專利名稱：新城疫病毒重組疫苗a-ndv-lx/i4及構建方法
技術領域：
本發明涉及應用反向遺傳技術和免疫學技術，產生一種表達基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，用于制造疫苗。
背景技術：
反向遺傳操作技術(Reverse genetics manipulation technique)是指在體夕卜通過構建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉錄成cDNA，在DNA分子水平上對其進行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒的一項研究技術[Neumann G, Whitt M A, Kawaoka Y. Adecade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA-what have we learned ？ Journal of General Virology, 2002,83 (11) J635-2662.]，也叫全長感染性cDNA克隆技術，又常被稱為“病毒拯救”。由于最終“拯救”出的RNA病毒來源于cDNA克隆，因此，可通過中間過程中人為加入的DNA環節，在DNA水平上對RNA病毒基因組進行各種體外人工操作，如進行基因突變、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置換和基因互補(即構建嵌合病毒)等改造，解決了對RNA病毒基因組難以操作這一難題，極大地方便了人們進行病毒各基因的功能、致病機理和病毒病防制策略的研究，同時為新型疫苗的研制和開發提供了新的思路[Huang， Ζ. , Elankumaran, S. , Panda, A. & Samal, S. K. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. Poultry Science，2003，82 :899-906. ]。 0 ;) (Newcastle disease virus, NDV)是新城疫(ND)的病原體。ND是雞的高度接觸性傳染病，可引起雞100%發病和死亡。新城疫病毒在分類上屬單鏈負股RNA病毒目(Mononegavirales)， 副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)的禽腮腺炎病毒屬 (Avulavirus)的成員。病毒有囊膜，基因組為單股、負鏈、不分節段的RNA病毒，基因組結構模式為3' -NP-P-M-F-HN-L-5'，依次編碼6種結構蛋白核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、 基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白 (NP)，P，M，F，HN和L蛋白。另外兩個蛋白，V和W蛋白由P基因編輯后表達[Alexander JA. Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses. In Swayne, D., Glisson, J. R. , Jackwood, M. W. , Pearson, J. Ε. , Reed, W. M. (Eds. ). A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, fourth ed American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA 1998.]。根據對雞的毒力，NDV毒株可以為強毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic) 和弱毒(Lentogen)。已開展廣泛的試驗來闡明病毒致病性的分子決定因素[Huang Z，Krishnamurthy S，Panda A，Samal SK. Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist. Journal of virology，2003，77 (16) :8676-8685.]。大部分研究是關于 F和 HN 蛋白對致病性的作用，研究結果一致認為F蛋白裂解位點處的氨基酸序列是病毒毒力的主要決定因素[Seal BS. Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of thefusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle disease virus isolates. Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based on attachment glycoprotein sequences.Funct Integr Genomics，2004，4(4) 246-257.]。NDV毒力差異的分子基礎主要決定于FO蛋白的蛋白酶裂解位點的氨基酸序列，強毒的裂解位點有聚堿性氨基酸序列，其模式基序為112GR/K-R-Q-K/R-R-F117 ；弱毒的裂解位點則缺少聚堿性氨基酸序列，其模式基序為112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。在感染過程中，NDV HN蛋白首先與敏感細胞表面的唾液酸受體結合，這種結合作用可以引起吸附蛋白HN和融合蛋白F構象發生變化；于是后者的融合肽被釋放出來，使病毒的包膜與細 IfiII^^ffi^ [McGinnes, L. W. ， Sergei, Τ. ， Chen, H. ， Hamo, L. ， Schwertz, S. ， Li, D. & Morrison, Τ. G. Mutational Analysis of the Membrane Proximal Heptad Repeat of the Newcastle Disease Virus Fusion Protein. Virology, 2001, 289 :343-352.],強毒 F 蛋白的裂解位點為多個堿性氨基酸連續排列，可被機體多個組織器官的多種蛋白酶裂解， 因此，可導致全身性感染。弱毒株在該區域的堿性氨基酸則被中性氨基酸所代替，使相應序列由 r/k112-r-q-k/r115-r-l117 變為 g/e112-r-q-g/e115-r-l117，這種 f 蛋白前體僅能被有限的組織或器官分泌的胰樣蛋白酶裂解，感染性很低或無感染性。因此，F蛋白是NDV毒力和致病性的主要決定因素[Peeters, B. P.，de Leeuw, 0. S.，Koch, G. & Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA :Evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. Journal of Virology, 1999,73(6) :5001-5009.]。不少研究已經通過反向遺傳技術將弱毒株F蛋白裂解位點突變成強毒株的裂解位點而使弱毒株變成了強毒株，這已被這些重組病毒的致病性試驗結果所證實；反之亦然。然而關于HN蛋白對毒力的作用的結果還沒有定論。在一些試驗中，弱毒骨架中插入編碼強毒HN蛋白的嵌合體病毒致病性有了明顯增加，例如根據MDT 和ICPI指標判斷重組病毒的致病性從弱毒增強為中等毒力；而在另一些試驗中用相同的試驗方法，在弱毒的骨架中置換強毒HN蛋白，但是重組病毒的毒力沒有上升[de Leeuw OS, Koch G，Hartog L，Ravenshorst N，Peeters BP. Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion protein and by both the stem region and globular head of the haemagglutinin—neuraminidase protein.The Journal of general virology, 2005,86 (Pt 6) : 1759-1769.]。有人認為，弱毒 ND 病毒載體骨架用于構建重組病毒，很難提供合適的表達強毒HN蛋白基因的全部信息[Estevez C， King D，Seal B，Yu Q. Evaluation of Newcastle disease virus chimeras expressing the Hemagglutinin-Neuraminidase protein of velogenic strains in the context of a mesogenic recombinant virus backbone. Virus research，2007，129(2) :182-190.]。
自1擬6年發現新城疫(ND)以來，ND已發生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出現，尤其是90年代之后出現了新的基因VII型NDV，給我國的養禽業造成了巨大的經濟損失。在控制疫病的過程中，使用疫苗是最有效最經濟的方法，新城疫的疫苗已使用了幾十年，由于ND疫苗的廣泛使用，此病已基本上得到了較好的控制，但是臨床上非典型ND的發生十分普遍，ND仍然成為威脅養禽業的主要疾病之一，也就是說，常規的疫苗對于NDV強毒的攻擊并不能提供理想的保護。從近十年來的ND流行特點來看， 臨床上所分離到的NDV毒株大多數屬于基因VII型[Liu XF, Wan HQ, Ni XX，Wu YT & LiuWB. Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastle disease isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001. Archives of Virology, 2003,148(7) : 1387-1403.]，而常規的 ND 疫苗株的基因型主要為I和II型(如V4、LaSota等)，因此，在遺傳距離上當前NDV分離株與常規ND疫苗株相差較遠。2000年黃勇等在發病的鵝群中，成功分離到了基因VII型新城疫強毒ZJl株， 并進行了全基因組測序，登錄號為AF431744[Huang Y，Wang HQ, Liu H Q, Wu YT & Liu XF. Genomic sequence of an isolate of Newcastle disease virus isolated from an out break in geese -.a novel six nucleotide insertion in the non-coding region of the nucleoprotein gene. Archives of Virology, 2004,149 :1445-1457.]。在此基礎上， 2005年胡順林等建立了 NDV強毒株的反向遺傳操作平臺，成功拯救出了鵝源強毒ZJl株，并對該毒株進行了致弱，但是獲救病毒的EID5tl和HA效價均較低，不適合于大規模的生產[胡順林，孫慶，吳艷濤，劉秀梵.用反向遺傳技術致弱基因VIId型鵝源新城疫病毒ZJl株.微生物學報，2007，47 O) :197-200. ] οHuang等人分別以弱毒株LaSota和強毒株Beaudette C(BC)為骨架，通過HN基因置換而構建了兩株重組嵌合病毒 rlaSoBCHN 和 rBCLaSoHN[Huang Ζ, Elankumaran S, Yunus AS,Samal SK. A recombinant Newcastle disease virus (NDV) expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus (IBDV)protects against NDV and IBDV. Journal of virology, 2004, 78 (18) :10054-10063. ]。rIaSoBCHN 是用弱毒株 LaSota 的 HN 置換了骨架病毒BCHN的重組嵌合病毒。致病性試驗結果表明，rlaSoBCHN的毒力比骨架病毒有顯著上升，而rBCLaSoHN的毒力比骨架病毒有明顯下降，而且重組嵌合病毒的組織嗜性與HN的來源有關，這說明HN是影響NDV毒力的一個重要決定因子[Huang Ζ, Elankumaran S，Panda A, Samal SK. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. Poultry science, 2003,82 (6) :899-906.]。但是 Wakamatsu 等人用 BC 強毒株的 HN 置換 LaSota 骨架病毒而得到的重組嵌合病毒，其致病指數或對雞致病的嚴重程度與LaSota相比均未改變 [Wakamatsu N, King DJ, Seal BS, Samal SK, Brown CC. The pathogenesis of Newcastle disease :a comparison of selected Newcastle disease virus wild-type strains and their infectious clones. Virology, 2006, 353 (2) :333-343. ]。Estevez 等人以中毒株 Anhinga為骨架病毒，用嗜內臟和嗜神經強毒株的HN進行置換而得到的重組嵌合病毒，其毒力與骨架病毒相比也沒有發生明顯改變[Estevez C，King D, Seal B, Yu Q. Evaluation of Newcastle disease virus chimeras expressing the Hemagglutinin-Neuraminidase protein of velogenic strains in the context of a mesogenic recombinant virus backbone. Virus research,2007,129(2) :182-190.]。NDV/LX株是我們從健康雞群中分離到的一株NDV弱毒。初步研究表明，NDV/ LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的復制，誘導產生高滴度的特異抗體和粘膜免疫應答。NDV/LX病毒的ICPI值為0. 12，MDT為110h，按照OIE標準測得HA效價 10. 51og2。基因VII型強毒分離株JS-5-05-GO分離自發病鴨群，其F和HN基因序列號分別為EU044798、EU044816，其ICPI和MDT分別是1. 91和46小時，HA效價平均為81og2。
發明內容
本發明的第一個目的在于發明一種表達基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗， 從而解決當前所用疫苗株與流行株基因型不一致的問題。本發明表達基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，于2010年5 月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC NO 3844。本發明的第二個目的在于發明一種表達基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗 A-NDV-LX/14的構建方法本發明在建立雞源新城疫病毒NDV/LX株(CGMCC NO :3843)的反向遺傳操作平臺基礎上，將中國主要流行的NDV基因VII型分離株JS-5-05-GO的囊膜糖蛋白基因F基因的強毒裂解位點裂解為弱毒位點，再將JS-5-05-GO的致弱的囊膜糖蛋白基因F基因和HN基因片段與NDV/LX株基因組的對應部分進行替換，拯救構建出致弱的表達基因VII型F和HN 重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4。本發明利用反向遺傳技術成功拯救出了基因I型骨架替換上基因VII型流行毒株 JS-5-05-GO致弱的F基因和HN基因，該病毒具有弱毒和在雞胚上具有較高的繁殖滴度的特性，適合于疫苗的大規模生產，另外，該重組致弱毒株A-NDV-LX/I4的F蛋白和HN蛋白為基因VII型與當前我國NDV流行株的基因型相一致，因此，同常規疫苗(基因I和II型)相比，重組致弱毒株A-NDV-LX/I4在控制當前新城疫的發病和流行方面顯示出了廣闊的應用前景。本發明所述新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4的構建方法如下1)構建重組質粒pA-NDV-LX/I4，構建含有分離株NDV/LX的F基因和HN基因的質粒pLI4，將分離株JS-5-05-GO致弱的F基因和HN基因替換到質粒pLI4上，用Ml I和Spe I將質粒mThl上的酶切片段替換到質粒pLI4中，獲得質粒FP ；將質粒FP上裂解位點突變的F基因和HN基因替換NDV/LX株基因組的對應部分，獲得質粒pA_NDV_LX/I4 ；2)重組致弱毒株A-NDV-LX/I4的拯救，將質粒PA-NDV-LX/I4與表達NDVZJl毒株 NP、P和L基因的pCI-NP、pCI-P和pCI_L三個真核表達質粒共轉染BSR-T7/5細胞，轉染 18h后加入終濃度為10%的SPF雞胚尿囊液，轉染60h后將轉染樣品接種9 11日齡SPF 雞胚，即獲得表達基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4 ；3)重組致弱毒株A-NDV-LX/I4的免疫保護效率的測定，將A-NDV-LX/I4株與骨架病毒 NDV/LX、供體病毒 JS-5-05-Go 株[Hu, ZL, Hu, SL, Meng C, Wang, XQ, Zhu, J, Liu, XF. Generation of a genotype VII Newcastle disease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs. " Aviandiseases 55(3) :391-397.)]禾口常規疫苗株進行免疫保護效率的比較。經過囊膜糖蛋白基因的替換和F基因裂解位點的突變，成功拯救出一株毒價高且高度致弱的表達基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4株。經試驗表明本發明構建的致弱病毒A-NDV-LX/I4免疫試驗雞兩周后，雞血清HI 的平均效價為27 ；La Sota免疫組攻毒4天后，SPF雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為10%和30% ；商品雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為40%和 20% ；V4免疫組攻毒4天后，SPF雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為30%和10% ；商品雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為30%和20%，上述病毒的分離率均顯著高于A-NDV-LX/I4免疫組，從而證明與常規疫苗相比，重組弱毒疫苗能夠提供更加堅實的免疫保護效率。
圖1NDV/LX株全長克隆prLX構建模式圖。圖2重組質粒ρ LI4構建模式圖。圖3F蛋白裂解位點突變模式圖。圖4重組質粒pA-NDV-LX/I4構建模式圖。
具體實施例方式本發明表達基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，于2010年5月 19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO :3844.實施例一、NDV/LX株全長克隆prLX構建。構建模式如圖1所示。步驟一 NDV/LX株的獲得從健康家禽腸道分離到一批新城疫病毒弱毒株，對其生物學特性血凝價、ICPI、 EID50進行分析，在這些弱毒株中篩選出血凝價高、復制能力強的疫苗候選株；并對候選株進行免疫原性分析，免疫2周齡SPF雞，免疫后測定血清中抗新城疫病毒的效價以及消化道和呼吸道粘膜免疫水平，最終獲得能在呼吸道和消化道很好的復制，誘導產生高滴度的特異抗體和粘膜免疫應答的新城疫弱毒株NDV/LX (基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株)。通過EID50 測定，獲得 IO8'7EID50/0. ImL NDV/LX 病毒，ICPI 值為 0. 12，MDT 為 IlOh0本發明基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株，于2010年5月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為=CGMCC NO :3843.步驟二 NDV/LX株基因組的修飾設計8對引物用于擴增NDV/LX株基因組全長序列，并進行測序，每個片段大小約 2000bp左右，引物序列如下CN 102533676 A
權利要求
1.新城疫病毒重組疫苗A-NDV-LX/I4，它的保藏號是CGMCC NO :3844。
全文摘要
本發明涉及一種表達基因VII型F和HN重組新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，它的保藏號是CGMCCNO3844。本發明構建的致弱病毒A-NDV-LX/I4免疫試驗雞兩周后，雞血清HI的平均效價為27；LaSota免疫組攻毒4天后，SPF雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為10%和30%；商品雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為40%和20%；V4免疫組攻毒4天后，SPF雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為30%和10%；商品雞喉氣管和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為30%和20%，與常規疫苗相比，本發明重組弱毒疫苗能夠提供更加堅實的免疫保護效率。
文檔編號C12N7/01GK102533676SQ20121000069
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月4日 優先權日2012年1月4日
發明者劉慧謀, 劉文博, 劉曉文, 劉秀梵, 王曉泉, 胡順林 申請人:揚州大學