton Dickinson 公司)，將 Iml DMEMlO 加入該6孔板中，然后在37°C、5%C02和95%的濕度條件下進行器官培養，以制造再生唾液腺原基。
[0157]在再生唾液腺原基進行器官培養時，從培養開始至24小時后，觀察到上皮細胞開始陷入間葉細胞側的現象(圖10)。此外，圖10上方的兩排照片表示以從小鼠胚胎摘出的頜下腺，在直接以摘出之后的狀態下進行器官培養時，在各個經過時間的狀態，圖10下方的兩排照片表示通過用器官原基法所構建的再生唾液腺原基進行器官培養時，在各個經過時間的狀態。通過蘇木精一伊紅染色(HE染色)進行分析，在由培養開始72小時后，觀察到陷入的上皮組織前端呈現分支的現象(圖10)。
[0158]上述的結果證明了，通過使用器官原基法可以制造再生唾液腺原基。
[0159]此外，如圖9所示，由胎齡13.5天的小鼠胚胎可得到發育階段不同的頜下腺原基(參照圖9中的所述初期、中期、后期的照片)，通過上述方法可以由每個發育階段中的頜下腺原基制造出由上皮細胞和間葉細胞再構建的再生唾液腺原基。
[0160](2)附有導引器絲線的再生唾液腺原基的制造
[0161]在以實體顯微鏡進行確認的前提之下，對于上述(I)方法所制造出的再生唾液腺原基，以不破壞再生唾液腺原基的結構(特別是上皮細胞與間葉細胞的接觸面)，并且垂直貫穿上皮細胞部分與間葉細胞部分的接觸面的方式，從上皮細胞側插入全長約3mm的生物可吸收的絲線(GUNZE公司制造)。插入導引器之后，對再生唾液腺原基進行60小時器官培養。
[0162]結果，從器官培養開始大約經過24小時后，觀察到再生唾液腺原基的上皮細胞側開始沿著導引器絲線移動、伸長，在由培養開始的60小時后，觀察到呈現導管狀的結構的現象(圖11 ;最下方的照片中的箭頭表示導管狀的構造)。
[0163](3)再生唾液腺原基向耳下腺導管部的移植
[0164]以外科方式將成體小鼠的耳下腺的腺泡部分除去，使連接至耳下腺的導管部分露出。接下來，將上述(2)方法所制造出的、并進行器官培養2天的具有導引器的再生唾液腺原基，與膠原蛋白凝膠一起移植至耳下腺導管部。移植時，調整導引器絲線的位置，以使導管的切斷面與再生唾液腺原基之上皮組織彼此接近，并將導引器插入到受體側的耳下腺導管。另外，以8-0尼龍縫合線(Bear Medic公司，千葉，日本)將含有再生唾液腺原基的膠原蛋白凝膠與嚼肌縫合(圖12)，以使所移植的再生唾液腺原基不能移動。
[0165]對移植后第30天的再生唾液腺原基，通過HE染色進行組織學的評估。從HE染色圖片看來，在再生唾液腺原基中，觀察到導管細胞或漿液性腺泡細胞樣的細胞與天然的頜下腺中的一樣(圖13 ;圖13下方的照片中，箭頭表示漿液性腺泡細胞樣細胞)。
[0166]用這樣的方式，可通過再生器官原基法再構建出唾液腺。另外，即使是來自頜下腺的再生唾液腺原基，也可在另一個唾液腺的耳下腺部位再構建出頜下腺。
[0167](4)再生唾液腺的唾液分泌路徑的評估
[0168]為了明確來自頜下腺的再生唾液腺原基與成體小鼠的耳下腺導管結合，并保留唾液分泌路徑，在再生唾液腺原基移植后第30天，通過外科方法，使移植部位和耳下腺導管露出，通過微注射，從比再生唾液腺原基的移植部位更向口腔側的導管，向再生唾液腺原基注入伊文思藍溶液。
[0169]結果，在用實體顯微鏡進行觀察時，觀察到所注入的伊文思藍溶液通過耳下腺導管而流入所移植的再生唾液腺原基的現象(圖14)。由此表明了再生唾液腺與耳下腺導管的結合并保留了唾液的分泌路徑。
[0170]另外，將唾液腺全部除去的唾液腺缺損小鼠、與將唾液腺全部除去然后將具有導引器的再生唾液腺原基移植至頜下腺部位的小鼠(移植小鼠)的體重和生存率變化進行比較，其結果顯示，唾液腺缺損小鼠從唾液腺摘出日開始體重每天持續地減少，然而移植小鼠在移植后約第3或4天開始，體重漸漸恢復，在約第6天幾乎恢復至正常的體重(圖15)。另外，唾液腺缺損小鼠在從唾液腺摘出日后的第4天以后生存率為20%以下，然而，移植小鼠在從移植日后的第4天以后表現出約70%的生存率(圖15)。
[0171](II1.再生淚腺的制造)
[0172](I)再生淚腺原基的制造和器官培養[0173]以淚腺的再生為目的，使用器官原基法，以如下述的方式進行再生淚腺原基的制
造。
[0174]從胎齡16.5-17.5天的C57BL/6小鼠胚胎，以外科方式將淚腺原基摘出。在25°C，使所摘出的淚腺原基在最終濃度為50U/ml的分散酶II (Becton Dickson)溶液中反應1.5分鐘，然后使用25G注射針將淚腺原基分離成淚腺上皮組織與淚腺間葉組織。進一步將間葉組織以最終濃度50U/ml的膠原蛋白酶(Worthington，Lakewood，NJ)溶液與最終濃度0.25%的胰蛋白酶(Invitrogen, Carlsbad, US)溶液，在37°C溫浴中進行10分鐘酶處理，并使其通過22 μ孔的細胞過濾器，以獲得完全單一化的間葉細胞。對于上皮組織以最終濃度100U/ml的膠原蛋白酶(Worthington, Lakewood, NJ)溶液,在37°C溫浴進行15分鐘酶處理兩次之后，以最終濃度0.25%的胰蛋白酶(Invitrogen，Carlsbad, US)溶液在37°C溫浴進行5分鐘酶處理，通過22 μ孔的細胞過濾器，以取得經過完全單一化的上皮細胞。
[0175]使用所得到的上皮細胞和間葉細胞，通過器官原基法，在膠原蛋白凝膠中制造出再生淚腺原基。詳細的步驟如下:分別將所取得的單一化上皮細胞與單一化間葉細胞移至各個涂布有娃脂的1.5ml微型離心管(Eppendorf),并進行離心分離。使用GELoaderTip0.5-20ml (Eppendorf)將離心分離后的培養液中的上清液完全除去，以沉淀的形式，分別回收單一化的上皮細胞和單一化的間葉細胞。接下來，在涂布有娃脂(Toray DowCorning)的培養皿上滴入 Cellmatrix type 1-A(Nitta gelatin, Osaka, Japan) 30 μ I,來制造膠原蛋白凝膠液滴，使用0.1-1Oml的微量移液器(Quality Scientific plastics)將約0.3μ I的上述所制備出的單一化的間葉細胞注入膠原蛋白凝膠液滴，來制造細胞凝集塊。接下來，使用 0.1ml-1Oml 的微量移液器(Quality Scientific plastics)將約 0.2 μ I的上述制備出的單一化的上皮細胞注入到相同的膠體液滴內，從而使其與間葉細胞的凝集塊緊密接觸，從而制造出來自淚腺原基的上皮細胞和間葉細胞的細胞凝集塊(圖16)。
[0176]將在膠體中所制造出的來自淚腺原基的上皮細胞與來自淚腺原基的間葉細胞的細胞凝集塊，連同膠原蛋白凝膠一起移至0.4ml孔大小的CellCulture Insert (BectonDickinson 公司)上，該 Cell Culture Insert 設置有 6 孔板(Becton Dickinson 公司)，將Iml DMEMlO加入該6孔板中，然后在37°C、5%C02和95%的濕度條件下進行2天的器官培養，以制造再生淚腺原基。
[0177]在再生淚腺原基進行器官培養時，觀察到與從胚胎所摘出的淚腺原基一樣，在培養開始24小時后上皮細胞開始陷入間葉細胞側(圖17)。由此結果證明了可以通過使用器官原基法來制造再生淚腺。
[0178](2)附有導引器絲線的再生淚腺原基的制造與移植
[0179]在以實體顯微鏡進行確認的前提下，對于上述(I)之方法所制造出的再生淚腺原基，從上皮細胞側，以不破壞再生生淚腺原基的結構(特別是上皮細胞與間葉細胞的接觸面)，并且垂直貫穿上皮細胞部分與間葉細胞部分的接觸面的方式，插入全長約3mm的生物可吸收性絲線(GUNZE公司制)。導引器插入后，對再生淚腺原基進行2天的器官培養。
[0180]在進行器官培養之后，將成體小鼠淚腺的腺泡部分除去，使導管部分露出，用與移植再生唾液腺原基時的相同的方法，將再生淚腺原基移植至淚腺導管部。
[0181]結果，對移植20天后的再生淚腺原基進行確認時，觀察到其已經粘附到移植部位，并有明顯的生長的現象(圖18)。另外，通過目視確認了天然淚腺導管與再生淚腺原基連接在一起。
[0182]如以上進行的詳細說明，根據本申請發明所得到的具有導引器的再生器官原基會與受體側的上皮細胞進行可靠的連接，在移植后成為具有功能的再生器官。特別是在再生毛囊原基方面，清楚地表明了能夠以高頻率從體表進行毛發生長。在整個毛發周期，再生毛囊始終通過毛孔與受體表皮層保持連續性，并且觀察到在相同位置進行重復的毛發生長。另外，附有導引器的再生毛囊原基的移植技術極為簡便，且具有廣泛的應用。另外在具有導管的再生器官方面，再生器官原基的來自上皮細胞的部分可以在移植至受體之后，與受體側的導管彼此進行穩定的結合，并且清楚地表明器官能夠通過導管而發揮功能。
[0183]由于能夠提供以上的效果，通過本發明所制造出的移植用再生器官原基能夠提供新的器官更換和再生的醫 療技術，這些技術能夠廣泛應用于醫療行業領域。
【權利要求】
1.具有導引器的移植用再生器官原基的制造方法，所述方法包括:通過使實質上由間葉細胞所構成的第I細胞集合體、與實質上由上皮細胞所構成的第2細胞集合體緊密接觸，并在支持體內部對所述細胞集合體進行培養，以制造再生器官原基的步驟；以及將所述導引器插入到所述再生器官原基的步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述方法進一步包括在插入所述導引器之后，對所述再生器官原基進行多日培養的步驟。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述第I細胞集合體與所述第2細胞集合體中至少一方是來自作為再生對象的器官。
4.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述第I細胞集合體與所述第2細胞集合體都來自作為再生對象的器官。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述再生器官原基為上皮附屬器官原基。
6.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述再生器官原基是選自由再生毛囊原基、再生汗腺原基、再生皮脂腺原基、再生唾液腺原基、再生乳腺原基、再生腎臟腎元原基、再生淚腺原基和再生內分泌腺原基所組成的組中的任一種器官原基。
7.如權利要求6所述的方法，其中，所述再生器官原基為再生毛囊原基，且所述上皮細胞為隆突區域上皮細胞或 毛母基底部上皮細胞。
8.如權利要求6或7所述的方法，其中所述再生器官原基為再生毛囊原基，且所述間葉細胞為毛乳頭細胞或真皮毛根鞘細胞。
9.如權利要求6所述的方法，其中，所述再生器官原基為再生唾液腺原基，且所述上皮細胞為來自唾液腺的上皮細胞，以及所述間葉細胞為來自唾液腺的間葉細胞。
10.如權利要求6所述的方法，其中，所述再生器官原基為再生淚腺原基，且所述上皮細胞為來自淚腺的上皮細胞，所述間葉細胞為來自淚腺的間葉細胞。
11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述導引器為化學纖維。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述導引器是生物可吸收的。
13.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述導引器為尼龍線。
14.包含具有導引器的移植用再生器官原基的組合物，所述具有導引器的移植用再生器官原基由權利要求1-13中任一項所述的方法所制造。
15.具有導引器的移植用再生器官原基的移植方法，所述方法包括將由權利要求1-13中任一項所述的方法所制造的具有導引器的移植用再生器官原基移植至對象的部位的步驟。
16.如權利要求15所述的具有導引器的移植用再生器官原基的移植方法，其中，通過將所述導引器維持在突出于移植部位的狀態，使所移植的再生器官原基的上皮細胞側的部分與所述對象的上皮細胞沿著所述導引器伸長并連接。
17.如權利要求15所述的具有導引器的移植用再生器官原基的移植方法，其中，所述再生器官原基是以再生具有導管的器官為目的的器官原基，在移植所述再生器官原基時，將所述導引器插入存在于所述對象部位的導管內，使所述再生器官原基的上皮細胞側的部分與所述導管相連，使所述再生器官原基的上皮細胞側的部分沿著所述導引器 伸長，并連接至所述對象部位的導管。
【文檔編號】C12N5/071GK103476925SQ201180066942
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2011年7月27日 優先權日:2011年2月9日
【發明者】豊島公榮, 辻孝 申請人:株式會社器官再生工學