專利名稱：西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征致病位點pcr-rflp檢測方法
西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征致病位點PCR-RFLP檢測方法技術領域
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征(AQ致病位點PCR-RFLP檢測方法。
背景技術：
家畜遺傳缺陷多呈現隱性遺傳模式的原因可能與家畜的生產方式不無關系， 尤其是奶牛。人工授精(Artificial Insemination, Al)及精液低溫凍存技術(Semen Cryopreservation Techniques)在奶牛生產繁育中的應用，為奶牛的人工授精育種體系 (Al breeding system)的建立奠定了堅實基礎。公牛因AI技術可承擔更多母畜配種任務， 因而可以被廣泛應用于群體當中，獲得大量后代，使得高產的基因在群體中迅速傳播。精液低溫保存技術使優秀種用公牛不受時間和地域限制，實現全球范圍內遺傳物質的交流(張沅，2001)。經嚴格遺傳評定的驗證公牛(Tested Bulls)在奶牛遺傳改良中發揮巨大的推動作用。
人工授精技術的廣泛應用使全世界種質資源交換日益頻繁。對種公牛的高強度選擇，使奶牛基因庫縮小，群體平均近交系數大大增加。有研究表明，美國荷斯坦牛的群體近交系數以每年0. 的速度持續增長，2004年出生的母牛平均群體近交系數高達5. 0% (Hansen等，200 。近交導致群體有效大小減小，一些不利基因的純和，尤其是隱性基因控制的遺傳缺陷，由于攜帶者表現正常，不易通過常規臨床檢測方法檢出，致病基因“潛伏”在群體中很難被剔除。只有當群體中隱性突變基因頻率達到一定程度時，臨床陽性的個體大量出現，帶來不利影響和經濟損失。如荷斯坦牛的Weaver綜合征(單雪松等，2006)、白細胞粘附缺陷病(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD)(孫藝等，2006)、脊椎畸形綜合征(Complex VertebralMalformation, CVM) (Chu 等，2008)等。因而，尋找隱性缺陷病的致病突變，對致病突變建立準確快速的分子檢測方法，注重對有害基因的識別與淘汰是奶牛育種工作的重要任務之一。
綜上所述，動物遺傳缺陷的致病基因研究是遺傳學的重要組成部分。在家畜育種工作中，建立快速有效的動物遺傳缺陷致病位點的分子檢測方法，對種用動物、進口的遺傳種質、甚至某些發病群體全群進行致病位點檢測，對攜帶致病基因的個體進行標記或淘汰， 降低遺傳缺陷在動物群體中的傳播與蔓延帶來的經濟損失。
自1975年，Rieck和khade首次報道了德系西門塔爾牛群體中出現的一種新的犢牛先天畸形，并定名為牛蜘蛛腿綜合征(AS)。Buitkamp等Q008)年報道了自2004 年-2007年，絕跡三十多年的AS病例又在西門塔爾牛中重新出現，并且相繼報道了大量的病例；系譜分析及后期測交試驗證實了該病在德系西門塔爾牛群體中是屬于常染色體單位點控制的隱性遺傳缺陷。Buitkamp等Q009)將德系西門塔爾牛AS致病基因定位于BTA23。 Buitkamp等QOl 1)年對AS的精細定位及群體檢測證實M0CS1基因c. 1224_1225delCA突變為西門塔爾牛AS的致病突變。但是，到目前為止，還沒有一種適合商業操作的西門塔爾牛AS致病位點快速準確的檢測方法。本發明需要解決的問題即根據目前的研究進展，設計一種快速準備，成本低廉的檢測方法，以進行商業化試劑盒的生產。
商業化遺傳病檢測試劑盒的生產對我國的畜牧業蓬勃發展意義重大。隨著中國奶牛雜交生產以及肉牛改良工作的開展，大量從國外，包括德國在內，引進西門塔爾優秀種公牛和公牛凍精，其中存在AS攜帶者。為了防患于未然，杜絕AS疾病給我國牛業帶來不必要的損失，早發現、早淘汰是最好的途徑。通過建立快速準確的攜帶者分子檢測平臺，完善我國牛遺傳缺陷數據庫，同時結合系譜分析，對引進西門塔爾牛以及現有群體中攜帶者的后代進行篩查，及時淘汰攜帶者，對我國奶業和肉牛業的發展都具有非常重要的意義。
PCR-RFLP(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)方法是在RFLP技術(Botstein等，1980)基礎上結合PCR技術發展起來的。PCR-RFLP技術首先對目的片段進行PCR擴增，將PCR產物經限制性內切酶消化，致病等位基因產生與正常等位基因酶切產物不同長度片段，通過電泳區分基因型。
PCR-RFLP技術由于其共顯性、成本低、快速簡便的特點，在動物遺傳缺陷檢測方面有著廣泛的應用。Schober等(1993)和^Awenger等(1993)，發現了牛尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPQ由UMPS基因的外顯子5密碼子405處發生(C — T)點突變，使編碼精氨酸的密碼子由(CGA)變為終止密碼子(TGA)，這一突變導致DNA序列Ava I酶切位點消失，建立了 PCR-RFLP檢測方法，可對突變型和野生型基因型進行分型，可進而檢測奶牛攜帶DUMPS突變位點情況。牛瓜氨酸血癥(CN)由編碼精氨酸琥珀酸合成酶 (ArgininosuccinateSynthase, ASS)的基因ASS單堿基突變(C — T)，引起精氨酸密碼子 CGA轉變為終止密碼子TGA引發(Grupe等，1996)。Healy等(1990)，使用限制性內切酶Ava II區分正常與突變等位基因，建立PCR-RLFP方法。Shuster等(1992)年發現牛白細胞粘附缺陷癥(BLAD)由⑶18基因編碼區的第383位發生A — G的突變，導致1 為天冬氨酸(D) 被甘氨酸(G)代替，并首先建立PCR-RFLP檢測方法，對牛的該致病位點攜帶情況進行檢測。 Tammen 等(1996)、Kriegesmann 等(1997)和孫藝 O006)分別針對該位點進行了 PCR-RFLP 方法的改進，建立了穩定的BLAD致病位點檢測方法。發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征(AS) 致病位點PCR-RFLP檢測方法。
本研究通過NEB cutterV2. 0分析，發現存在MOCSl基因C. dell224_1225CA突變位點的等位基因由于2bp的缺失導致DraIII內切酶酶切位點消失，DraIII內切酶識別位點如圖1所示。因而，DraIII內切酶可以進行缺失等位基因和野生型等位基因的酶切分型， 野生型等位基因經酶切消化后產生412bp和217bp片段；雜合基因型產生629bp、412bp和 217bp片段；突變型純合子產生629bp的片段。由于酶切片段相差明顯，本研究使用2%瓊脂糖凝膠可以區分正常野生型等位基因和突變等位基因。使用PCR-RFLP方法可以準確區分致病和正常的等位基因，與測序結果一致。
為了實現本發明目的，本發明的一種西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征(AS)致病位點 PCR-RFLP檢測用引物，其核苷酸序列如下
5，-ATGAAGGGACAGAGTGGTCGT-3，，
5 ’ -CGTGGGTCAGTTGGTCAGAGT-3’。
本發明還提供含有上述引物的檢測試劑盒，其還包括DNA裂解液、陰性模板和/ 或陽性模板。
本發明進一步提供利用上述引物檢測西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征的方法，所用引物為權利要求1所述引物，或所用試劑盒為權利要求2或3所述的試劑盒，其包括以下步驟
1)目的基因的擴增
以西門塔爾牛組織細胞DNA為模板，進行PCR反應，回收PCR擴增產物；
2)核酸內切酶酶切PCR擴增產物；
3)酶切產物的RFLP分型。
所述PCR擴增條件優選為95°C預變性5min，然后95°C變性30s、60°C退火30s、 72°C延伸30s，共35個循環，72°C最終延伸IOmin。
所述引物用量為1. 5 μ L，引物的終濃度為10 μ Μ。
所述核酸內切酶優選為DraIII內切酶。
DraIII內切酶采用15 μ L的酶切體系，各組分體系如下PCR產物，8 μ L ;ΝΕΒ buffer3,1. 5μ L ；100XBSA，0. 15μ L ；內切酶，0. 35 μ L ；ddH20,5y L0 酶切體系各組分添加相應體積后，蓋好蓋子，混勻，離心。酶切反應條件為，37°C下孵育13小時。酶切反應結束后，使用2%的瓊脂糖凝膠進行PCR酶切產物分型。酶切應該保證PCR產物濃度的一致性和酶切時間的優化，保證野生純型等位基因在酶切位點被全部切開。
本發明還提供了上述所述方法在牛抗病育種中的應用。
該檢測方法是在證實MOCSl基因的c. dell224_1225CA位點為西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征(AQ致病位點的基礎上，結合PCR-RFLP法，即聚合酶鏈式反應-限制片段長度多態法，設計的一種快速準確遺傳致病基因檢測的方法。對牛AS致病突變位點準確有效的分子檢測方法的建立，目的在于篩選出我國牛群中的突變攜帶者個體，進行不利基因的篩查和剔除，對我國進口的西門塔爾牛種用動物及遺傳物質(冷凍精液，胚胎等)進行檢測，防止 AS在我國牛群中的傳播，對我國西門塔爾牛及相關雜交品種的遺傳改良提供保障。
本發明利用PCR-RFLP技術，對西門塔爾牛AS致病位點進行分型的試劑盒結果穩定，成本低，準確可靠，能夠快速準確篩查出AS致病位點攜帶個體。
圖1為本發明DraIII內切酶識別位點；
圖2為本發明牛凍精基因組瓊脂糖檢測結果；
圖3為本發明牛血液基因組瓊脂糖檢測結果；
圖4為本發明牛耳組織基因組瓊脂糖檢測結果；
圖5為本發明多重PCR反應程序；
圖6為本發明MOCSl基因c. dell224_1225CA突變PCR產物2%凝膠檢測；
圖7為本發明ROMEL及其兩個后代測序結果；
圖8為本發明MOCSl基因c. dell224_1225CA位點酶切示意圖9為本發明MOCSl基因c. dell224_1225CA突變位點PCR-RFLP結果。
圖8中a為野生型純合子，b為雜合型，c為突變型純合子。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的保護范圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例1試驗材料的準備和DNA的提取
本研究采用的試驗材料來自兩個部分4頭德系西門塔爾公牛家系中的與配母牛和雜交后代抗凝血樣及耳組織樣；11個牛品種或品系的公牛管制凍精。
4個德系西門塔爾公牛家系(表1)，包括80頭與配母牛及106頭后代，分別來自中國鞍山恒利奶牛場(鞍山恒利)和內蒙古海拉爾市謝爾塔拉三河牛種牛場(海拉爾謝爾塔拉)。4個家系中，母牛品種為中國荷斯坦牛和中國三河牛，后代均為雜交牛(荷斯坦X 德系西門塔爾雜交牛、三河牛X德系西門塔爾雜交牛)。其中4頭德系西門塔爾公牛分別為 ROMEL、BOSSAG, RIFURT, HIRMER(德國西門塔爾牛系譜查詢網站http://www. zar. at/ article/archive/18981)。ROMEL為已知AS致病基因攜帶者，其他3頭公牛均為不攜帶AS 致病基因的正常個體。
表14頭德系西門塔爾公牛家系信息
與配母牛數雜交后代數公牛家系樣品類型采集地點 _OU_OU_
權利要求
1.一種西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征致病位點PCR-RFLP檢測用引物，其核苷酸序列如下5’ -ATGAAGGGACAGAGTGGTCGT-3’，5’ -CGTGGGTCAGTTGGTCAGAGT-3’。
2.含權利要求1所述引物的檢測試劑盒。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，其還包括DNA裂解液、陰性模板和/或陽性模板。
4.一種檢測西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征致病位點的方法，其特征在于，所用引物為權利要求1所述引物，或所用試劑盒為權利要求2或3所述的試劑盒，其具體包括以下步驟1)目的基因的擴增以西門塔爾牛組織細胞DNA為模板，進行PCR反應，回收PCR擴增產物；2)核酸內切酶酶切PCR擴增產物；3)酶切產物的RFLP分型。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增條件為95°C預變性5min，然后 95°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸30s，共；35個循環，72°C最終延伸IOmin。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物用量為1.5 μ L，引物的終濃度為 10 μ Μ。
7.如權利要求4 6任意一項所述的方法，其特征在于，所述核酸內切酶為Dralll。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，DraIII內切酶采用15yL的酶切體系，各組分體系如下屮0 產物，8口1^ ； NEB buffer3,1. 5μ L ； 100XBSA，0. 15μ L ；內切酶，0. 35 μ L ； ddH20, 5 μ L0
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，酶切反應條件為37°C下孵育13小時。
10.權利要求4 9任意一項所述方法在牛抗病育種中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種西門塔爾牛蜘蛛腿綜合征致病位點PCR-RFLP檢測用引物，其核苷酸序列如下5’-ATGAAGGGACAGAGTGGTCGT-3；5’-CGTGGGTCAGTTGGTCAGAGT-3’。本發明利用PCR-RFLP技術，對西門塔爾牛AS致病位點進行分型的試劑盒結果穩定，成本低，準確可靠，對西門塔爾牛AS致病位點可以進行準確的分型。
文檔編號C12Q1/68GK102533998SQ20121000119
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月4日 優先權日2012年1月4日
發明者俞英, 初芹, 孫東曉, 張毅, 張沅, 張勝利, 焦士會, 王雅春 申請人:中國農業大學