專利名稱：一種多孔殼聚糖支架的制備方法
技術領域：
本發明屬于多孔材料材料制備領域，特別涉及一種多孔殼聚糖支架的制備方法。
背景技術：
目前，無論是實驗室還是工業生產上，所使用的細胞培養微載體主要是實心 Cytodex系列的載體，且屬于單層單層培養方式。而在體內，組織和細胞的生長發育過程是在三維立體的內環境條件下進行的，細胞和細胞基質以及細胞之間的相互信號傳遞對于調解細胞的增殖、分化有著重要影響，常規的體外單層培養方法不能提供組織正常生長發育所需的三維環境條件，因而制備三維多孔支架就具有十分重要的意義。近年來，在貼壁性細胞懸浮培養的研究領域，殼聚糖支架材料的研究非常廣泛。然而，其制備方法往往僅限于常用的冷凍干燥法。傳統的冷凍干燥法制備出的殼聚糖支架在可塑性能、微觀結構及孔與孔之間的連通性均難以滿足細胞培養的技術研究領域的要求。 因此本領域迫切需要提供一種微觀結構均勻、易成型、孔與孔之間連通性較好的多孔殼聚糖支架材料。
發明內容
本發明的目的是為了解決上述的技術問題而提供一種多孔殼聚糖支架的制備方法。本發明的技術方案
一種多孔殼聚糖支架的制備方法，即以殼聚糖為原料，以氯化銨為致孔劑，配制溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液；
然后對溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液進行第一次冷凍干燥得到含有氯化銨的殼聚糖支架，并將其浸泡在NaOH溶液中，使氯化銨與NaOH反應生成氨氣來制孔得到殼聚糖支架；
最后將殼聚糖支架進行第二次冷凍干燥，以增大殼聚糖支架的孔隙率和孔與孔之間的連通性，最終得到的一種多孔殼聚糖支架。上述的一種多孔殼聚糖支架的制備方法，具體包括如下步驟 (1)、溶液的配制
①、配制溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液
先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液，稱取 0.2g氯化銨，加入1% (V/V)醋酸溶液中攪拌均勻后，再稱取3. Og殼聚糖，加入溶有氯化銨的1% (V/V)醋酸溶液中即可;
②、配制1%(ν/ν)戊二醛溶液
量取Iml純戊二醛并加蒸餾水定容至100ml，4°C保存備用；
③、配制5%的硼氫化鈉溶液
稱取5. Og的硼氫化鈉加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氫化鈉溶液；
④、配制10%(W/V)氫氧化鈉溶液稱取10. Og氫氧化鈉，加入IOOml的蒸餾水中即可；(2)、第一次冷凍干燥量取0. 4ml步驟(1)中所得的1%(ν/ν)戊二醛溶液，并加入到IOOml步驟(1)中的溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液中，攪拌5min后，將攪拌后的溶液涂抹到模具上，靜置過夜，然后將溶液注入模具中進行冷凍干燥，得到含有氯化銨的殼聚糖支架； 上述的冷凍干燥過程控制 預凍溫度為_75°C，預凍時間為30min ； 一次干燥的隔板溫度為_25°C，時間為Mh ；(3)、第二次冷凍干燥將步驟(2)中的含有氯化銨的殼聚糖支架浸泡到10% (W/V)氫氧化鈉溶液中，浸泡 20min后，用去離子水反復清洗支架3次，用5%的硼氫化鈉除去游離的戊二醛，再用大量的去離子水洗滌后得到殼聚糖支架；再對所得的殼聚糖支架進行冷凍干燥，最終得到多孔殼聚糖支架； 上述的冷凍干燥過程控制 預凍溫度為_60°C，預凍時間為35min ； 一次干燥的隔板溫度為-20°C，時間為17h ； 二次干燥的隔板溫度為10°C，時間為1. 5-池。
上述的多孔殼聚糖支架的制備過程中先對溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液進行第一次冷凍干燥得到含有氯化銨的殼聚糖支架，然后將含有氯化銨的殼聚糖支架浸泡在NaOH 溶液中，使氯化銨與NaOH反應生成氨氣來制孔得到殼聚糖支架，并且還可以除去殼聚糖支架中多余的醋酸，因為氫氧化鈉可以與醋酸起中和反應，最后再對殼聚糖支架進行第二次冷凍干燥，以增大殼聚糖支架的孔隙率和孔與孔之間的連通性，最終得到多孔殼聚糖支架。
另外，通過調整氯化銨的濃度和殼聚糖溶液的濃度，從而調整所得的多孔殼聚糖支架的孔隙結構；即制備過程中氯化銨的濃度會影響其與氫氧化鈉反應時產生氣體的量， 一般氯化銨的濃度越高，產生的氨氣越多，孔隙率就越高，但是過多的氣體含量，會造成支架的機械強度降低，因而本發明中0. 2g氯化銨的含量為最佳。在進行凍干時是以水做致孔劑的，因而殼聚糖溶液的濃度會影響支架中水的相對含量，一般是水的相對含量越高，制得的孔就越多，但水的相對含量越高，則殼聚糖的相對含量就越低，這會使支架的機械強度降低，因而本發明以3g殼聚糖的含量最佳。
最終得到的多孔殼聚糖支架的孔徑為20-60 μπι，孔隙率為90%，且孔與孔之間的連通性好，可用于細胞培養的技術研究。
本發明的技術效果本發明的一種多孔殼聚糖支架的制備方法，由于采用冷凍干燥法和氯化銨制孔技術相結合的方法，即先配置溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液，形成均相溶液，進行緩慢凍干，同時由冰晶升華來制孔，然后將含有氯化銨的殼聚糖支架浸泡在NaOH溶液中，使氯化銨與NaOH反應生成氨氣來制孔，并且還可以除去支架中多余的醋酸后得到殼聚糖支架，然后再對所得的殼聚糖支架進行第二次冷凍干燥，以增大殼聚糖支架的孔隙率和孔與孔之間的連通性。 因此本發明的多孔殼聚糖支架不僅克服了傳統制備殼聚糖支架孔隙率低，連通性差的缺點，并且由于分別進行兩次完整的冷凍干燥，來調整孔隙結構，從而得到孔隙率高，連通性好的多孔殼聚糖支架。另外，由于采用酸性致孔劑氯化銨來制備的多孔殼聚糖支架，所得的多孔殼聚糖支架易于成型，孔隙率高，孔與孔之間的聯通性好。
圖1是本發明所得的多孔殼聚糖支架的掃描電鏡圖片。
具體實施例方式下面通過實施例并結合附圖本發明進一步說明，但并不限制本發明。本發明所用的所有試劑均為醫藥純，均來自上海國藥集團；
本發明冷凍干燥所用的設備凍干機，型號為ES，儀器名字為Advantage PLUS冷凍型干燥機，生產廠家為美國Virtis公司；
本發明所用的掃描電鏡為Quanta x50系列掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)。實施例1
一種多孔殼聚糖支架的制備方法，包括如下步驟
(1)、溶液的配制
①、配制溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液
先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液，稱取 0.2g氯化銨，加入1% (V/V)醋酸溶液中攪拌均勻后，再稱取3. Og殼聚糖，加入溶有氯化銨的1% (V/V)醋酸溶液中即可;
②、配制1%(ν/ν)戊二醛溶液
量取Iml純戊二醛并加蒸餾水定容至100ml，4°C保存備用；
③、配制5%的硼氫化鈉溶液
稱取5. Og的硼氫化鈉加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氫化鈉溶液；
④、配制10%(W/V)氫氧化鈉溶液
稱取10. Og氫氧化鈉，加入IOOml的蒸餾水中即可；
(2)、第一次冷凍干燥
量取0. 4ml步驟(1)中所得的1%(ν/ν)戊二醛溶液，并加入到IOOml步驟(1)中的溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液中，攪拌5min后，將攪拌后的溶液涂抹到模具上，靜置過夜，然后將溶液注入模具中進行冷凍干燥得到含有氯化銨的殼聚糖支架； 上述的冷凍干燥過程控制 預凍溫度為_75°C，預凍時間為30min ； 一次干燥的隔板溫度為_25°C，時間為Mh ；
(3)、第二次冷凍干燥
將步驟(2)中所得的含有氯化銨的殼聚糖支架浸泡到10% (W/V)氫氧化鈉溶液中，浸泡20min后，用去離子水反復清洗支架3次，用5%的硼氫化鈉除去游離的戊二醛，再用大量的去離子水洗滌后得到殼聚糖支架；
再對所得的殼聚糖支架進行冷凍干燥，最終得到一種多孔殼聚糖支架；上述的冷凍干燥過程控制 預凍溫度為_60°C，預凍時間為35min ； 一次干燥的隔板溫度為-20°C，時間為17h ； 二次干燥的隔板溫度為10°C，時間為1. 5-池。
上述所得的一種多孔殼聚糖支架經掃描電鏡進行掃描，結果見圖1，從圖1中可以看出多孔殼聚糖支架的表面有許多孔，且孔徑為20-60 LUn孔與孔之間的連通性較好，測得的多孔殼聚糖支架的孔隙率高達90%。
上述內容僅為本發明構思下的基本說明，而依據本發明的技術方案所作的任何等效變換，均應屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種多孔殼聚糖支架的制備方法，其特征在于以殼聚糖為原料，以氯化銨為致孔劑， 配制溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液；然后對溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液進行第一次冷凍干燥得到含有氯化銨的殼聚糖支架，并將其浸泡在NaOH溶液中，使氯化銨與NaOH反應生成氨氣來制孔得到殼聚糖支架；最后將殼聚糖支架進行第二次冷凍干燥，以增大殼聚糖支架的孔隙率和孔與孔之間的連通性，最終得到的一種多孔殼聚糖支架。
2.如權利要求1所述的一種多孔殼聚糖支架的制備方法，其特征在于具體包括如下步驟(1)、溶液的配制①、配制溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液，稱取 0.2g氯化銨，加入1% (V/V)醋酸溶液中攪拌均勻后，再稱取3. Og殼聚糖，加入溶有氯化銨的1% (V/V)醋酸溶液中即可;②、配制1%(ν/ν)戊二醛溶液量取Iml純戊二醛并加蒸餾水定容至100ml，4°C保存備用；③、配制5%的硼氫化鈉溶液稱取5. Og的硼氫化鈉加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氫化鈉溶液；④、配制10%(W/V)氫氧化鈉溶液稱取10. Og氫氧化鈉，加入IOOml的蒸餾水中即可；(2)、第一次冷凍干燥量取0. 4ml步驟(1)中所得的1%(ν/ν)戊二醛溶液，并加入到IOOml步驟(1)中的溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液中，攪拌5min后，將攪拌后的溶液涂抹到模具上，靜置過夜，然后將溶液注入模具中進行冷凍干燥，得到含有氯化銨的殼聚糖支架； 上述的冷凍干燥過程控制 預凍溫度為_75°C，預凍時間為30min ； 一次干燥的隔板溫度為_25°C，時間為Mh ；(3)、第二次冷凍干燥將步驟(2)中所得的含有氯化銨的殼聚糖支架浸泡到10% (W/V)氫氧化鈉溶液中，浸泡20min后，用去離子水反復清洗支架3次，用5%的硼氫化鈉除去游離的戊二醛，再用大量的去離子水洗滌后得到殼聚糖支架，再對所得的殼聚糖支架進行冷凍干燥，最終得到多孔殼聚糖支架；上述的冷凍干燥過程控制 預凍溫度為_60°C，預凍時間為35min ； 一次干燥的隔板溫度為-20°C，時間為17h ； 二次干燥的隔板溫度為10°C，時間為1. 5-池。
3.如權利要求1或2所述的一種多孔殼聚糖支架的制備方法，其特征在于所用的殼聚糖脫乙酰度為80-91%。
4.如權利要求3所述的一種多孔殼聚糖支架的制備方法，其特征在于所得到的多孔殼聚糖支架孔徑為20-60 UOi，孔隙率為90%。
5.如權利要求1或2所述的一種多孔殼聚糖支架的制備方法，其特征在于所得到的多孔殼聚糖支架用于細胞培養的技術研究。
全文摘要
本發明公開了一種多孔殼聚糖支架的制備方法，它是以殼聚糖為原料，以氯化銨為致孔劑，即先配制溶有氯化銨的殼聚糖酸溶液，將該溶液注入模具中進行第一次冷凍干燥得到含有氯化銨的殼聚糖支架，然后將其浸泡在氫氧化鈉溶液中20min，用蒸餾水清洗3次后得到殼聚糖支架，最后將其進行第二次冷凍干燥，即可得到多孔殼聚糖支架。所得到的多孔殼聚糖支架，孔徑為20-60，孔隙率為90%，孔與孔之間的連通性好，其制備方法操作簡單，工藝簡捷，得到的多孔殼聚糖支架可用于細胞培養的技術研究。
文檔編號C12N5/02GK102492648SQ20121000057
公開日2012年6月13日 申請日期2012年1月4日 優先權日2012年1月4日
發明者劉寶林, 李琳, 李維杰, 韓寶三 申請人:上海理工大學