植物細胞中草甘膦抗性編碼核酸分子的優化表達的制作方法
【專利摘要】提供了一種可提供對草甘膦的抗性的編碼5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶（EPSPS）的核酸分子，所述核酸分子已被優化用于在單子葉植物和雙子葉植物中尤其是在大豆中表達。還提供了使用方法。
【專利說明】植物細胞中草甘膦抗性編碼核酸分子的優化表達
[0001]相關申請的引用
[0002]本申請要求先前提交的共同未決臨時申請USSN61/419，703的優先權，所述臨時申請的內容以引用的方式全文納入本文。
[0003]序列表
[0004]本申請包括已通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并特此以引用的方式全文納入本文。所述ASCII復本，創建于2011年11月22日，名稱為210007PCT.txt，大小為26，865 字節。
【背景技術】
[0005]草甘膦(N-膦酰甲基甘氨酸)是除草劑中廣泛使用的組分。草甘膦抑制5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP合酶或EPSPS)。5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶參與植物細胞中芳香族氨基酸的合成。抑制EPSPS可有效地破壞蛋白質合成，從而殺死受影響的植物細胞。因為草甘膦是非選擇性的，它既殺死雜草又殺死農作物。因此，改進農作物使其抗草甘膦以使得所需的植物在暴露于草甘膦后繼續存活對農作物是有用的。
[0006]重組DNA技術已被用于分離抗草甘膦的突變型EPSP合酶。可將這種抗草甘膦的突變型EPSP合酶轉化到植物中并將草甘膦抗性賦予轉化的植物。作為實例，如美國專利5, 633, 435所述,從土壤桿菌屬(Agrobacterium)菌株CP4中分離出了耐草甘膦基因。全長玉米EPSPS基因在美國專利7，045，684中描述。其進入至葉綠體并切割葉綠體轉運肽，生成成熟 EPSPS。參見 Herouet-Guicheney et al.(2009) “Safety evaluation of thedouble mutant5-enolypyruvylshikimate-3-phosphate synthase (2mEPSPS)from maizethat confers tolerance to glyphosate herbicide in transgenic pIants^RegulatoryToxicology and Pharmacology, Vol.54，Issue2, ppl43_153。該參考文獻和引用的全部參考文獻均以引用的方式納入本文。
[0007]已經通過引入突變產生了其他耐草甘膦基因。這些基因包括由Comai分離且在美國專利5，094，945,4, 769，061和4，535，060中描述的基因。如5，310，667所述，已通過將80位和120位之間的甘氨酸殘基置換為丙氨酸殘基而使用單突變體。雙重突變體也在美國專利6，225，114和5，866，775描述，其中除了上述突變以外，將第二突變(蘇氨酸殘基置換在170位和210位之間的丙氨酸殘基)引入至野生型EPSPS基因中。
[0008]其他工作通過引入攜帶位于以下位置的突變的修飾的玉米EPSPS基因產生了雙重突變型EPSPS玉米:由GenBank登記號X63374的序列編碼的氨基酸序列中的102位殘基(從蘇氨酸變為異亮氨酸)和106位殘基(從脯氨酸變為絲氨酸)，所述修飾的玉米EPSPS基因在美國專利6，566，587和6，040, 497中描述，所述美國專利均以引用的方式全文納入本文。
【發明內容】
[0009] 本發明涉及一種密碼子優化的修飾的EPSPS序列，當在植物中表達時，該序列可賦予對草甘膦除草劑的抗性或耐受性。所述核苷酸序列被優化用于在植物中表達，優選用于在雙子葉植物和單子葉植物中表達，最優選用于在大豆(Glycine max)植物中表達。所編碼的氨基酸與野生型EPSPS多肽相比包括兩個突變:與野生型玉米(Zea mays) EPSPS多肽相比，在相應的102位殘基上蘇氨酸成異亮氨酸和在相應的106位殘基上脯氨酸成絲氨酸。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為Genbank登錄號X63374中列出的序列，該序列是編碼在進入并切除優化的葉綠體轉運肽之后的預測成熟玉米EPSPS序列的野生型玉米(Zea mays) EPSPS核苷酸序列，該序列為SEQ ID NO:1 ;在所述核苷酸序列下面標出預測成熟玉米EPSPS的編碼氨基酸序列，為SEQ ID N0:2。殘基102和殘基106為下劃線粗體；在蛋白的102位上以異亮氨酸置換蘇氨酸和106位上以絲氨酸置換脯氨酸的蛋白是雙重突變型玉米EPSPS蛋白(2mEPSPS)，為SEQ ID N0:3。圖1公開了如SEQ ID NO:6的包括“atg”起始密碼子的全長序列。
[0011]圖2示出雙重突變型玉米EPSPS基因(2mEPSPS vl)的核苷酸序列，為SEQ IDN0:4。ATG起始密碼子位點為斜體。
[0012]圖3示出優化的雙重突變型玉米EPSPS基因(2mEPSPS v2)核酸分子，為SEQ IDN0:5。圖3公開了如SEQ ID NO:7的包括“atg”起始密碼子的全長序列。
[0013]圖4A-B示出玉米2mEPSPS vl核酸分子(SEQ ID NO:4)和優化的DMMG核酸分子(2mEPSPS v2, SEQ ID NO:7)的比對。
[0014]圖5為構建體pDAB8291的質粒圖。
[0015]圖6為表達2mEPSP`S v2的第一事件的蛋白質印跡。
[0016]圖7為表達2mEPSPS v2的第二事件的蛋白質印跡。
[0017]序列說明
[0018]SEQ ID NO:1:為X63374玉米EPSPS野生型核苷酸序列(編碼推測的成熟野生型EPSPS)o
[0019]SEQ ID NO: 2:為自X63374的推測的成熟野生型EPSPS氨基酸序列。
[0020]SEQ ID NO: 3:為推測的2mEPSPS雙重突變型氨基酸序列。
[0021]SEQ ID N0:4:為編碼雙重突變型2mEPSPS的玉米天然序列核苷酸序列2mEPSPSvl O
[0022]SEQ ID N0:5:為編碼雙重突變型2mEPSPS的單子葉植物優化的核苷酸序列2mEPSPS v2。
[0023]SEQ ID NO:6:為包括ATG起始密碼子的野生型EPSPS核苷酸序列。
[0024]SEQ ID NO: 7:為包括ATG起始密碼子的編碼雙重突變型2mEPSPS的優化的核苷酸序列 2mEPSPS v20
【具體實施方式】
[0025]為了獲得異源基因在植物中的高表達，優選重新設計所述基因從而使它們在植物細胞中更有效地表達，當需要單子葉植物基因既在雙子葉植物細胞又在單子葉植物細胞中表達時，尤其優選如此。已分離出編碼5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)的野生型基因，編碼在進入并切割優化的葉綠體轉運肽之后的推測成熟玉米EPSPS序列的玉米核苷酸序列可見于GenBank登錄號X63374，也示于美國專利6，566，587(其中具體為序列識別號3)，所述美國專利以引用的方式全文納入本文。在本文中，所述序列為SEQ ID NO:1，也示于圖1中。在圖1中，野生型EPSPS核苷酸序列下面標出所編碼的野生型氨基酸序列，為SEQID N0:2。草甘膦(N-膦酰甲基甘氨酸)是除草劑中廣泛使用的組分。草甘膦抑制EPSPS，其參與植物細胞中芳香族氨基酸的合成。抑制EPSPS可有效地破壞蛋白質合成，從而殺死受影響的植物細胞。提供抗草甘膦的植物或植物細胞在多種應用中是有用的，其中具有所述抗性的植物細胞可對草甘膦暴露耐受。當在植物細胞中表達時，對野生型植物EPSPS核苷酸序列的修飾可提供這種抗性。參照圖1，并且如‘587專利中所述，當比較EPSPS多肽和圖1的野生型多肽時，所述蛋白質102位上以異亮氨酸置換蘇氨酸和106位上以絲氨酸置換脯氨酸的修飾(所述兩個位置在圖1中都以下劃線黑體示出)可得到雙重突變型EPSPS多肽(2mEPSPS)，在本文中為SEQ ID NO:3。當與合適的葉綠體轉運肽一起在植物細胞中表達時，它在進入葉綠體中并加工為成熟的酶形式之后可提供對草甘膦的耐受性(圖1)。
[0026]在本文中，用于在單子葉植物和雙子葉植物中表達相同的2mEPSPS蛋白的基因2mEPSPS v2的設計被顯示，為了優化的表達而重新設計該基因的蛋白編碼區。本文描述了編碼5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP合酶或EPSPS)多肽的優化的核苷酸序列，所述優化的多肽由野生型EPSPS修飾而來。
[0027]1338堿基對的來自玉米的雙重突變型核苷酸序列示于圖2示出，為SEQ ID N0:4。該修飾的核苷酸序列被稱為雙重突變型玉米基因或DMMG，并且可提供對草甘膦的耐受性。這是玉米2mEPSPS核苷酸序列，也稱為2mEPSPS vl。其編碼SEQ ID NO:3的2mEPSPS多肽，該多肽與SEQ ID NO: 2的野生型EPSPS多肽相比包含殘基102位以異亮氨酸置換蘇氨酸和殘基106位以絲氨酸置換脯氨酸。
[0028]優化了 SEQ ID NO:4的2mEPSPS vl核酸分子以改善在雙子葉植物和單子葉植物中的表達，尤其是在大豆中的表達。根據優先的單子葉植物密碼子選擇來選擇密碼子選擇，因為重新設計密碼子選擇使得所述蛋白質由對單子葉植物選擇和雙子葉植物選擇都有偏好的密碼子來編碼，并除去有害序列和多余限制位點以提高DMMG編碼序列的轉錄/翻譯的效率并有利于DNA操作步驟。這樣做，在雙子葉植物尤其是大豆中表達2mEPSPS可提供對草甘膦施用的抗性。
[0029]圖3示出優化的序列(SEQ ID NO: 5)。ATG起始位點為斜體并在所述優化序列SEQID NO: 5上面標出(包含“atg”起始密碼子的全長序列以SEQ ID NO: 7公開)。優化的序列和突變型玉米序列編碼相同的2mEPSPS蛋白(示于SEQ ID NO:3中)。
[0030]圖4示出與來自玉米的天然玉米密碼子2mEPSPS vlDNA序列(SEQ ID N0:4)比較，單子葉植物和雙子葉植物優化的2mEPSPS v2DNA序列的核苷酸序列比對。雖然2mEPSPS蛋白質序列在氨基酸水上100%相同，但是它們是在核苷酸水平上僅為85.5%相同的基因版本I和基因版本2。所產生的差異是使用上述策略產生的密碼子選擇的結果。
[0031]優化的2mEPSPS v2核酸分子可用于其中草甘膦抗性可用于植物中的多種廣泛應用。草甘膦、草硫膦和fosametine是膦酰甲基甘氨酸家族的廣譜系統性除草劑。當提及草甘膦時，該術語應被認為包括N-膦酰甲基甘氨酸的任何有效除草形式和其任何鹽及可在植物中導致草甘膦兩性離子生成的形式。對于PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)的結合而言，草甘膦是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EC2.5.1.19)或EPSPS的競爭性抑制劑。向植物施用膦酰甲基甘氨酸除草劑之后，它被轉移至植物中，在其中它在快速生長部分(尤其是莖和根端)積累，對敏感植物的破壞點造成損害。取決于除草劑的施用量，可抑制所述敏感植物的生長，即其生長變慢或完全停止。植物對草甘膦或其家族產品的耐受性可通過將這種優化的修飾EPSPS穩定地引入至它們的基因組中來獲得。從例如美國專利4，535，060和6，566，587已知，可通過將編碼EPSPS的基因引入至基因組中來賦予植物對上述類型的除草劑(尤其是N-膦酰甲基甘氨酸或草甘膦)的耐受性，所述編碼EPSPS的基因攜帶有可使該酶在定位于質體區室之后對其競爭性抑制劑(草甘膦)抗性更大的突變。當提及對草甘膦除草劑的抗性或耐受性時，它是指除草劑對植物的任何影響都不會殺死植物；可以對植物有極小的影響或者是完全沒有影響，使得對含有可提供抗性或耐受性的異源核酸分子的植物的任何不利影響小于不含可提供對草甘膦的抗性或耐受性的核酸分子的植物。
[0032]當在大豆(Glycine max)、大豆植物中表達時,這種核酸分子是尤其有用的。所述核酸分子可從任何宿主分離并被修飾以使其包含本發明的核酸分子，可以從玉米或大豆或其他植物分離，從微生物分離，或者可以通過合成產生；產生本發明的核酸分子的方法并不是至關重要的。
[0033]本文使用的術語核酸或多核苷酸是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其單鏈或雙鏈形式的聚合物。因此，所述術語包括RNA和DNA—可以是基因或其部分、cDNA、合成的聚脫氧核糖核苷酸序列等，可以是單鏈或雙鏈以及DNA/RNA雜合體。此外，本文所使用的術語包括天然存在的核酸分子，其可從細胞中分離，以及合成分子，其可通過例如化學合成方法或通過酶法(例如通過聚合酶鏈式反應(PCR))制備。除非特別限定，否則所述術語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述核酸具有與參比核酸相似的結合性質并以與天然存在核苷酸相似的方式進行代謝。所述術語核酸可與基因、cDNA和基因編碼的mRNA互換使用。
[0034]術語“互補的”用于描述能夠彼此雜交的核苷酸堿基之間的關系。例如，就DNA而言，腺嘌呤核苷與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本發明還包括與所述全序列互補的分離的核酸片段。
[0035]脫氧核糖核苷酸(DNA)是含`有4種單核苷酸單元的聚合物，(D) dAMP (2’ -(D)脫氧腺苷_5_ —磷酸)、dGMP (2’-(D)脫氧鳥苷-5- —磷酸)、dCMP (2’-(D)脫氧胞苷_5_ —磷酸)和dTMP (2’ -(D)脫氧胸苷-5- —磷酸)在各序列中通過3’，5’ -磷酸二酯橋連接。所述結構DNA由多個稱為“密碼子”的編碼氨基酸的核苷酸三聯體組成。所述密碼子對應如下的各種氨基酸:Arg(CGA、CGC、CGG、CGT、AGA、AGG) ;Leu(CTA、CTC, CTG, CTT, TTA, TTG)；Ser (TCA、TCC、TCG、TCT、AGC, AGT) ;Thr(ACA、ACC、ACG, ACT) ;Pro (CCA、CCC、CCG、CCT)；Ala (GCA、GCC、GCG, GCT) ;Gly(GGA、GGC, GGG, GGT) ;Ile(ATA、ATC, ATT) ；Val (GTA、GTC,GTG、GTT) ;Lys(AAA、AAG) ;Asn (AAC、AAT) ;Gln (GAA、CAG) ;His (CAC、CAT) ;Glu (GAA、GAG)；Asp(GAC、GAT) ;Tyr (TAC、TAT) ;Cys (TGC、TGT) ;Phe (TTC、TTT) ;Met (ATG)和 Trp (UGG)。此外，由于遺傳密碼子的冗余(即除了兩種氨基酸以外，所有的氨基酸對應多于一種密碼子)，存在可編碼具體氨基酸序列的許多可能的DNA序列。
[0036]在本文討論的氨基酸序列中，使用了標準的單字母或三字母命名法。在說明書下文中出現的所有肽結構以其中N末端氨基出現在左邊和C末端羧基出現在右邊的常規形式表示。同樣，在蛋白質中出現的天然存在氨基酸的氨基酸命名如下:丙氨酸(Ala ;A)、天冬酰胺(Asn ;N)、天冬氨酸(Asp ;D)、精氨酸(Arg ;R)、半胱氨酸(Cys ;C)、谷氨酸(Glu ;E)、谷氨酰胺(Gin ;Q)、甘氨酸(Gly ;G)、組氨酸(His ;H)、異亮氨酸(lie ;1)、亮氨酸(Leu ;L)、賴氨酸(Lys ;K)、甲硫氨酸(Met ;M)、苯丙氨酸(Phe ;F)、脯氨酸(Pro ;P)、絲氨酸(Ser ;S)、蘇氨酸(Thr ;T)、色氨酸(Trp ;W)、酪氨酸(Tyr ;Y)和纈氨酸(Val ;V)。當氨基酸殘基是未知的時候，可使用“X”，括號表示確定的指定是不可能的，括號內的氨基酸名稱是基于已知信息的最可能的估計。
[0037]當提及雜交技術時，可將已知核苷酸序列的全部或一部分用作探針，所述探針可選擇性雜交存在于選擇植物的克隆基因組DNA片段或cDNA片段的集合(即基因組文庫或cDNA文庫)中的其他相應的核苷酸序列。所述雜交探針可以是基因組DNA片段、質粒DNA片段、cDNA片段、RNA片段、PCR擴增的DNA片段、寡核苷酸或其他多核苷酸，并且可以以可檢測基團(例如32P)或任何其他可檢測標記物標記。因此，例如，用于雜交的探針可通過標記基于本發明的DNA序列的合成寡核苷酸制成。制備用于雜交的探針的方法和構建cDNA文庫和基因組文庫的方法通常是本領域已知的，并且已被公開(Sambrook et al.，1989)。
[0038]例如，本文公開的序列或其一個或多個部分可用作能夠特異性雜交相應序列的探針。為了在多種條件下實現特異性雜交，這種探針包括要篩選的序列中的獨特序列，長度優選為至少約10個核苷酸，長度更優選至少約20個核苷酸。或者，這種序列可用于通過PCR從選擇的植物中擴增相應的序列。該技術可用于從所需的植物中分離序列，或可用作診斷測定以確定植物中的序列存在情況。雜交技術包括雜交篩選以噬菌斑或菌落鋪板的DNA文庫(Sambrook et.al., 1989)。
[0039]這種序列的雜交可在嚴格條件下進行。“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”是指探針將會與其靶序列雜交至與其他序列相比更容易檢測的程度(即背景的至少2倍)的條件。嚴格條件是序列依賴性的，在不同的環境中不同。通過控制雜交條件和/或洗滌條件的嚴格性，可鑒定與探針100%互補的靶序列(同源探測)。或者，可調整嚴格條件以允許序列中有一些錯配使得可檢測更低程度`的相似性(異源探測)。通常，探針的長度少于約1000個核苷酸，優選長度少于500個核苷酸。
[0040]通常，嚴格條件是這樣的條件:在pH7.0至8.3下鹽濃度低于約1.5MNa+離子，通常約0.01至1.0M Na+離子濃度(或其他鹽)，并且溫度對于短探針(例如10至50個核苷酸)為至少約30°C，對于長探針(例如多于50個核苷酸)為至少約60°C。嚴格條件也可以通過加入去穩定劑(例如甲酰胺)來實現。示例性的低嚴格條件包括以37°C下于含有30-35%甲酰胺、IM NaCU0.1%SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，并且在50-55°C下在I X-2 X SSC(20XSSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性的中等嚴格條件包括在37°C下于40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、l%SDS中雜交，并且在55_60°C下在0.5X-1XSSC中洗滌。示例性的高嚴格條件包括在37°C下于50%甲酰胺、1.0M NaCU0.1%SDS中雜交，并且在60_65°C下在0.1XSSC中洗滌。
[0041]特異性通常是雜交后洗滌的函數，關鍵因素是最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對于 DNA-DNA 雜合體，Tni 可用 Meinkoth 和 Wahl1Anal.Biochem.，138:267-284(1984)的等式估算:1=81.5 °C+16.6 (log M) +0.41 (%GC) - 0.61 (%form) - 500/L ;其中 M 為單價陽離子的容積摩爾數，%GC為DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，L為以堿基對表示的雜交體的長度。Tm為(在確定的離子強度和pH下)50%的互補靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。對于每1%的錯配，Tffl降低約1°C ;因此，為了雜交所需同一性的序列，可調節Tm、雜交條件和/或洗滌條件。例如，如果要尋求具有≥90%同一性的序列，則可將Tm降低10°C。通常，在確定的離子強度和pH下，嚴格條件選擇為比特定序列和其互補序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。然而，極嚴格條件可采用在比熱解鏈溫度(Tm)低1、2、3或4°C的溫度下雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可采用在比熱解鏈溫度(Tm)低6、7、8、9或10°C的溫度下雜交和/或洗滌；低嚴格條件可采用在比熱解鏈溫度低11、12、13、14、15或20°C的溫度下雜交和/或洗滌。使用所述等式、雜交和洗滌組合物以及所需的 Tm，本領域普通技術人員將會理解，雜交和/或洗滌溶液的嚴格度的變化在本質上已經被描述。如果所需的錯配程度導致Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，則優選增加SSC的濃度使得可以使用更高的溫度。對核酸雜交的詳盡指導可在以下文獻中找至丨J:Ti issen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Acids Probes, Part I,Chapter2, Ausubel, etal., Eds., Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York (1995)。
[0042]特異性還是雜交后洗滌的函數，關鍵因素是最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對于 DNA-DNA 雜合體，Tm 可用以下等式估算:Tm=81.5°C +16.6 (log M) +0.41 (%GC)-0.61 (%form) - 500/L ;其中M為單價陽離子的容積摩爾數，%GC為DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，L為以堿基對表示的雜交體的長度(Meinkoth和Wahl, 1984)。Tm為(在確定的離子強度和pH下)50%的互補祀序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。對于每1%的錯配，Tm降低約1°C;因此，為了雜交所需同一性的序列，可調節Tm、雜交條件和/或洗滌條件。例如，如果要尋求具有90%同一性的序列，則可將Tm降低10°C。通常，在確定的離子強度和pH下，嚴格條件選擇為比特定序列和其互補序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。然而，極嚴格條件可采用在比熱解鏈溫度(Tm)低1、2、3或4°C的溫度下雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可采用在比熱解鏈溫度(Tm)低6、7、8、9或10°C的溫度下雜交和/或洗滌；低嚴格條件可采用在比熱解鏈溫度低11_20°C的溫度下雜交和/或洗滌。使用所述等式、雜交和洗滌組合物以及所需的Tm，本領域普通技術人員將會理解，雜交溶液和/或洗滌溶液的嚴格度的變化在本質上已經被描述。如果所需的錯配程度導致Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，則優選增加SSC的濃度使得可以使用更高的溫度。對核酸雜交的詳盡指導可在以下文獻中找到:(1997)Ausubelet al, Short Protocolsin Molecular Biology, page2_40, Third Edit.(1997)和 Sambrook et al.(1989)。
[0043]通常，對應本發明的核苷酸序列并且可與本文公開的核苷酸序列雜交的序列與所公開的序列至少 50% 同源、70% 同源，甚至 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更高。也就是說，探針和靶之間的序列相似性是一個范圍，共享至少約50%、約70%以及甚至約85%或更高的序列相似性。
[0044]以下術語被用于描述兩條或多條核酸或多核苷酸之間的序列關系:(a) “參比序列”，(b) “對比窗口”，(C) “序列同一性”以及(d) “序列同一性百分比”。
[0045](a)本文使用的“參比序列”是用作序列對比基礎的給定序列。參比序列可以是指定序列的子集或整體；例如，作為全長啟動子序列的區段或全啟動子序列。
[0046](b)本文使用的“對比窗口”是指多核苷酸序列的連續的指定區段，其中多核苷酸序列與參比序列(不包含插入或缺失)相比在對比窗口中可包含插入或缺失(即，缺口)，以最佳比對所述兩條序列。通常，對比窗口長度為至少20個連續核苷酸，任選可以為30、40、50、100或者更長。本領域技術人員可理解，由于多核苷酸序列中包含缺口，為了精確地反映與參比序列的相似性，缺口懲罰通常被引入并從匹配數目減去。
[0047]比對用于對比的序列的方法是本領域公知的。因此，可使用數學算法來完成對任意兩條序列間百分比同一性的確定。
[0048]最佳比對用于對比的序列可使用本領域已知的任何方法來分析序列同一性(同源性)，例如通過稱為“PILEUP”的漸進比對法(Morrison, Mol.Biol.Evo1.14:428-441 (1997)，其作為使用PILEUP的實例)；通過Smith和Watermanby的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2:482 (1981))；通過 Needleman 和 Wunsch 的同源性比對算法(J.Mol.Biol.48:443(1970))；通過 Pearson 的搜索相似性的方法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444(1988));通過這些算法的計算機實現(例如Wisconsin Genetics軟件包(Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison, ffis.) 中的 GAP、BEST FIT、FASTA 和 TFASTA) ;ClustalW (Intelligenetics (Mountain View,Calif.)的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL,描述于例如 Higgins, Gene73:237-244 (1988) ；Corpet, NucleicAcids Res.16:10881-10890 (1988) ；Huang, Computer Applications in theBiosciences8:155-165(1992);和 Pearson, Methods in Mol.Biol.24:307-331(1994)中；Pfam (Sonnhammer, Nucleic Acids Res.26:322-325 (1998) ；TreeAlign (Hein, MethodsMol.Biol.25:349-364(1994) ; MEG-ALIGN和SAM序列比對計算機程序；或通過肉眼觀察進行比對。 [0049]適合用于確定序列相似性的算法的另一個實例是BLAST算法，其被描述于Altschul et al, J.Mol.Biol.215:403—410 (1990)中。Altschul, S.F., et al., (1993)J.Mol.Biol.215:403-410的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)在默認參數下搜索與BLAST “GENEMBL”數據庫中包含的序列的同一性。使用BLASTN算法在默認參數下可以分析序列與GENEMBL數據庫中包含的所有公開可得DNA序列的同一性。
[0050]進行BLAST分析的軟件可從美國國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information, www.ncb1.nlm.nih.gov/)公開獲得；對于 “PowerBLAST” 變體，還可參見Zhang, Genome Res.7:649-656 (1997)。該算法包括首先通過在查詢序列中識別如下的長度為W的短字串而識別高得分序列對(HSP):在與數據庫序列中相同長度的字串比對時所述短字串匹配或者滿足某個正值的閾值T。T稱為相鄰字串閾值(Altschul etal, J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。將這些初始相鄰字串命中作為種子用于啟動搜索，以發現包含它們的更長HSP。字串命中沿著每條序列在兩個方向上延伸，只要累積比對分值可以增加。在每個方向上延伸字串命中停止的條件是:所述累積比對分值從其所達到的最大值下降X量；由于一個或多個負得分殘基比對的累積，所述累積分值達到0或小于0 ;或者達到任何一序列末端。所述BLAST算法參數W、T和X決定了所述比對的敏感度和速度。所述BLAST程序使用默認的字長(W) 11、BL0SUM62打分矩陣(參見Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915-10919 (1992))比對(B) 50、期望(E) 10、M=5、N=_4 和雙鏈對比。術語BLAST是指可進行兩條序列間相似性的統計分析的BLAST算法；參見例如Karlin, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 (1993)。所述BLAST算法提供的一種相似性量度是最小和概率(P(N))，其提供兩條核苷酸序列或氨基酸序列之間隨機出現匹配的概率的指示。例如，如果在核酸與參比核酸的對比中最小和概率小于約0.1，更優選小于約0.1，更優選小于約0.01，最優選小于約0.001，那么所述測試核酸被認為與參比序列相似。
[0051]在一個實施方案中，可使用GAP (全局比對程序)。GAP使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:443-453, 1970)的算法來發現兩條完整序列匹配數目最多且缺口數目最少的比對。在常用的Wisco丨ISillPackage⑩(Accelrys, Inc.，San Diego, CA)第 10 版中，
對于蛋白質序列來說，默認的缺口產生懲罰值和缺口延伸懲罰值分別為8和2。對核苷酸序列來說，默認的缺口產生懲罰為50，而默認的缺口延伸懲罰為3。百分比相似性是相似的符號的百分比。忽略越過缺口的符號。當符號對的打分矩陣值大于或者等于0.50(相似性閾值)時，就記錄相似性。通用的打分系統是BL0SUM62矩陣(Henikoff and Henikoff, Proteins, 17:49-61 (1993))，其是目前BLAST程序的默認選擇。BL0SUM62使用三種矩陣的組合以覆蓋全部的偶然性。Altschul, J.Mol.Biol.36:290-300(1993)以引用的方式全文納入本文，其為Wisconsin軟件包_詢版本10 (Accelrys, Inc., San Diego, CA)中使用的打分矩陣(參見 Henikoff&Henikoff (1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915)。
[0052](c)在兩條核酸序列的情形中，本文使用的“序列同一性”或“同一性”是指:在特定的對比窗口上比對獲得最大的對應時，所述兩條序列中相同的殘基。
[0053](d)本文使用的“序列同一性百分比”是指通過比較在對比窗口上兩條最佳對比的序列而確定的值，其中，為了最佳比對兩條序列，多核苷酸序列的所述部分與參比序列(不含插入或缺失)相比在對比窗口中可 以包含插入或缺失(即缺口)。所述百分比是這樣計算的:測定兩條序列中出現相同核酸堿基的位置的數目以獲得匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以對比窗口中的位置總數，再將所述結果乘以100，以獲得序列同一性百分比。
[0054]本發明的序列的同一性是指這樣的多核苷酸序列:具有至少65%序列同一性，更優選至少70%序列同一丨丨生,更優選至少75%序列同一丨丨生,更優選至少80%同一丨丨生,更優選至少 85%86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性。
[0055]可采用與本發明的核酸分子有關的多種測定。對于DNA印跡分析，將DNA用限制性內切酶酶切并在瓊脂糖凝膠上分級，以通過分子量分離所述DNA，然后轉移至尼龍膜上。然后，將其與以32P (或其他探針標記物)放射性標記的探針片段雜交并在SDS溶液中洗滌。在蛋白質印跡分析中，不是分離DNA，而是提取關注的蛋白質，并將其置于丙烯酰胺凝膠上。然后，將所述蛋白質印跡至膜上并與標記物質接觸。參見，例如Hood etal., “Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize;Characterizationof Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification^MolecularBreeding3:291-306 (1997) ；Towbin et al, (1979) “Electrophoretic transfer ofproteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and someappIications^Proc Natl Acad Sci USA76(9):4350-4354 ;Renart et al.“Transfer ofproteins from gels to diazobenzyloxymethy1-paper and detection with antisera:amethod for studying antibody specificity and antigen structure，，Proc Natl AcadSci USA76 (7): 3116-3120。在RNA印跡分析中，將RNA分離并分析。
[0056]ELISA或酶聯免疫測定自1971年就為人所知。一般而言，將溶解于緩沖液中的抗原涂敷于塑料表面。當加入血清時，抗體可連接于固相上的抗原上。當這些抗體與酶綴合時，可證明它們的存不存在。加入合適的底物將可檢測可被定量的結合綴合物的量。常用的ELISA測定使用生物素化的抗(蛋白質)的多克隆抗體和堿性磷酸酶綴合物的測定。例如，用于定量確定漆酶水平的ELISA可以是抗體夾心測定，所述測定利用市售的多克隆兔抗體。所述抗體與堿性磷酸酶綴合用于檢測。在另一個實例中，檢測胰島素或胰蛋白酶原的ELISA測定使用了生物素化的胰島素多克隆抗體或生物素化的胰蛋白酶原多克隆抗體和鏈霉親和素-堿性磷酸酶的綴合物。
[0057]前述技術可用于多種情況，在一個實施方案中，其可用于檢測植物細胞中核酸分子和/或所編碼的多肽的存在情況。例如，可以以多種方式確定所述分子的存在情況，包括使用所述序列的引物或探針、用于檢測所編碼蛋白質的ELISA測定、用于檢測所述蛋白的蛋白質印跡、用于檢測RNA或DNA的RNA印跡或DNA印跡、和/或分離序列并測定其與所述核酸分子的百分比同一性或檢測可操作連接的標記物的存在情況。此外，可檢測雙重突變型EPSPS蛋白的存在情況的抗體公開于美國專利7，807，791中，所述專利以引用的方式納入本文。
[0058]在將核酸插入至細胞中的情形中，術語“引入的”包括轉染或轉化或轉導，包括將核酸納入至真核細胞或原核細胞中，在這些細胞中所述核酸被納入至所述細胞的基因組(例如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中，被轉移至自主復制子中或被瞬時表達(例如轉染的mRNA)。當提及將核苷酸序列引入至植物中時，意在包括轉化至所述細胞中，以及將具有所述序列的植物與另一植物雜交，使得第二植物包含所述異源序列，如常規植物育種技術中那樣。這種育種技術對于本領域的技術人員是熟知的。對于植物育種技術的詳述，參見Poehlman(1995)Breeding Field Crops.AYIPublication C0., WestportConn, 4th Edit。回交法可用于將基因引入植物中。該技術用于將性狀引入植物已有數十年。對于該技術和公知的其他植物育種法的描述的實例可在參考文獻例如上文的Poelman和Plant BreedingMethodology, edit.Neal Jensen, John ffiley&Sons, Inc.(1988)中找到。在典型的回交方案中，將原始關注的品種(回歸親本)與攜帶要轉移的關注的單基因的第二品種(非回歸親本)雜交。然后，將從該雜交所得的子代與回歸親本再次雜交，并重復該過程直至獲得這樣的植物:其中，除了來自非回歸親本的單轉移的基因以外，在回歸親本中的所需的形態特征或生理特征基本上全部在轉化的植物中恢復。
[0059]如本文使用的，當核苷酸區段是指被置于與另一 DNA區段的功能關系中時，它被稱為是可操作連接的。例如，如果信號序列的DNA表達參與多肽分泌的前蛋白，則將其可操作地連接至編碼所述多肽的DNA上；如果啟動子或增強子促進編碼序列的轉錄，則將其可操作地連接至所述序列上。通常，可操作連接的DNA序列是連續的，在信號序列的情形中，其是連續的并且在閱讀相中。然而，增強子不需要與其控制轉錄的編碼序列連續。連接通過在方便的限制位點或插入代替其的連接物(adapter )或接頭處進行連接來實現。表達盒除包括啟動子外可以包括一個或多個增強子。增強子意欲是指可提高啟動子的利用的順式作用序列。這種增強子可以是基 因的天然增強子或者來自異源基因的增強子。此外，現認為一些啟動子可包含一個或多個天然增強子或類增強子元件。一個這類增強子的實例是35S增強子，其可以是單增強子或者是雙增強子。參見，例如McPherson et al、美國專利5，322，938。
[0060]廣義上，本文使用的術語植物包括處于發育任何階段的植物或植物部分，包括植物插條、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官、植物種子和小植物(plantlet)。植物細胞是植物的結構和生理單元，包括原生質體和細胞壁。植物細胞可以為如下的形式:分離的單細胞或細胞的集合體(例如易碎的愈傷組織)或培養的細胞，或者可以是更高組織的單元(例如植物組織、植物器官或植物)的部分。因此，植物細胞可以是原生質體、配子生成細胞或者可再生成完整植物的細胞的細胞或集合物。因此,包含多種植物細胞且能夠再生成完整植物的種子被認為是用于本公開的目的的植物細胞。植物組織或植物器官可以是種子、原生質體、愈傷組織，或者是可形成結構或功能單元的任何其他植物細胞群。植物中尤其有用的部分包括可收獲的部分和用于繁殖子代植物的部分。植物的可收獲部分可以是植物的任何有用部分，例如花、花粉、幼苗、塊莖、葉、莖、果實、種子、根等。對繁殖有用的植物部分包括種子、果實、插條、幼苗、塊莖、根狀莖等。組織培養物優選能夠再生具有前述近交玉米植物的生理特征和形態特征的植物，和能夠再生具有與前述近交玉米植物基本相同的基因型的植物。優選地，在這種組織培養物中的可再生細胞會是胚、原生質體、分生細胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、穗絲(silk)、花、核、穗(ear)、穗軸(cob)、外殼(husk)或莖。此外，本發明還提供了從本發明的組織培養物中再生得到的植物。
[0061]構建體是通過多種技術插入至細胞基因組中的遺傳材料包。
[0062]本文使用的術語載體廣義上是指編碼外源核酸的任何質粒或病毒。植物分子生物學中常用的載體的實例是雙元載體，其可被設計為包含構建體，參見Bevan M., (1984)Nucl.Acids Res.，12(22):8711-8721。所述術語也應被理解為包括有助于將核酸轉移至病毒體或細胞中的非質粒和非病毒化合物，例如聚賴氨酸化合物等。所述載體可以是適于作為用于將核酸或其突變體遞送至細胞的遞送載體的病毒載體，或者所述載體可以是適用于同樣目的的非病毒載體。用于將DNA遞送至細胞或組織的病毒載體或非病毒載體的實例是本領域熟知的，并被描述于例如Ma et al.(1997, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.94:12744-12746)中。病毒載體的實例包括但不限于重組痘苗病毒、重組腺病毒、重組反轉錄病毒、重組腺伴隨病毒、重組禽痘病毒等(Cranage et al.，1986，EMBOJ.5:3057-3063 ;國際專利申請N0.W094/17810，公開于1984年8月18日；國際專利申請N0.W094/23744，公開于1994年10月27日)。非病毒載體的實例包括但不限于脂質體、DNA的多胺衍生物等。
`[0063]一般而言，可用于構建重組基因(任選包括改進表達的多種修飾)的方法在細節上可能不同。但是，常規采用的方法包括PCR擴增，或重疊、互補的合成寡核苷酸的設計和合成，所述合成寡核苷酸可退火并連接在一起，以產生具有方便限制性位點的基因，用于從另一已克隆的來源克隆或亞克隆或者從文庫中克隆。對于分子生物學家來說，所涉及的方法是標準方法(Sambrook et al., 1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2ndEdition.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)。
[0064]在本發明的方法中，可采用指導基因在植物中表達的多個啟動子。這種啟動子可選自組成型啟動子、化學調控啟動子、可誘導啟動子、組織特異性啟動子、種子優先的啟動子。組成型啟動子包括例如核心CaMV35S啟動子(Odell et al.(1985)Nature313:810-812);水稻肌動蛋白(McElroyet al.(1990)Plant Cell2:163-171);玉米泛素(美國專利 5，510，474 ;Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和 Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689) ;pEMU (Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588) ；MAS (Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730)，Rsyn7啟動子的核心啟動子以及公開于W099/43838和美國專利6，072，050中的其他組成型啟動子；水稻肌動蛋白(McElroy et al.(1990) Plant Cell2:163-171) ;pEMU(Last et al.(1991) Theor.Appl.Genet.81:581-588) ；MAS (Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730) ;ALS啟動子(美國專利5,659,026);水稻肌動蛋白啟動子(美國專利 5, 641, 876 ；W000/70067 );玉米組蛋白啟動子(Chabouteet al.Plant MolecularBiology, 8:179-191 (1987),Brignon et al.,Plant Mol Bio22(6):1007-1015 (1993);Rasco-Gaunt et al., Plant Cell R印? 21 (6): 569-576 (2003))等。其他組成型啟動子包括例如美國專利 5，608，149,5, 608，144,5, 604，121,5, 569，597,5, 466，785,5, 399，680、5，268，463 和 5，608，142。
[0065]可用的植物相容性啟動子的范圍包括組織特異性啟動子和可誘導啟動子。可誘導調控元件是這樣的元件:在響應誘導物時能夠直接地或間接地激活一條或多條DNA序列或基因的轉錄。在缺乏誘導物的情況下，將不會轉錄所述DNA序列和基因。通常，特異性結合可誘導調控元件以激活轉錄的蛋白因子以無活性形式存在，隨后其被所述誘導物直接或間接轉化為活性形式。所述誘導物可以是化學試劑例如蛋白質、代謝物、生長調節劑、除草劑或酚類化合物，或者是由熱、冷、鹽或毒性元素直接施加的生理應激或通過病原體或致病物(例如病毒)的作用間接施加的生理應激。通常，特異性結合可誘導調控元件以激活轉錄的蛋白因子以無活性形式存在，隨后其被誘導物直接或間接轉化為活性形式。所述誘導物可以是化學試劑例如蛋白質、代謝物、生長調節劑、除草劑或酚類化合物，或者由熱、冷、鹽或毒性元素直接施加的生理應激或通過病原體或致病物(例如病毒)的作用間接施加的生理應激。含有可誘導調控元件的植物細胞可通過對所述細胞或植物外部施用所述誘導物，例如通過噴灑、澆水、加熱或類似的方法，來使其暴露于誘導物下。
[0066]任何的可誘導啟動子都可用于本發明。參見Ward et al.Plant Mol.Bio1.22:361-366 (1993)。示例性的可誘導啟動子包括蛻皮激素受體啟動子(美國專利6，504，082);對銅響應的來自 ACEl 系統的啟動子(Mett et al.PNAS90:4567-4571 (1993))；對苯磺酰胺除草劑安全劑響應的來自玉米的In2-1基因和In2-2基因(美國專利5, 364, 780 ；Hershey et al.，Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991)和 Gatz et al., Mol.Gen.Genetics243:32-38 (1994));來自 TnlO 的 Tet 阻抑物(Gatz et al.,Mol.Gen.Genet.227:229-237 (1991);或來自類固醇基因，其轉錄活性由糖皮質類固醇激素誘導(Schena et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.88:10421 (1991));玉米 GST 啟動子，由用作萌前除草劑的疏水性親電子化合物激活；以及煙草PR-1a啟動子，由水楊酸激活。其他關注的化學調控的啟動子包括響應留類化合物的啟動子(參見，例如Schena etal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10421-10425 和 McNellis et al.(1998)PlantJ.14(2):247-257中糖皮質激素誘導的啟動子)和四環素誘導的啟動子和四環素抑制的啟動子(參見，例如 Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237 和美國專利 5，814，618和 5，789，156)。
[0067]冷響應調控元件或熱休克調控元件,其轉錄分別受對暴露于冷或熱反應的影響(Takahashi et al., Plant Physiol.99:383-390，1992);醇脫氫酶基因的啟動子(Gerlachet al., PNAS USA79:2981-2985 (1982) ；ffalker et al.，PNAS84(19):6624-6628 (1987))，其由厭氧條件誘導；以及來自豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因的光誘導啟動子(Yamamoto et al.(1997) Plant J.12 ⑵:255-265);光誘導調控兀件(Feinbaum etal.，Mol.Gen.Genet.226:449，1991;Lam and ChuajScience248:471，1990 ;Matsuokaet al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (20):9586-9590 ；Orozco et al.(1993)Plant Mol.Bi0.23 (6): 1129-1138)；植物激素誘導的調控兀件(Yamaguch1-Shinozakiet al.，Plant Mol.Biol.15:905, 1990 ；Kares et al.，Plant Mol.Biol.15:225，1990)等。可誘導調控元件也可以是玉米In2-1基因或In2-2基因的可響應苯磺酰胺除草劑安全劑的啟動子(Hershey et al.，Mol.Gen.Gene.227:229-237，1991; Gatz et al.,Mol.Gen.Genet.243:32-38，1994)，和轉座子 TnlO 的 Tet 阻抑物(Gatz et al.，Mol.Gen.Genet.227:229-237，1991)。應激誘導的啟動子包括鹽/水應激誘導的啟動子，例如P5CS(Zang et al.(1997)Plant Sciencesl29:81-89);冷誘導啟動子，例如 corl5a (Hajelaet al.(1990)Plant Physiol.93:1246-1252)、corl5b (Wlihelm et al.(1993)Plant MolBiol23:1073-1077).wscl20(0uellet et al.(1998)FEBS Lett.423-324-328).ci7(Kirchet al.(1997)Plant Mol Biol.33:897-909)、ci21A (Schneider et al.(1997)PlantPhysiol.113:335-45);干旱誘導啟動子，例如 Trg-31 (Chaudhary et al (1996)Plant Mol.Biol.30:1247-57)、rd29 ( Kasuga et al.(1999) Nature Biotechnology 18:287-291);滲透誘導啟動子，例如 Rabl7 (Vilardell et al.(1991)Plant Mol.Biol.17:985-93)和滲透蛋白(Raghothama et al.(1993)Plant Mol Biol23:1117-28);和熱誘導啟動子，例如熱休克蛋白(Barros et al.(1992)Plant Mol.19:665-75 ；Marrs et al.(1993)Dev.Genet.14:27-41)、smHSP (Waters et al.(1996)J.Experimental Botany47:325-338)和來自歐芹泛素啟動子的熱休克誘導元件(W003/102198)。其他應激誘導啟動子包括rip2(美國專利 5，332，808 和美國公開 N0.2003/0217393)和 rd29a (Yamaguch1-Shinozaki etal.(1993)Mol.Gen.Genetics236:331-340)。一些啟動子可通過創傷誘導，包括土壤桿菌(Agrobacterium) pmas 啟動子(Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4 (3):495-505)和土壤桿菌 0RF13 啟動子(Hansen et al.，(1997)Mol.Gen.Genet.254(3):337-343)。
[0068]組織優先的啟動子可用于在特定的植物組織中靶向增強的轉錄和/或表達。當提及優先表達時，是指在與在其他植物組織中相比在特定植物組織中以更高的水平表達。這種類型的啟動子的實例包括種子優先表達，例如由菜豆蛋白啟動子(Bustoset al.1989.The Plant Cell Vol.1，839-853)和玉米球蛋白-1 基因(Belanger，etal.1991Geneticsl29:863-972)提供的。對于雙子葉植物，種子優先的啟動子包括但不限于大豆菜豆蛋白、油菜籽蛋白、伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。對于單子葉植物，種子優先的啟動子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、Y _玉米醇溶蛋白、waxy、shrunkenUshrunken2、球蛋白I等。種子優先的啟動子還包括主要對種子中的特定組織指導基因表達的啟動子，例如Y-玉米醇溶蛋白的胚乳優先的啟動子、來自煙草的隱蔽性啟動子(Fobert et al.1994.T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter intobacc0.Plant J.4:567-577)、來自玉米的 P-基因啟動子(Chopra et al.1996.Allelesof the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homo1gousproteins with C—terminal replacements.Plant Ce 117:1149-1158, Erratum inPlant Cell.1997，1:109)、來自玉米的球蛋白-1 啟動子(Belenger and Kriz.1991.Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-lgene.Geneticsl29:863-972)和對種皮或玉米籽粒外皮指導表達的啟動子，例如果皮特異性谷氨酉先胺合成酶啟動子(Muhitch et al.，2002.1solation of a Promoter SequenceFrom the Glutamine Synthetase1^Gene Capable of Conferring Tissue-SpecificGene Expression in Transgenic Maize.Plant Sciencel63:865-872)，GenBank 登錄號AF359511。
[0069]可以包括載體的其他元件，這也取決于基因的擬定用途。實例包括選擇標記物、靶序列或調控序列、轉運肽序列例如優化的轉運肽序列(參見美國專利5，510，471)穩定序列例如 RB7MAR (參見，Thompson and Myatt，(1997)Plant Mol.Biol.,34:687-692and W09727207)或前導序列、內含子等。植物表達載體和報告基因的一般性描述和實例可在 Gruber，et al.，“Vectors for Plant Transformation” inMethod in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick et al eds;CRC Presspp.89-119 (1993)中找到。合適的表達載體的選擇將取決于宿主和將所述表達載體引入所述宿主的方法。表達盒在關注的異源核苷酸序列的3 ‘末端還包括在植物中有功能的轉錄終止區或翻譯終止區。所述終止區可以是本發明的啟動子核苷酸序列天然的，可以是關注的DNA序列天然的，或者可以來自其他來源。方便的終止區可獲自農桿菌(A.tumefaciens)的T1-質粒，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶(nos)終止區(Depickeret al., Mol.and Appl.Genet.1:561-573 (1982)和 Shaw et al.(1984) Nucleic AcidsResearch vol.12，N0.20pp7831_7846 (nos))。還可參見，Guerineau et al.Mol.Gen.Genet.262:141-144 (1991) ;Proudfoot，Cell64:671-674 (1991) ；Sanfacon et al.GenesDev.5:141-149(1991) ；Mogen et al.Plant Cell2:1261-1272 (1990) ；Munroe etal.Gene91:151-158 (1990) ；Ballas et al.Nucleic Acids Res.17:7891-7903 (1989);Joshi et al.Nucleic Acid Res.15:9627-9639(1987)。
[0070]用于選擇轉染細胞或`組織或植物部分或植物的報告基因和標記物基因可包括在轉化載體中。可選擇標記物的實例包括可賦予對抗代謝物(例如除草劑或抗體)的抗性的標記物，例如可賦予對甲氨蝶呤的抗性的二氫葉酸還原酶(Reiss，Plant Physiol.(Life Sc1.Adv.) 13:143-149，1994 ;也可參見 Herrera Estrella et al.，Nature303:209-213，1983;Meijer et al.,Plant Mol.Biol.16:807-820，1991);可賦予對氨基糖甙類的新霉素、卡那霉素和巴龍霉素的抗性的新霉素磷酸轉移酶(Herrera-Estrella，EMBOJ.2:987-995，1983 和 Fraley et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA80:4803 (1983))和可賦予對潮霉素的抗性的潮霉素磷酸轉移酶(Marsh，Gene32:481-485，1984 ；還可參見 Waldron et al.，Plant Mol.Biol.5:103-108, 1985 ；Zhijian et al.，PlantSciencel08:219-227, 1995);使細胞利用吲哚代替色氨酸的trpB ;使細胞利用histinol代替組氨酸的 hisD (Hartman, Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA85:8047，1988);使細胞利用甘露糖的甘露糖-6-磷酸異構酶(W094/20627);可賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑2_( 二氟甲基)-DL-鳥氨酸(DFMO)的抗性的鳥氨酸脫羧酶(McConlogue，1987，In:CurrentCommunications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratoryed.);和可賦予對殺稻痕素S的抗性的來自土曲霉(Aspergillus terreus)的脫氨酶(Tamura，Biosc1.Biotechnol.Biochem.59:2336-2338，1995)。其他的選擇標記物包括例如可賦予對草甘膦的抗性的突變型 EPSP 合酶(Hinchee et al.，BioTechnology91:915-922，1998)、可賦予對咪唑啉酮的抗性或對磺酰脲的抗性的突變型乙酰乳酸合酶(Lee et al.，EMBOJ.7:1241-1248，1988)、可賦予對莠去凈(atrazine)的抗性的突變型psbA (Smeda etal.,Plant Physiol.103:911-917，1993)或突變型初卟啉原氧化酶(參見美國專利N0.5，767，373)或可賦予對除草劑(例如草銨膦)的抗性的其他標記物。合適的可選擇標記基因的實例包括但不限于編碼對以下物質的抗性的基因:氯霉素(Herrera Estrella etal., EMBO J.2:987-992，1983)、鏈霉素(Jones et al.，Mol.Gen.Genet.210:86-91，1987)、壯觀霉素(Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res.5:131-137，1996)、博來霉素(Hille et al., Plant Mol.Biol.7:171-176，1990)、氨橫酸(Guerineau et al., PlantMol.Biol.15:127-136，1990)、溴苯腈(Stalker et al.，Science242:419-423，1988)、草甘勝(Shaw et al.，Science233:478-481，1986)、草丁 勝(DeBlock et al., EMBOJ.6:2513-2518, 1987)等。使用選擇基因的一個選項是草銨膦抗性編碼DNA，在一個實施方案中，可以是CaMV35S啟動子或泛素啟動子控制下的草丁膦乙酰轉移酶(PAT)基因、優化的玉米PAT基因或bar基因。所述基因賦予對雙丙氨酰膦的抗性(參見，Wohllebenetal., (1988)Gene70:25-37) ；Gordon-Kamm et al., Plant Cell2:603;1990;Uchimiya etal.,BioTechnologyll:835, 1993 ；White et al., Nucl.Acids Res.18:1062, 1990;Spenceret al., Theor.Appl.Genet.79:625-631, 1990 ；和 Anzai et al., Mol.Gen.Gen.219:492, 1989)。PAT基因的一個版本是描述于美國專利N0.6，096, 947中的優化的玉米PAT基因。
[0071]此外，可采用這樣的標記物，即其有助于鑒定含有編碼所述標記物的核苷酸的植物細胞。當所述序列的存在可產生可測定的產物并可無需破壞植物細胞而產生產物時，可評分(Scorable)或可篩選的標記物是有用的。實例包括(6-葡糖醛酸糖苷酶或UidA基因(GUS)，所述UidA基因編碼已知有多種顯色底物的酶(例如，美國專利5，268，463 和 5,599,670);氯霉素乙酰轉移酶(Jefferson et al.The EMBO Journalvol.6N0.13pp.3901-3907);堿性磷 酸酶。在優選的實施方案中，所使用的標記物是P _胡蘿卜素或前維生素A (Ye et al，Science287:303-305-(2000))。所述基因已被用于增強水稻的營養，但是在此實例中，其被改用作篩選標記物，連接關注的基因的所述基因可通過其提供的金黃色來檢測。與所述基因被用于其為植物貢獻營養的情況不同，僅需要較少量的蛋白質。通常，其他篩選標記物包括花色素苷/黃酮類化合物基因(參見
Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990) 2:115-127 中的討論)-包括例如 R-基因
座基因，該基因編碼可調控植物組織中花青素苷色素(紅色)產生的產物(Dellaporta etal., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appelsand Gustafson eds.，pp.263-282 (1988));控制黃酮類色素生物合成的基因，例如玉米Cl基因(Kao et al., Plant Cell(1996)8:1171-1179 ；Scheffler et al.Mol.Gen.Genet.(1994) 242:40-48 )和玉米 C2 (ffienand et al.,Mol.Gen.Genet.(1986) 203:202_207);B 基因(Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183) ;pl 基因(Grotewold et al, Proc.Natl.Acad.Sci USA(1991)88:4587-4591 ；Grotewold et al.，Cell (1994)76:543-553 ;Sidorenko et al., Plant Mol.Biol.(1999) 39:11-19) ;bronze 基因座基因(Ralston etal.,Genetics(1988) 119:185-197 ；Nash et al.,Plant Cell(1990)2(11):1039-1049)等。適合的標記物的其他實例包括青色熒光蛋白(CYP)基因(Bolte et al.(2004) J.CellSciencell7:943-54and Kato et al.(2002)Plant Physioll29:913_42)、黃色熒光蛋白基因(來自 Evrogen 的 PHIYFP? ;參見 Bolte et al.(2004) J.Cell Sciencell7:943_54);編碼熒光素酶的Iux基因，所述熒光素酶的存在情況可使用X光片、閃爍計數法、熒光分光光度法、低照度攝像機、光子計數照相機或多孔發光測定法(multiwell Iuminometry)檢測(Teeri et al.(1989)EMBO J.8:343);綠色熒光蛋白(GFP)基因(Sheen et al., PlantJ.(1995)8(5):777-84);和DsRed2，用該標記物基因轉化的植物細胞是紅色的，因此可用視覺選擇(Dietrich et al.(2002) Biotechniques2 (2): 286-293)。其他實例包括 3_內酰胺酶基因(Sutcliffe, Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.U.S.A.(1978) 75:3737)，該基因編碼已知存在多種顯色底物(例如PADAC，顯色頭孢霉素)的酶；xylE基因(Zukowsky et al.，Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.U.S.A.(1983)80:1101)，該基因編碼可轉化顯色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶；a -淀粉酶基因(Ikuta et al., Biotech.(1990)8:241);和酪氨酸酶基因(Katz etal., J.Gen.Microbiol.(1983) 129:2703)，該基因編碼能夠將酪氨酸氧化為DOPA和多巴醌(其可進而濃縮以形成易于檢測的化合物黑色素)的酶。明顯的是，本領域技術人員可獲得許多這類標記物。[0072]表達盒可另外地包括5 ‘前導序列。這種前導序列可以發揮作用以增強翻譯。翻譯前導序列在本領域是已知的，包括例如小RNA病毒前導序列、EMCV前導序列(腦心肌炎病毒 5 ‘非編碼區，Elroy-Stein et al.Proc.Nat.Acad.Sc1.USA86:6126-6130 (1989)；馬鈴薯Y病毒組前導序列，例如TEV前導序列(煙草蝕紋病毒)，Carrington and FreedJournal of Virology, 64:1590-1597 (1990), MDMV 前導序列(玉米矮花葉病毒)，Allisonet al.;Virologyl54:9_20 (1986);人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP), Macejak etal.Nature353:90-94 (1991);來自苜蓿花葉病毒外殼蛋白mRNA (AMV RNA4)的非翻譯前導序列，Jobling et al.Nature325:622-625 (1987);煙草花葉病毒前導序列(TMV)，Gallieet al.(1989)Molecular Biology of RNA, pages237_256 ;和玉米裡綠斑駁病毒前導序列(MCMV), Lommel et al.Virology81:382-385 (1991)。還參見 Della-Cioppa et al.PlantPhysiology84:965-968(1987)。
[0073]所述構建體還可以包括增強翻譯和/或mRNA穩定性的序列例如內含子。一個這類內含子的實例是擬南芥(Arabidopsis thaliana)組蛋白H3.1II變體的基因II的第一內含子。Chaubet et al.Journal of Molecular Biology, 225:569-574(1992)。
[0074]在需要使異源核苷酸序列表達的產物定位至特定的細胞器(尤其是質體、造粉體)或定位至內質網或在細胞表面或細胞外分泌的情況中，表達盒還可包括轉運肽的編碼序列。這種轉運肽在本領域是已知的，包括但不限于酰基載體蛋白、RUBISC0的小亞基、植物EPSP合酶的轉運妝和向日葵(Heilianthus annus)(參見Lebrun et al.美國專利 5，510，417)、玉米(Zea mays) Brittle-1 葉綠體轉運妝(Nelson et al.PlantPhysiol117 (4):1235-1252 (1998) ；SulIivan et al.Plant Cell3 (12):1337-48 ；Sullivan et al.，Planta (1995) 196(3):477-84 ;Sullivan et al.,J.Biol.Chem.(1992) 267 (26): 18999-9004)等。此外，嵌合轉運肽是本領域已知的，例如優化的轉運肽(參見，美國專利5，510，471)。本領域技術人員會容易理解，在將產物表達至特定細胞器的過程中可用的多種選擇。例如，大麥a淀粉酶經常被用于指導表達至內質網(Rogers, J.Biol.Chem.260:3731-3738 (1985))。轉運肽的使用是公知的(例如，參見美國專利5，717，084、5，728，925)。
[0075]任選地，可將本發明的核苷酸序列與另一關注的核苷酸序列結合。術語“關注的核苷酸序列”是指這樣的核酸分子(其也被稱為多核苷酸):可以是RNA分子以及DNA分子，可以是編碼所需多肽或蛋白質的分子，所述術語還可以是指不構成整個基因且不一定編碼多肽或蛋白質的核酸分子(例如啟動子)。例如，可將本發明的核酸分子與另一核酸分子結合或“堆疊”，所述另一核酸分子可提供對草甘膦或其他除草劑的另外的抗性或耐受性，和/或可提供對選擇昆蟲或疾病的抗性，和/或增強的營養，和/或改進的農藝特性，和/或可用于飼料、食物、工業、制藥或其他用途的蛋白質或其他產物。在植物基因組內含有構建體的核酸的堆疊可通過植物育種、轉基因植物的再轉化，或者通過同源重組的靶向整合加入新性狀來實現。
[0076]這種核苷酸序列包括但不限于下面提供的這些實例:
[0077]1.可賦予對害蟲或疾病的抗性的基因或編碼序列(例如，iRNA)。
[0078](A)植物疾病抗性基因。植物防衛經常由植物中疾病抗性基因(R)的產物和病原體中相應的無毒(Avr)基因的產物之間的特異性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因來轉化植物變種以設計抗特定病原體株的植物。這種基因的實例包括用于抗黃枝孢霉(Cladosporium fulvum)的番爺 Cf_9 基因(Jones et al.，1994Science266:789)、用于抗丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)番爺致病變種的編碼蛋白激酶的番爺Pto基因(Martin et al.，1993Science262:1432)和用于抗丁香假單胞菌的擬南芥RSSP2基因(Mindrinos et al.，1994Cell78:1089)。
[0079](B).蘇蕓金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、其衍生物或以其為模型的合成多肽，例如Bt 8 -內毒素基因的核苷酸序列(Geiser et al., 1986Gene48:109)和營養期殺蟲(VIP)基因(參見，例如 Estruch et al.(1996) Proc.Natl.Acad.Sc1.93:5389-94)。此外，編碼S -內毒素基因的DNA分子可從美國典型培養物保藏中心(American TypeCulture Collection)購得，ATCC 登錄號為 40098,67136,31995 和 31998。
[0080](C)凝集素，例如多個君子蘭(Clivia miniata)甘露糖結合凝集素基因的核苷酸序列(Van Damme et al., 1994Plant Molec.Biol.24:825)。
[0081](D)維生素結合蛋白，例如抗生素蛋白和用作抗蟲害的殺幼蟲劑的抗生素蛋白同系物。參見美國專利N0.5，659，026。
[0082](E)酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。這類基因的實例包括水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Abe et al.，1987J.Biol.Chem.262:16793)、煙草蛋白酶抑制劑 I (Huub et al., 1993Plant Molec.Biol.21:985)和 a -淀粉酶抑制劑 Sumitani etal., 1993Biosc1.Biotech.Biochem.57:1243)。
[0083](F)昆蟲特異性的激素或信息素例如蛻皮甾類和保幼激素其變體、基于其的模仿物或者其拮抗物或激動劑，例如桿狀病毒表達的克隆的保幼激素酯酶(一種保幼激素的滅活劑)(Hammock et al.，1990Nature344:458)。
[0084](G)昆蟲特異性肽或神經肽，其在表達時破壞受影響的害蟲的生理機能。J.Biol.Chem.269:9。這類基因的實例包括昆蟲利尿激素受體(Regan, 1994)，太平洋折翅蠊(Diploptera punctata)中鑒定的allostatin (Pratt, 1989)、昆蟲特異性麻痹性神經毒素(美國專利 N0.5，266，361)。
[0085](H)自然界中蛇、黃蜂等產生的昆蟲特異性毒液，例如蝎子蟲毒肽(Pang, 1992Genell6:165)。
[0086](I)使得單萜、倍半萜、留醇、氧肟酸、苯丙素衍生物或具有殺蟲活性的另一非蛋白質分子超積累的酶。
[0087](J)參與生物活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如:天然的或合成的糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環化酶、轉氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、幾丁質酶和葡聚糖酶。這種基因的實例包括callas基因(PCT公開的申請W093/02197)、幾丁質酶編碼序列(例如，可以從ATCC獲得，登錄號為3999637和 67152)、煙草鉤蟲幾丁質酶(Kramer et al.，1993Insect Molec.Biol.23:691)和歐芹ubi4_2 多聚泛素蛋白基因(Kawalleck et al., 1993Plant Molec.Biol.21:673)。
[0088](K)促進信號轉導的分子。這類分子的實例包括綠豆鈣調蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botella et al., 1994Plant Molec.Biol.24:757)和玉米鈣調蛋白 cDNA 克隆的核苷酸序列(Griess et al., 1994Plant Physiol.104:1467)。
[0089](L)疏水性moment肽。參見美國專利N0.5，659，026和5，607, 914，后者教導了可賦予疾病抗 性的合成抗微生物肽。
[0090](M)膜通透酶，通道形成劑(channel former)或通道阻滯劑，例如可使得轉基因番爺植物抗青枯假單胞菌(Pseudomonas solanacearum)的殺菌肽裂解肽類似物(Jayneset al., 1993Plant Sc1.89:43)。
[0091](N)病毒侵入性蛋白或從其衍生出的復合毒素。例如，轉化的植物細胞中病毒外殼蛋白的累積給予對受從中獲得外殼蛋白的病毒以及相關病毒影響的病毒感染和/或疾病發生的抗性。已經對轉化植物賦予了外殼蛋白介導的對以下病毒的抗性:苜蓿花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕紋病毒、煙草格格病毒和煙草花葉病毒。參見，例如 Beachy et al.(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。
[0092](0)昆蟲特異性抗體或從其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆蟲腸道中關鍵代謝功能的抗體會使受影響的酶失活，殺死昆蟲。例如，Taylor et al.(1994)Abstract#497, SeventhInf I。關于分子植物-微生物相互作用的專題論文表明通過產生單鏈抗體片段使轉基因煙草中的酶失活。
[0093](P)病毒特異性抗體。參見,例如，Tavladoraki et al.(1993) Nature266:469,該文獻表明表達重組抗體基因的轉基因植物可免受病毒攻擊。
[0094](Q)自然界中由病原體或寄生蟲產生的發育停滯蛋白。因此，真菌內切a-l，4_D多聚半乳糖醛酸酶通過溶解植物細胞壁同型a -1, 4-D-半乳糖醛酸酶有利于真菌定植和植物營養素釋放(Lamb et al.，1992) Bio/TechnologylO: 1436。克隆和鑒定編碼大豆多聚半乳糖醛酸內切酶抑制蛋白的基因描述于Toubart et al (1992Plant J.2:367)中。
[0095](R)自然界中由植物產生的發育停滯蛋白，例如大麥核糖體失活基因具有增強的真菌疾病抗性(Longemann et al.，1992) ? Bio/TechnologylO: 3305。
[0096](S)其中RNA分子用于抑制靶基因表達的RNA干擾。在一個實例中，RNA分子部分或全部為雙鏈，其可引發沉默反應，導致dsRNA被切割成小干擾RNA，隨后所述小干擾RNA被納入至可破壞同源mRNA的祀復合體中。參見，例如，Fire et al.，美國專利
6,506, 559; Graham et al.6，573，099。
[0097]2.可賦予對除草劑的抗性的基因
[0098](A)編碼對抑制生長點或分生組織的除草劑(例如咪唑酮類或磺酰脲)的抗性或耐受性的基因。該類別中的示例性基因編碼突變型乙酰乳酸合酶(ALS) (Lee et
al., 1988EMB0J.7:1241)-也被稱為乙酰羥酸合酶(AHAS) (Miki et al., 1990Theor.Appl.Genet.80:449)。
[0099](B)編碼草甘膦抗性或耐受性的一個或多個其他基因，所述草甘膦抗性或耐受性由突變型EPSP合酶和aroA基因給予，或由基因例如GAT (草甘膦乙酰轉移酶或GOX (草甘膦氧化酶)和其他膦酰化合物例如草銨膦(PAT基因和bar基因)，和pyridinoxy或苯氧基丙酸和環己二酮(ACC酶抑制劑編碼基因)通過代謝失活給予。參見，例如，美國專利N0.4，940，835，該專利公開了可賦予草甘膦抗性的EPSPS形式的核苷酸序列。編碼突變型aroA基因的DNA分子可以以ATCC登錄號39256獲得，所述突變型基因的核苷酸序列公開在美國專利N0.4，769，061中。歐洲專利申請N0.0333033和美國專利N0.4，975，374公開了可賦予對除草劑(例如L-草丁膦)的抗性的谷氨酰胺合酶基因的核苷酸序列。草丁膦乙酰轉移酶基因的核苷酸序列提供在歐洲申請N0.0242246中。De Greef et al.(1989)Bio/Technology?:61描述了可表達編碼草丁膦乙酰轉移酶活性的嵌合bar基因的轉基因植物的產生。可賦予對苯氧基丙酸抗性和環己二酮(例如稀禾定和吡氟氯禾靈)的抗性的示例性基因是描述在 Marshall et al.(1992)Theor.Appl.Genet.83:435 中的 Accl-Sl 基因、Accl-S2基因和Accl_S3基因。
[0100](C)編碼對可抑制光合作用的除草劑例如三嗪(psbA基因和gs+基因)和氰苯(腈水解酶基因)的抗性或耐受性的基因。Przibilla et al.(1991)Plant Cell3:169描述了使用編碼突變型psbA基因的質粒來轉化衣滴蟲(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列公開在美國專利N0.4，810, 648中，含有這些基因的DNA分子可以以ATCC登錄號53435,67441和67442獲得。編碼谷胱甘肽-S-轉移酶的DNA的克隆和表達描述于Hayeset al.(1992) Biochem.J.285:173 中。
[0101](D)編碼對可結合羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPro)的除草劑的抗性或耐受性的基因，所述酶可催化將對羥基苯丙酮酸(HPP)轉化為高龍膽酸的反應。這包括除草劑例如異噁唑(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、美國專利N0.5，424，276)，尤其是針對玉米的選擇性除草劑異噁氟草；二酮腈類(EP496630、EP496631),尤其是2-氰基-3-環丙基-l-(2-S02CH3-4-CF3苯基)丙烷_1，3- 二酮和2-氰基-3-環丙基-l-(2-S02CH3-4-2, 3C12 苯基)丙烷-1, 3- 二酮；三酮類(EP625505、EP625508、美國專利N0.5，506, 195)，尤其是磺草酮；或者吡唑特(pyrazolinate)。在植物中產生過多HPH)的基因可提供對這類除草劑的耐受性或抗性，包括例如描述于美國專利N0.6，268，549 和 6，245，968 以及美國公開 N0.20030066102 中的基因。
[0102](E)編碼對苯氧基生長素除草劑例如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性或耐受性的基因，所述基因還可賦予對芳氧基苯氧丙酸(AOPP)除草劑的抗性或耐受性。這類基因的實例包括a-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(AAD-1)基因，所述基因描述于美國公開20090093366 中。[0103](F)編碼對苯氧基生長素除草劑例如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性或耐受性的基因，所述基因還可賦予對吡啶氧基生長素除草劑例如氟草煙或定草酯的抗性或耐受性的基因。這種基因的實例包括a-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(AAD-12)基因，所述基因描述于 TO2007/053482A2 中。
[0104](G)編碼對dicambia的抗性或耐受性的基因(參見，例如，美國專利公開20030135879)。
[0105](H)提供對可抑制初卟啉原氧化酶(PPO)的除草劑的抗性或耐受性的基因(參見，美國專利 N0.5，767，373)。
[0106](I)提供對可結合光系統II反應中心(PS II)的核心蛋白的均三氮苯類除草劑 (例如敵菌靈)和脲衍生物(例如敵草隆)的抗性或耐受性的基因(參見，Brussian etal., (1989)EMBO J.1989，8(4):1237-1245。
[0107]3.可賦予增值性狀的基因或對增值性狀有貢獻的基因
[0108](A)改進的脂肪酸代謝，例如通過以反義基因或硬脂酰-ACP去飽和酶轉化玉米或蕓苔屬(Brassica)以增加所述植物的硬脂酸的含量(Knultzon et al., 1992)Proc.Nat.Acad.Sc1.USA89:2624。
[0109](B)降低的肌醇六磷酸含量
[0110](I)引入肌醇六磷酸編碼基因會增強肌醇六磷酸的分解，增加轉化植物的游離磷酸，例如黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸基因(Van Hartingsveldt etal.， 1993Genel27:87)。
[0111](2)可引入降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉米中，例如，這可通過克隆并隨后重新引入與單等位基因相關的DNA來實現，所述單等位基因是以低水平的肌醇六磷酸為特征的玉米突變體的原因(Raboy et al.，1990Maydica35:383)。
`[0112](C)改進的碳水化合物組成，例如通過以編碼可改變淀粉分支模式的酶的基因轉化植物產生。這類酶的實例包括粘液鏈球菌(Streptococcus mucus)果糖基轉移酶基因(Shiroza et al.，1988) J.Bacteriol.170:810、枯草桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖鹿糖酶基因(Steinmetz et al., 1985Mol.Gen.Genel.200:220)、蘚樣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis) a-淀粉酶(Pen et al.，1992Bio/Technologyl0:292)、番爺轉化酶基因(Elliot et al.，1993)、大麥淀粉酶基因(Sogaard et al., 1993J.Biol.Chem.268:22480)和玉米胚乳淀粉分支酶 II (Fisher et al., 1993Plant Physiol.102:1045)。
[0113]關注的核苷酸序列也可以是通過同源重組引入至植物基因組的預定區域的核苷酸序列。現有技術中已經描述了經同源重組將多核苷酸序列整合至植物細胞中特定染色體位點的方法。例如，美國專利申請公開N0.2009/0111188A1中記載的定點整合描述了使用重組酶或整合酶以介導供體多核苷酸序列引入至染色體標靶。此外，國際專利申請N0.W02008/021207描述了鋅指介導的同源重組用于在基因組的特定位置內整合一條或多條供體多核苷酸序列。使用重組酶(例如描述于美國專利N0.6，720，475的FLP/FRT或描述于美國專利N0.5，658，772的CRE/L0X)可以被利用以將多核苷酸序列整合至特定染色體位點中。最后，Puchta et al., PNAS USA93 (1996)pp.5055-5060 描述了使用大范圍核酸酶，用于將供體多核苷酸序列靶向至特定染色體位置。
[0114]用于植物細胞中點特異性整合的方法是公知的且是可應用的(Kumar etal., Trends in Plant Sc1.6 (4) (2001) pp.155-159)。此外，可將已在若干原核生物和低等真核生物中鑒定的點特異性重組系統可以應用于植物中。這類系統的實例包括但不限于來自魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的pSRl質粒的R/RS重組酶系統(Arakiet al.(1985) J.Mol.Biol.182:191-203)和噬菌體 Mu 的 Gin/gix 系統(Maeser andKahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-176)。
[0115]如本文所述，本發明提供了能夠表達關注的基因的載體。一般而言，所述載體在植物細胞中應是有功能的。有時，優選在大腸桿菌(E.coli)中有功能(例如，產生蛋白質用于增加抗體，分析DNA序列，構建插入片段，獲得大量的核酸)的載體。載體和用于在大腸桿菌中克隆和表達的方法被描述于Sambrook et al.(見上文)中。[0116]包括被可操作連接至表達盒中異源核苷酸序列的本發明序列的轉化質粒，也可包括要共轉化至生物中的至少一條其他核苷酸序列。或者，所述其他序列可由另一轉化質粒提供。
[0117]轉化/轉染的方法對于本發明來說不是關鍵的；各種轉化和轉染方法目前都是可用的。隨著新的方法可用于轉化作物或其他宿主細胞，可直接采用這些方法。因此，已經開發了將DNA序列插入至宿主細胞的基因組中以獲得所述序列的轉錄或轉錄本和翻譯以產生表型改變的多種方法。因此，可采用提供有效的轉化/轉染的任何方法。
[0118]本領域技術人員可獲得的用于將表達載體引入至植物組織的方法是不同的，并且取決于所選擇的植物。轉化各種植物種類的方法是公知的，并在文獻中有詳盡描述。參見，例如，Miki et al, “Procedures for Introducing Foreign DNA intoPlants” in Methods in Plant Molecular Biotechnology,見上文:Klein et al, Bio/TechnologylO:268 (1992)；和 Weising et al.，Ann.Rev.Genet.22:421-477 (1988)。例如，可使用以下技術將DNA構建體引入至植物細胞的基因組DNA中:例如微彈介導的遞送，Klein et al., Nature327:70-73 (1987)和 Tomes et al.PlantCell,Tissue&Organ Culture:Fundamental Methods, eds.Gambourg and Phillips (1995)(Springer-Velag, Berlin)，美國專利 4，945，050,5, 879，918 和 5，932，782 ;例如電穿孔，Fromm et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.82:5824 (1985);聚乙二醇(PEG)沉淀，Paszkowskiet al.，EMBO J.3:2717-2722 (1984);直接基因轉移，W085/01856 和 EP N0.0275069 ；體外原生質體轉化，美國專利4，684,611 ;和植物細胞原生質體或胚性愈傷組織的微注射，Crossway, Mol.Gen.Genetics202:179-185 (1985)。當將 DAN 構建體置于雙元載體系統中時，另一選擇是將植物組織與根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)共培養。參見，例如，美國專利 5，591，616、5，563，055 和 5，981，840 ;Ishida et al., “HighEfficiency Transformation of Maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacteriumtumefaciens” Nature Biotechnologyl4:745-750 (1996)。當細胞被根癌土壤桿菌感染時，所述細菌宿主的毒力作用會指導所述構建體插入到植物細胞DNA中。參見，例如，Horsch et al.，Science233:496-498(1984)，和 Fraley et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.80:4803 (1983)。使用病毒或病毒核酸和使用病毒DAN分子和RNA分子的病毒復制系統是已知的。參見，例如，美國專利6，660，500,6, 462，255,5, 889，190和5，889，101。
[0119]轉化油菜的標準方法被描述于Moloney et al.“High EfficiencyTransformation of Brassica napus using Agrobacterium Vectors” Plant CellReports8:238-242 (1989)中。Fromm et al, Bio/Technology8:833 (1990) Gordon-Kammet al (見上文)描述了玉米轉化。土壤桿菌屬(Agrobacterium)主要用于雙子葉植物中，但是一些單子葉植物可用土壤桿菌屬來轉化。參見上文和美國專利5，550，318。水稻轉化被描述于 Hiei et al., “Efficient Transformation of Rice (Oryza sativa L.) Mediatedby Agrobacterium and Sequence Analysis of the Boundaries of the T_DNA，，The PlantJournal6(2):271-282 (1994)> Christou et al, Trends in BiotechnologylO:239 (1992)和 Lee et al, Proc.Nat ‘I Acad.Sc1.USA88:6389 (1991)中。小麥可通過與轉化玉米或水稻所用的技術類似的技術來轉化。高粱轉化被描述于Casas et al (見上文),和Wanet al, Plant Physiol.104:37 (1994)中。大豆轉化被描述于許多出版物中，包括美國專利5，015，580。棉花轉化被描述于美國專利5，004，863 ;美國專利；Christou, (1992)PlantJournal Vol.2 (3) 275-281Kumar et al.(2004) Plant Mol.Biol.56，203-216 中。
[0120]在一個優選的方法中，可采用氣溶膠束技術，用于將核苷酸序列引入至細胞內。氣溶膠束技術利用惰性氣體經過小口(orifice)從較高氣體壓力區域傳向較低氣體壓力區域時所述氣體的射流彭脹(jet expansion)。膨脹氣體可加快含有待引入細胞或組織的分子的氣溶膠微滴。僅僅由于所述氣溶膠微滴獲得的速度，該小體積的氣溶膠微滴中攜帶的DNA可透入細胞。通過本發明的氣溶膠束法達到的速度是超音速的，可達到2000米/秒。在優選的實施方案中，所述方法包括(I)培養細胞源，(II)任選地，預處理細胞以獲得組織，所述組織通過氣溶膠束技術具有提高的攝取和整合的能力，(III)通過本發明的氣溶膠束方法以外源核苷酸序列轉化所述組織，(IV)任選地，鑒定或選擇轉化的組織，(V)任選地，從所轉化的細胞或組織中再生轉基因植物，和(VI)任選地，產生所述轉基因植物的子代。該方法被詳細地描述于Held et al.，美國專利6，809，232,7, 067，716和7，026，286中。
[0121]下文以示例的方式提供，不是意欲限制本發明的范圍。
[0122]實施例1優化的2mEPSPS v2編碼核苷酸序列
[0123]來自玉米編碼區的2mEPSPS vl的DNA序列的分析揭示了被認為對優化的植物表達有害的若干序列基序的存在情況，以及雙子葉植物中用于表達的非最優的密碼子組成。因此，本發明完成了植物優化的編碼2mEPSPS v2的基因的設計，以產生可在雙子葉植物和單子葉植物中優化表達的DNA序列，并且其中所述序列修飾不阻礙翻譯或造成mRAN不穩定。
[0124]由于遺傳密碼的冗余和簡并(例如一些氨基酸由多于一種密碼子指定)所給予的可塑性，不同生物或生物種類中基因組的進化已經導致了同義密碼子的差異選擇。該“密碼子偏好”反映在蛋白編碼區的平均堿基組成中。例如，基因組具有相對低的G+C含量的生物會使用更多在同義密碼子第三位上為A或T的密碼子，而具有較高G+C含量的生物使用更多在第三位上為G或C的密碼子。此外，現認為，mRNA中存在“稀有”密碼子可降低該mRNA的絕對翻譯速率，尤其當對應于所述稀有密碼子的負載tRNA的相對豐度低的時候。該推理的延伸是，對于 多個稀有密碼子來說，由單個稀有密碼子引起的翻譯速率的降低至少會是累加的。因此，具有高稀有密碼子相對含量的mRNA會相應具有低的翻譯速率。該速率可相應由低水平的編碼蛋白所反映。
[0125]在設計用于在雙子葉植物(例如棉花、油菜、煙草)尤其是大豆以及單子葉植物(例如水稻、玉米或小麥)中表達的編碼2mEPSPS的基因中，確定潛在宿主植物的密碼子偏好是有用的。存在多個公眾可用的DNA序列數據庫，其中可找到關于植物基因組的密碼子分布或多種植物基因的蛋白編碼區的密碼子分布的信息。密碼子偏好是植物用于編碼其蛋白質的氨基酸的密碼子的統計分布。雙子葉植物和單子葉植物(玉米)優先的密碼子選擇示于表I中。
[0126]表1.單子葉植物(玉米％)和雙子葉植物(雙子葉植物％)基因的編碼區的同義密碼子表示示于D列、E列、I列和J列中。為植物優化的合成基因設計設定的偏好平衡的密碼子表不的值不于C列和H列中。
[0127]`
【權利要求】
1.一種編碼5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)的核酸分子，所述核酸分子包括選自以下的核酸序列:
a)SEQID NO:5 ； b)包括SEQID NO:5的完全互補物的核酸分子； c)具有與全長SEQID NO:5至少86%同一性的核酸分子； d)具有與全長SEQID NO:5至少90%同一性的核酸分子；和 e)具有與全長SEQID NO:5至少95%同一性的核酸分子。
2.一種編碼5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)的核酸分子，所述核酸分子包括 SEQ ID NO:5。
3.一種構建體，所述構建體包括選自以下的核酸序列:
a)SEQID NO:5 ； b)包括SEQID NO:5的完全互補物的核酸分子； c)具有與全長SEQID NO:5至少86%同一性的核酸分子； d)具有與全長SEQID NO:5至少90%同一性的核酸分子；和 e)具有與全長SEQID NO:5至少95%同一性的核酸分子。
4.一種載體,所述載體包括至少一種權利要求3的構建體。
5.一種植物細胞，所述植物細胞包括選自以下的核酸序列:
a)SEQID NO:5 ； b)包括SEQID NO:5的完全互補物的核酸分子； c)具有與全長SEQID NO:5至少86%同一性的核酸分子； d)具有與全長SEQID NO:5至少90%同一性的核酸分子；和 e)具有與全長SEQID NO:5至少95%同一性的核酸分子。
6.權利要求5的植物細胞，其中所述植物細胞是大豆植物細胞。
7.一種植物，所述植物包括選自以下的核酸序列
a)SEQID NO:5 ； b)包括SEQID NO:5的完全互補物的核酸分子； c)具有與全長SEQID NO:5至少86%同一性的核酸分子； d)具有與全長SEQID NO:5至少90%同一性的核酸分子；和 e)具有與全長SEQID NO:5至少95%同一性的核酸分子。
8.權利要求7的植物，其中所述植物是大豆植物。
9.權利要求7的植物，其中所述植物因表達所述核酸分子而抗草甘膦。
10.權利要求9的植物，還包括編碼可提供第二除草劑抗性的多肽的第二核酸分子。
11.一種產生對暴露于膦酰甲基甘氨酸除草劑有增強抗性的植物的方法，所述方法包括 a)將編碼5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)的核酸分子引入至所述植物中，所述核酸分子包括選自以下的核酸序列:
.1.SEQ ID NO:5 ； i1.包括SEQID NO:5的完全互補物的核酸分子； ii1.具有與全長SEQID NO:5至少86%同一性的核酸分子；iv.具有與全長SEQ ID NO:5至少90%同一性的核酸分子；和 V.具有與全長SEQ ID NO:5至少95%同一性的核酸分子；和 b)產生與不含所述核酸分子的植物相比，對暴露于膦酰甲基甘氨酸除草劑有增強抗性的植物。
12.權利要求11的方法，其中所述植物是大豆植物。
13.—種選擇性抑制植物生長的方法，所述方法包括: a)播種種子，至少一個所述種子包括編碼5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)的核酸分子，所述核酸分子包括選自以下的核酸序列:
1.SEQ ID NO:5 ； i1.包括SEQID NO:5的完全互補物的核酸分子； ii1.具有與全長SEQID NO:5至少86%同一性的核酸分子； iv.具有與全長SEQID NO:5至少90%同一性的核酸分子；和 V.具有與全長SEQ ID NO:5至少95%同一性的核酸分子；以及 b)從所述種子中長出植物，將所述種子或植物暴露于草甘膦除草劑，使得不包括所述核酸分子的任何的所述植物或種子的生長被抑制。
14.一種選擇轉化的植物細胞的方法，所述方法包括: a)以核酸分子轉化植物細胞群，所述核酸分子包括選自以下的核酸序列:
1.SEQ ID NO:5 ； i1.包括SEQID NO:5的完全互補物的核酸分子； ii1.具有與全長SEQID NO:5至少86%同一性的核酸分子； iv.具有與全長SEQID NO:5至少90%同一性的核酸分子；和 V.具有與全長SEQ ID NO:5至少95%同一性的核酸分子；以及 b)將所述植物細胞群暴露于草甘膦除草劑，使得不包括所述核酸分子的植物細胞的生長被抑制。
15.一種檢測植物是否包括可賦予增強的對草甘膦除草劑的抗性的核酸序列的方法，所述方法包括從所述植物收集樣品并對所述樣品測定選自以下的核酸序列的存在情況:
1.SEQ ID NO:5 ； i1.包括SEQID NO:5的完全互補物的核酸分子； ii1.具有與全長SEQID NO:5至少86%同一性的核酸分子； iv.具有與全長SEQID NO:5至少90%同一性的核酸分子；和 V.具有與全長SEQ ID NO:5至少95%同一性的核酸分子。
16.權利要求5的植物細胞，所述植物細胞還包括至少一個第二核酸分子，與不含所述至少一個第二核酸分子的植物相比，所述第二核酸分子編碼可賦予增強的選自如下的除草劑抗性的多肽:a -酮戊二酸依賴性雙加氧酶(AAD-12)、羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPH))、乙酰乳酸合酶(ALS)、初卟啉原氧化酶(PPO)、dicambia、草銨膦、草丁膦、biapholos和PSII。
17.權利要求16的植物細胞，所述植物細胞還包括至少一個第三核酸分子，與不含所述至少一個第二核酸分子的植物相比，所述第三核酸分子編碼可賦予增強的選自如下的除草劑抗性的多肽:a -酮戊二酸依賴性雙加氧酶(AAD-12)、羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPH))、乙酰乳酸合酶(ALS)、初卟啉原氧化酶(PPO)、dicambia、草銨膦、草丁膦、biapholos和PSII。
18.權利要求11的方法，還包括將所述至少一個第二核酸分子引入至所述植物中，與不含所述至少一個第二核酸分子的植物相比，所述第二核酸分子編碼可賦予增強的選自如下的除草劑抗性的多肽:a-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(AAD-12)、羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPH))、乙酰乳酸合酶(ALS)、初卟啉原氧化酶(PPO)、dicambia、草銨膦、草丁膦、biapholos和 PSII。
19.權利要求18的方法，還包括將至少一個第三核酸分子引入至所述植物中，與不含所述至少一個第二核酸分子的植物相比，所述第三核酸分子編碼可賦予增強的選自如下的除草劑抗性的多肽:a -酮戊二酸依賴性雙加氧酶(AAD-12)、羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPH))、乙酰乳酸合酶(ALS)、初卟啉原氧化酶(PPO)、dicambia、草銨膦、草丁膦、biapholos和PSI1
20.權利要求13的方法，其中至少一個包括所述核酸分子的所述種子還包括至少一個第二核酸分子，與不含所述至少一個第二核酸分子的植物相比，所述第二核酸分子編碼可賦予增強的選自如下的除草劑抗性的多肽:a -酮戊二酸依賴性雙加氧酶(AAD-12)、羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPH))、乙酰乳酸合酶(ALS)、初卟啉原氧化酶(PPO)、dicambia、草銨膦、草丁膦、biapholos和PSII，并且將所述種子或植物暴露于所述除草劑。
21.權利要求20的方法，其中將所述種子或植物相繼或同時暴露于所述草甘膦和所述除草劑。
22.權利要求20的方法，其中至少一個包括所述核酸分子和所述至少一個第二核酸分子的所述種子還包括至少一個第三核酸分子，所述第三核酸分子編碼可賦予增強的選自如下的除草劑抗性的多肽:a-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(AAD-12)、羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPH))、乙酰乳酸合酶(ALS)、初卟啉原氧化酶(PPO)、dicambia、草銨膦、草丁膦、biapholos和PSII,并且將所述種子`或植物暴露于所述除草劑。
【文檔編號】C12N15/82GK103562392SQ201180066871
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2011年11月23日 優先權日:2010年12月3日
【發明者】B·赫爾德, V·塞凱爾, T·賴特, S·拉塞爾 申請人:Ms技術有限責任公司