專利名稱：充質干細胞及提取方法在制備多發性硬化癥藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及充質干細胞在制備具有免疫調節功能的藥物中的應用，特別是皮膚間充質干細胞(skin-derived Mesenchymal Stem Cells)在制備多發性硬化癥的藥物中的應用。
背景技術：
多發性硬化癥(multiple sclerosis)是一種發生于中樞神經系統(腦部以及脊髓)的慢性、炎癥性、自體免疫疾病，其特征是在中樞神經系統中異常神經退行病變(neurodegeneration)引發以T細胞、B細胞、抗原提呈細胞為主的炎癥細胞浸潤,從而導致多處的神經出現脫髓鞘(demyelination)現象，并在髓鞘組織修復的過程中，沿著軸突受損硬化。多發性硬化癥的確切發病原因還不清楚，環境因子(諸如感染、外傷等)和遺傳因子等綜合因素決定了個體的易感性，患者可能出現行動不便、視力受損、疼痛等神經功能殘缺癥狀(Hauser and Oksenberg, 2006)。多發性硬化癥目前尚無根治的藥物，IFN-β和glatiramer acetate為常見的治療復發型多發性硬化癥(relapsing-remitting multiple sclerosis)的第一線藥物，一般認為此兩種藥物能抑制炎癥T細胞免疫應答，然而其作用機理尚不明確，也僅能達到適度舒緩疾病復發的機率(Hauser and Oksenberg, 2006)。另一種用于治療嚴重多發性硬化癥患者的藥物為Natalizumab，它的作用機理是透過抑制致病性淋巴細胞表面所表達的細胞黏附分子α 4整合素，達到阻止淋巴細胞遷移至中樞神經系統的效果(Hauser andOksenberg, 2006)。雖然Natalizumab有較好的療效，由于淋巴細胞在機體正常免疫反應中不可缺少，沒有選擇性地阻擋淋巴細胞遷移至中樞神經系統導致極高比例的病患在接受治療后產生腦部感染癥狀(M artin, 2010)。此外，抗體類藥物生產成本高、價格昂貴、普通病人很難能承受。多發性硬化癥為導致神經功能殘缺的最主要的疾病之一，全球有上千萬人患病，患者的日常生活往往受到嚴重牽連。基于這一點，自主研究開發高效且低副作用的新療法勢在必行。充質干細胞(mesenchymal stem cell)是一種未分化、能自我增生、且能分化成多種間充質組織細胞的多能性細胞(Pittenger et al.，1999)。早期，間充質干細胞多從骨髓中取得，骨髓間充質干細胞具有抑制免疫應答和誘導外周免疫耐受的特質(Xu et al.,2007)，曾被應用于抑制骨髓移植時所導致的移植體對宿主排斥反應(graft-versus-hostdisease, GVHD) (Le Blanc et al.，2004)。除了骨髓以外，間充質干細胞也存在于其他成體組織中。不同于骨髓間充質干細胞，在皮膚真皮層中的間充質干細胞，除了能分化成中胚層(mesodermal)相關組織細胞(如脂肪細胞、平滑肌細胞)，還具有分化成神經細胞、造血細胞、肝細胞等多種非中胚層組織細胞的特性，因此在臨床上有極大的應用價值(Sellheyerand Krahl, 2010)。由于大量的皮膚樣本較骨髓易于取得，從皮膚樣本提取治療用間充質干細胞實屬可行性高、用途廣、侵入性小、且具經濟效益的選擇。
然而，皮膚間充質干細胞的免疫調節功能目前尚未被發現。本發明提供一種透過皮膚間充質干細胞在炎癥環境中有選擇地抑制致病性效應T細胞應答，促使神經細胞再生而達到治療效果的多發性硬化癥細胞療法，并根據此法制備具有免疫調節功能的藥物的應用特別是制備治療多發性硬化癥的藥物的應用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種充質干細胞在制備具有免疫調節功能的藥物中的應用，以及相關充質干細胞的提取方法:
充質干細胞在制備治療具有免疫調節功能的藥物中的應用。充質干細胞在制備治療多發性硬化癥的藥物中的應用。所述的充質干細胞在制備治療具有免疫調節功能的藥物中的應用，其中所述的充質干細胞來源于皮膚真皮層中。所述的充質干細胞在制備治療多發性硬化癥的藥物中的應用，其中所述的充質干細胞來源于皮膚真皮層中。所述的應用中所述的充質干細胞通過下列方法提取:剪取背部皮膚置于dispase酶中，使用PBS液清洗，剝去表皮，將真皮置于膠原酶中消化，完成后再添加DNase I消化，再用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液并過濾，接種于培養皿中，棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼續培養，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規傳代。
從小鼠皮膚真皮中分離得到真皮間充質干細胞:取新生小鼠，處死后剪取背部皮膚置于dispase酶中，使用 PBS液清洗，剝去表皮，將真皮置于膠原酶中消化，完成后再添加DNase I消化，再用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液并過濾，接種于培養皿中，棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼續培養，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規傳代，取傳至第三代的細胞進行研究。對其進行鑒定:將體外培養的真皮間充質干細胞胰酶消化后接種于不同的分化誘導體系中，培養后經行組織染色，鑒定分化情況。向成骨細胞分化通過茜素紅染色；向脂肪細胞分化通過形態學觀察和油紅染色(圖1)。觀察到從小鼠皮膚真皮層中提取的皮膚間充質干細胞具有免疫調節的特性，在體外培養時能有效抑制效應T細胞免疫應答(圖2):用細胞標記物標記免疫磁珠分離的小鼠T細胞，與皮膚間充質干細胞共培養；在共培養中用抗體刺激T細胞。標記過的細胞的分裂增殖情況可以被流式細胞儀檢測，這個實驗說明了和骨髓間充質干細胞一樣同體皮膚間充質干細胞均可以在體外抑制抗體刺激下的T細胞分裂增殖。測試皮膚間充質干細胞對多發性硬化癥的治療效果實驗中，將皮膚間充質干細胞注入一種在組織學、免疫學、多基因特性和治療反應性上與人類多發性硬化癥極為相似的 experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)小鼠體內,EAE 小鼠在皮膚間充質干細胞治療30天后被基本治愈(圖3)。
本發明有益效果:充質干細胞在炎癥環境中有選擇地抑制致病性效應T細胞應答并誘導調節性T細胞發生而達到治療效果。本發明公開的皮膚間充質干細胞取得容易、不具免疫排斥性、能夠在炎癥環境中特異抑制致病性效應T細胞應答、促使神經細胞再生、療效好、治療后疾病不易復發而副作用小。
圖1:小鼠真皮間充質干細胞的分離鑒定:
A，體外培養的真皮間充質干細胞；
B，真皮間充質干細胞的成骨誘導分化；
C，真皮間充質干細胞的成脂誘導分化。_
圖2:小鼠的同體皮膚間充質干細胞抑制效應T細胞免疫應答:
A,同體骨髓間充質干細胞(autologous bone marrow mesenchymal stem cells)與 T細共培養3天，有11.5% T細胞分裂增殖；
B，同體皮膚間充質干細胞(autologous skin-derived mesenchymal stem cells)與T細共培養3天，有19.6% T細胞分裂增殖；
D,T細胞單獨培養有85.0%的分裂增殖；
E,沒有用ant1-⑶3和ant1-⑶28抗體刺激的T細胞幾乎沒有分裂增值。這個預備實驗說明了和骨髓間充質干細胞一樣同體皮膚間充質干細胞均可以在體外抑制抗體刺激下的T細胞分裂增殖。圖3:小鼠同體皮膚間充質干細胞對小鼠的EAE的治療效果明顯:
淺色點狀線條:同 體皮膚間充質干細胞治療小鼠EAE30天的評分；
深色點狀線條:只注射PBS的對照小鼠EAE30天的評分。采用5分評分法，EAE評分標準如下:0分為不發病；1分為尾巴無力；2分為輕微后肢無力；3分為嚴重后肢癱瘓；4分為四肢癱瘓；5分為瀕臨死亡或死亡。
具體實施例方式1.小鼠真皮間充質干細胞的分離
取出生3天左右的新生小鼠，引頸處死，酒精消毒，剪取背部皮膚置于0.25%的dispase酶中，4°C消化過夜，PBS液清洗3次，剝去表皮，將真皮置于0.2%的膠原酶中消化一個小時，消化完成后再添加DNase I消化10到15分鐘，用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液，過濾除去大塊組織和碎片，接種于培養皿中，培養條件為DMEM (low glucose)+10%胎牛血清，370C，5%C02。培養6小時后，輕輕棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼續培養，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規傳代。取傳至第三代的細胞進行研究。2.小鼠真皮間充質干細胞的鑒定
將體外培養的真皮間充質干細胞胰酶消化后接種于不同的分化誘導體系中，培養3周后經行組織染色，鑒定分化情況。向成骨細胞分化通過茜素紅染色；向脂肪細胞分化通過形態學觀察和油紅染色。3.小鼠的皮膚間充質干細胞抑制效應T細胞免疫應答；
用細胞標記物CFSE來標記免疫磁珠分離的小鼠CD4+CD25— T細胞，與皮膚間充質干細胞共培養(皮膚間充質干細胞=T細胞為1:4);在共培養中用ant1-CD3和anti_CD28抗體刺激T細胞3天。CFSE標記過的細胞的分裂增殖情況可以被流式細胞儀檢測。
4.小鼠皮膚間充質干細胞對小鼠EAE的治療；
首先是建立EAE模型，在不完全弗氏佐劑中加入熱滅活結核分枝桿菌，即為完全弗氏佐劑，M0G35-55配成終濃度10mg/ml。小鼠分別于背側中線兩側2點皮下注射由M0G35-55與CFA按1:1混合乳化抗原。免疫當天及第二天給小鼠尾靜脈注射百日咳毒素200ng/只，誘導小鼠產生EAE。運用一定的方法分離從小鼠皮膚真皮中分離間充質干細胞，培養至P3代。每只患病小鼠尾靜脈注射Γ IO6個皮膚間充質干細胞，觀察30天且每天評分。5.皮膚間充質干細胞對人類多發性硬化癥患者的治療。從人的皮膚中分離出皮膚間充質干細胞，無菌環境下培養至P3代。每位患者靜脈注射5(T IO6個皮膚間充質 干細胞進行治療。
權利要求
1.充質干細胞在制備治療具有免疫調節功能的藥物中的應用。
2.充質干細胞在制備治療多發性硬化癥的藥物中的應用。
3.權利要求1所述的充質干細胞在制備治療具有免疫調節功能的藥物中的應用，其中所述的充質干細胞來源于皮膚真皮層中。
4.權利要求2所述的充質干細胞在制備治療多發性硬化癥的藥物中的應用，其中所述的充質干細胞來源于皮膚真皮層中。
5.權利要求3或4所述的應用，其中所述的充質干細胞通過下列方法提取:剪取背部皮膚置于dispase酶中，使用PBS液清洗，剝去表皮，將真皮置于膠原酶中消化，完成后再添加DNase I消化，再用PBS洗一遍，用滴管吹打成單細胞懸液并過濾,接種于培養皿中，棄去懸浮細胞，將貼壁細胞繼 續培養，待長滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規傳代。
全文摘要
本發明的目的在于提供充質干細胞在制備具有治療多發性硬化癥的藥物中的應用，充質干細胞能夠有效地抑制多發性硬化癥患者在中樞神經系統內過度活化的效應T細胞免疫應答，誘導具特異性功能的調節性T細胞發生，分化成新的神經細胞，從而修補受損的神經組織而治療發性硬化癥患。這種應用中涉及的皮膚間充質干細胞取得容易、不具免疫排斥性、療效高、治療后疾病不易復發而副作用小的有益效果。
文檔編號C12N5/0775GK103191155SQ201210002750
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者王宏林 申請人:上海交通大學醫學院